小議生物反應(yīng)器在軟骨組織的研究進度

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生物反應(yīng)器可以控制和監(jiān)測培養(yǎng)條件（如pH值、溫度、壓力、營養(yǎng)供應(yīng)、廢物清除等），是用來進行生物反應(yīng)或生化反應(yīng)的動態(tài)三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置[3]。與二維或靜態(tài)培養(yǎng)方法相比，生物反應(yīng)器具有諸多優(yōu)勢：①細(xì)胞培養(yǎng)周期短，無需多次換液；②通過各種機械刺激可增強種子細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)以緊密結(jié)合細(xì)胞支架；③生物反應(yīng)器中形成的三維組織工程器官在各個方向上受力均勻，可減少傳代擴增引起的細(xì)胞表型缺失[4]，增強抗壓力負(fù)荷性能[5]。

1生物反應(yīng)器中的生物物理因素

1.1氧濃度

氧氣是軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素，人關(guān)節(jié)軟骨外表面所受的氧分壓為7%～10%，關(guān)節(jié)內(nèi)層軟骨中的氧分壓約為1%[6]。間質(zhì)來源的軟骨祖細(xì)胞凝集形成間質(zhì)始基標(biāo)志著軟骨形成的開始，而該過程需要在一個相對低氧環(huán)境中進行。因此，氧氣在軟骨形成中的作用成為了研究熱點。研究表明，當(dāng)組織工程軟骨處于低氧環(huán)境下，其表現(xiàn)的生化特性與自體軟骨類似[7-9]。Meyer等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在豬MSCs向軟骨分化過程中，低氧濃度是比動態(tài)壓力更有效的促分化劑。Schrobback等[11]深入研究了低氧濃度促進軟骨生成的機制，即常氧狀態(tài)下，低氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxiainduciblefactor2α，HIF-2α）亞基在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達，而HIF-1α亞基在翻譯后即被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶水解復(fù)合體降解，因此在正常氧飽和度下的細(xì)胞中基本檢測不到HIF-1α亞基的表達；而在低氧狀態(tài)下，HIF-1α亞基降解被抑制，1α和2α亞基形成有活性的HIF-1，HIF-1則轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。Terkhorn等[12]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境（5%）可促進HIF-3α基因表達，而HIF-3α的作用是抑制HIF-1α和HIF-2α的表達水平，使得HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、HIF-1處于穩(wěn)定的高表達反饋調(diào)節(jié)平衡。綜上研究，低氧濃度有利于軟骨細(xì)胞分化、增強細(xì)胞活性已達成共識，且在該環(huán)境中，細(xì)胞的濕重和軟骨生成基因表達均顯著增加。但影響MSCs轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞及增殖的相關(guān)因素復(fù)雜，在生物反應(yīng)器中促軟骨形成的最適氧濃度仍需進一步研究。

1.2靜水壓

有學(xué)者認(rèn)為，軟骨承受著由人體日?；顒赢a(chǎn)生的間歇性靜水壓，如在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中引入靜水壓及其他一些機械載量，可能會增加體外組織工程軟骨的基質(zhì)合成[13]。關(guān)節(jié)軟骨承受的相關(guān)機械載量中，靜水壓是最重要的載量[14]。Ogawa等[15]通過對軟骨在靜水壓0～0.5MPa、0.5Hz和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓環(huán)境下的組織學(xué)、免疫組織學(xué)、基因表達特性進行比較，發(fā)現(xiàn)靜水壓組聚集細(xì)胞基質(zhì)的速度更快，細(xì)胞衰老變緩，而且在培養(yǎng)2周后軟骨特有基因表達明顯增強。因此，他們認(rèn)為靜水壓既可增強細(xì)胞基質(zhì)積累，又可刺激軟骨特有基因表達。但該實驗未進一步研究最適靜水壓。有研究提出，7～10MPa的間歇性靜水壓是組織工程軟骨體外培養(yǎng)的理想靜水壓[13，16]。同時，靜水壓越大，氧分壓越大，嚴(yán)格控制靜水壓即可影響氧分壓，進而改變氧濃度[13]，間接影響軟骨細(xì)胞的分化及增殖。但較高壓力會降低培養(yǎng)液中CO2濃度，也會影響細(xì)胞生長。Jeong等[17]設(shè)計了一種電腦控制式反應(yīng)器測定間歇性靜水壓對BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的影響，實驗分為5組：0.2MPa組、0.1MPa組、0.05MPa組、0.02MPa組、空白對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1MPa靜水壓作用明顯，0.2MPa其次。目前，理想的靜水壓數(shù)值尚未達成一致，綜合前述研究，以0.1MPa間歇性靜水壓對BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的作用效果最為理想。

1.3壓縮力

Takahashi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)壓縮力可以促進軟骨生成和分化。學(xué)者們進一步研究發(fā)現(xiàn)，動態(tài)壓縮力促進軟骨生成效果較靜態(tài)壓縮力更顯著[19-21]；而且在BMSCs培養(yǎng)中，動態(tài)壓縮力使得軟骨分化標(biāo)記物表達更多[22-24]。這與關(guān)節(jié)軟骨日常功能一致，因關(guān)節(jié)軟骨日常活動時產(chǎn)生的即是動態(tài)壓縮力。Huang等[25]研究表明，兔BMSCs-瓊脂糖復(fù)合體形變壓縮（4h/d、10%壓縮強度、1Hz）后，在存在與不存在TGF-β1的條件下Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達均明顯增強，此外TGF-β1受體在壓縮1h后明顯上調(diào)，也進一步促進了TGF-β1的軟骨化誘導(dǎo)作用。Richardson等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在3h/d、10%壓縮強度、1Hz的壓縮條件下，培養(yǎng)第5天可見到BMSCs復(fù)合體中氨基聚糖含量增加。而類似研究也發(fā)現(xiàn)，4h/d加載后的氨基聚糖含量顯著高于2h/d的加載方式[24-25]。表明蛋白聚糖基因的表達隨著載荷時間增加而增強[23]。Hoenig等[27]評估了不同動態(tài)壓縮強度（5%、10%、20%壓縮強度，3000r/d，1Hz）對種植了原代豬軟骨細(xì)胞的脫細(xì)胞支架的短期影響，結(jié)果顯示20%壓縮強度對軟骨機械性能的影響最強，提示接受更高負(fù)荷強度預(yù)處理的組織工程軟骨更堅硬、更符合臨床要求。但該研究結(jié)果缺少更大壓縮強度實驗結(jié)果，尚不能說明20%壓縮強度以上（如30%、40%等）情況下得到的軟骨是否仍滿足臨床要求或性能下降，均需進一步研究。孫明林等[28]進一步研究了10%～30%壓縮強度下獲得的組織工程軟骨性能，發(fā)現(xiàn)在0.4Hz、20%壓縮強度、3h滾壓時間的滾壓參數(shù)下，BMSCs能更好地向軟骨細(xì)胞分化以及維持軟骨細(xì)胞表型。Huang等[29]研究認(rèn)為，在生物反應(yīng)器中持續(xù)應(yīng)用動態(tài)壓縮力將改善BMSCs來源的軟骨結(jié)構(gòu)機械性能。Thorpe等[30]觀察了TGF培養(yǎng)條件下，動態(tài)壓縮力對BMSCs軟骨生成的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)42d后樣本中蛋白聚糖、黏多糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達比單純動態(tài)壓縮力培養(yǎng)下更高。

1.4剪切負(fù)荷

不同類型生物反應(yīng)器中，剪切力大小各不相同。如攪拌式反應(yīng)器系統(tǒng)和直接灌流式反應(yīng)器系統(tǒng)中為高剪切力，旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器系統(tǒng)中為低剪切力[13]。由于剪切力對軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有顯著影響，了解剪切力類型至關(guān)重要。如高剪切力用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)會產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎特性表達，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)氧化酶2、前列腺素和IL-6[31-32]。還有研究發(fā)現(xiàn)高剪切力可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)釋放，使得軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌減少，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[33]。謝甲琦等[34]研究了剪切力對MSCs的作用，發(fā)現(xiàn)適度的剪切力（3dyn/cm2）可以促進MSCs生長，過低的剪切力（1dyn/cm2）對MSCs生長無明顯影響，過高的剪切力（>8dyn/cm2）則抑制MSCs生長并加速細(xì)胞死亡。同時，他們首次提出了對MSCs進行增加剪切力訓(xùn)練的概念，即漸進性增加的剪切力比恒定高剪切力更容易被細(xì)胞耐受，使細(xì)胞活力增強、存活比例增加、促進細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。該研究也為生物反應(yīng)器中剪應(yīng)力的標(biāo)準(zhǔn)化提供了重要依據(jù)。對于軟骨組織工程生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的剪切力最適值目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可選擇初始值為3dyn/cm2，漸進性增加至8dyn/cm2，以增強軟骨細(xì)胞對較高剪切力的適應(yīng)能力和細(xì)胞活性，有利于細(xì)胞增殖，但尚需進一步研究明確。

2展望

綜上述，在軟骨組織工程生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，其生物物理因素的最適參數(shù)可能不是固定值，而是一個隨著種子細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖而動態(tài)變化的漸變性參數(shù)。隨著組織工程研究的深入、自動化計算機技術(shù)以及材料技術(shù)的提高，可實現(xiàn)對生物反應(yīng)器生物物理因素的精確動態(tài)控制，建立即時控制反饋系統(tǒng)，選擇最優(yōu)調(diào)控方案。未來生物反應(yīng)器發(fā)展的方向必須遵循工程化原則，規(guī)范質(zhì)量監(jiān)控、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化和生產(chǎn)過程及組織工程器官的安全性[35]，實現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

作者：葉鋼章方彪史宏燦單位：揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院胸外科