基因重組

前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇基因重組范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發現更多的寫作思路和靈感。

基因重組范文第1篇

關鍵詞：基因突變；基因重組

中圖分類號：G632 文獻標識碼：B 文章編號：1002-7661（2013）33-151-01

一、教材內容

本章內容既是對前四章內容合乎邏輯的延續，又是學習第六章《從雜交育種到基因工程》和第七章《現代生物進化理論》的重要基礎。學好這節課有助于學生更好地理解“誘變育種”和 “基因突變是新基因產生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進化的原始材料” 。所以在知識上它起到了承上啟下的作用，這決定了本節內容的重要性。

二、三維目標

知識目標：掌握基因重組的本質和特點，會辨別不同情況下的基因重組。

能力目標：借助類比活動揭示基因結構改變的類型、原因，提高學生判斷、推理等能力。

情感目標：通過生物變異的事例，增強學生對生物世界的好奇心。引領學生自主合作探究.

三、重點難點

（1）重點：基因突變的類型、原因、概念、特點。（2）難點：基因突變的意義。

四、教學方法

（1）針對基因重組，選擇的教學模式為：借助孟德爾的實驗Ⅱ設置問題情境，引導學生對提出的問題進行探究―觀察現象―分析探索―得出結論。實現由舊知到新知的躍遷。

（2）針對基因突變，選擇的教學模式為：借助類比活動：全班同學抄寫黑板上5位司機的身份證號統計抄錯的原因？增添、缺失、替換，結果？

五、課前準備

教師準備：一個堿基序列為ATGGCATGT產生了大量的基因，其中絕大多數基因的堿基序列是正常，但偶爾也產生了如下4種新基因.如果這四種新基因也能正常表達，試寫出它們轉錄和翻譯的產物。

學生準備：1、做好相應的知識準備（減數分裂、DNA結構和復制、中心法則、孟德爾遺傳規律的相關內容） 2、提前完成課前熱身題小組長準備：（要求組長提前完成統計工作，上課要做為材料要進行類比活動）

六、課時安排：1課時

七、教學過程 （打開多媒體展示素材）

情景一：

（1）姐妹皮膚的白與黑，油菜籽粒飽滿的種子與普通種子相比，太空椒與普通青椒相比，性狀有明顯的差異，原因何在？

（2）把子粒大而飽滿的種子種下去長不出同樣好的種子，而是普通種子；把肥大的太空青椒籽種下去可以結出肥大的青椒。這些現象說明什么問題？

（3）從上述可以看出生物的變異有幾種類型？思維訓練：“由環境引起的變異都是不可遺傳的變異”，對嗎？

【小結】可遺傳的變異是生物變異的主要類型。它的來源主要由三個方面：基因突變、基因重組和染色體變異。？

情景二：孟德爾的兩對相對性狀的雜交實驗的現象：

小組討論：1、F1自交得到的F2代出現了幾種性狀表現？比例分別是多少？ 2、F2代中與親代有什么不同的表現型？3、從性狀來看，變異的概率是多少？4、這種變異產生的原因是什么？

情景三：請分析：1.同源染色體上的非等位基因在什么時期重新組合？有哪些組合情況？ 2.非同源染色體上的非等位基因在什么時期重新組合？有哪些組合情況？ 3.基因重組的結果是什么？它能產生新基因嗎？ 4. 人的體細胞中有23對染色體，請你根據自由組合定律計算，一位父親可能產生多少種染色體組成不同的，一位母親可能產生多少子種染色體組成不同的卵細胞？如何理解人群中個體性狀是多種多樣的？

師生總結：“基因重組”的概念、時間、結果、意義。 “基因重組是可遺傳變異來源之一”

情景四：基因突變實例-鐮刀型細胞貧血癥病因的圖解。

學生嘗試：結合鐮刀型細胞貧血癥的實例，嘗試總結基因突變的概念，進一步理解 “基因突變產生新基因，基因突變也是產生可遺傳變異的來源之一”。教師總結：基因突變如果發生在配子中，將會遺傳給后代，發生在體細胞中的基因突變，一般是不能夠遺傳的。發生在植物體細胞中的基因突變，如何能夠遺傳？指導學生閱讀：教材中有關基因突變原因的內容。

情景五：癌細胞是體細胞發生基因突變的結果，在生活中有什么因素容易引發癌癥，從而發生基因突變呢？即癌基因突變的具體原因（外因？內因？）

情景六： 資料①正常人紅綠色盲病②？人的正常人細胞癌細胞③普通羊短腿羊 ④果蠅的紅眼白眼⑤果蠅長翅殘翅⑥小麥的有芒無芒⑦低產青霉高產青霉 。

小組活動：結合投影資料1、2能分析出基因突變有什么特點？

教師小結：即基因突變是新基因產生的途徑，是生物變異的根本來源

學生填表：比較基因突變和基因重組

八、教學反思

適當改變了課本內容的呈現順序：先講基因重組發生的時期、特點，再講基因突變的類型、原因、概念、特點和意義，在知識上實現了由舊知到新知的躍遷，有利于學生對知識的理解和掌握。在共同探究概念、動手體驗、合作交流部分注意時間的分配，一定要給學生留夠觀察、閱讀、思考、分析、合作的時間。教師不要獨霸課堂，真正落實學生為主體，教師為主導的理念。

基因重組范文第2篇

關鍵詞：重組腺病毒；山羊SKIP基因；基因過表達；感染細胞

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先發現并分離，在動物各組織中廣泛表達，尤其在心臟骨骼肌和腎臟中高表達，因此SKIP被稱為骨骼肌和腎臟富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鑒定為通過水解PI（3，4，5）P3為PI（3，4）P2而調控胰島素信號的5′-脂質磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信號在成肌分化進程中有重要作用[2-4]。SKIP雜合突變小鼠比目魚肌和股四頭肌的質量顯著提高[5]也提示SKIP具有調節骨骼肌纖維發育的功能。因此有必要進一步研究該基因在體內外參與骨骼肌生長發育的調控機制。本試驗采用基因工程技術，成功構建了SKIP基因重組腺病毒，為下一步在體內外研究SKIP對成肌分化的作用機制以及SKIP基因的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達載體pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2購自長沙贏潤生物技術有限公司；腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST、LR重組酶、DMEM培養液及新生牛血清購自Invitrogen公司。限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；CloneEZ試劑盒購自Genescript公司；質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker購自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨購自Oxide公司；腺病毒包裝細胞HEK293購自美國ATCC；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設計、合成及PCR擴增 應用Primer5.0軟件設計引物，在上、下游引物5′端分別引入用于定向克隆的限制性酶切位點KpnⅠ、XhoⅠ，同時在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增強基因表達。提取山羊體細胞RNA反轉錄成cDNA為模板擴增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否出現預期中的SKIP基因帶。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP質粒的構建 將pcDNA3.1（+）和兩端帶酶切位點的SKIP基因分別以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，分別回收的線性化pcDNA3.1（+）質粒和SKIP cDN段以定向克隆的方式用T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α，挑選菌落擴增，小量提取質粒后以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，若電泳后得到1.3 kb和5.4 kb兩個片段，則證明SKIP cDNA已插入到真核表達載體pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切穿梭載體pYr-adshuttle-2和重組表達載體pcDNA3.1（+）-SKIP，凝膠電泳回收線性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA連接酶連接過夜，反應產物轉化大腸桿菌DH5α。次日挑取卡那霉素選擇性培養基篩選的陽性克隆子進行菌落PCR鑒定；提取質粒進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；同時送陽性菌落到北京奧科生物公司測序。

1.2.4 采用LR體外同源重組將SKIP表達框克隆至腺病毒表達載體pAd/PL-DEST 在10 μL LR體外同源重組反應體系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。將充分反應后得到的反應產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒溫箱培養過夜。接著再次從每個培養皿上隨機挑取若干個單克隆菌落接種于50 mL含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB培養液中，37 ℃恒溫搖床（250 r/min）培養過夜。用中量提取試劑盒提取質粒，對提取的質粒進行PCR驗證XbaⅠ酶切鑒定。

1.2.5 重組腺病毒pAd-SKIP的包裝 HEK293A細胞的準備：提前12～24 h將1 mL HEK293A細胞懸液（1.5×106 個細胞/mL）接種在培養皿中，轉染前1 h換成無血清的DMEM培養基250 μL。

轉染HEK293 A細胞包裝病毒：用脂質體2000介導，由PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉染HEK293 A細胞。當有明顯的細胞病態反應（CPE）現象，且有>50%脫壁時即收細胞，加入500 μL無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37 ℃間快速反復凍融3次裂解細胞，室溫下1 000 r/min離心15 min，沉淀細胞碎屑。將上清液再次感染HEK 293 A細胞擴增病毒，直至細胞在1周內有明顯的CPE現象，且有>50%脫壁時即收細胞。同樣用無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37℃間快速反復凍融3次裂解細胞，室溫下1 000 r/min 離心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存。并進行PCR鑒定。

1.2.6 測定重組腺病毒滴度 取純化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃熱浴30 min后，渦旋3次，離心后測定病毒基因組DNA的OD260 nm和OD280 nm，據此計算病毒的顆粒數和純度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明純度較高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀釋度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12細胞 將C2C12細胞（1×106個細胞/mL）接種于12孔板，每孔1 mL，12 h后將培養液吸出，各孔分別加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常規培養48 h后，在倒置熒光顯微鏡下分別用可見光和熒光觀察、成像。

2 結果與分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鑒定結果

用KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，PCR擴增SKIP基因的正反向引物分別帶有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。將含有插入方向正確的SKIP cDNA的重組pcDNA3.1（+）-SKIP經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切產生大小分別為1.3 kb和5.4 kb的片段（圖1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重組鑒定結果

將SKIP基因連接入pYr-adshuttle-2載體，陽性克隆經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，pYr-adshuttle-2載體大小為4 470 bp，SKIP基因大小約為1 350 bp，由酶切結果（圖2）可知，該克隆為正確克隆。將酶切鑒定正確的pYr-adshuttle-2-SKIP送去測序。并將測序結果與欲得到的目的序列相比對，顯示獲得的SKIP基因片段序列完全正確，證實pYr-adshuttle-2-SKIP構建成功。

2.3 重組腺病毒載體pAd-SKIP的鑒定

將SKIP基因表達框采用LR體外重組技術克隆至表達載體pAd/PL-DEST，陽性克隆經XbaⅠ單酶切鑒定，可切出一條約550 bp和一條約2.3 kb的條帶，且大帶大于8 kb（實際有3條大帶，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很難分開，所以看上去就是一條粗帶）。由圖3結果可以初步判斷pAd-SKIP構建成功。接著以質粒pAd-SKIP為模板，設計引物擴增SKIP片段，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖4。由圖4可見，PCR擴增出的片段大小與SKIP基因片段大小一致，證實pAd-SKIP載體構建成功。

2.4 重組腺病毒rAd-SKIP的產生和PCR鑒定

將PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉染HEK293A，當細胞有明顯的CPE現象，且有>50%脫壁時即收細胞進行裂解收病毒。提取腺病毒基因組DNA，以之為模板進行PCR反應。引物用載體上自帶的CMV和BGH引物驗證。由PCR鑒定結果（圖4）可知，用載體上自帶的引物擴增出與SKIP基因長度同樣大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相關表達框都在。證實rAd-SKIP包裝成功。

2.5 重組腺病毒對成肌細胞C2C12的感染

用不同MOI的重組腺病毒感染C2C12細胞，當MOI為150時，超過80%的細胞出現熒光（圖5），表明所構建的重組腺病毒生物活性高，可以有效地轉導目的基因表達。

3 小結與討論

SKIP是調節PI3K-Akt信號通路的關鍵5′肌醇磷酸酶。在肌源細胞中，血清饑餓可誘導IGF2自分泌。IGF2與IGF1受體互作，激活PI3K，產生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到細胞膜上激活Akt（蛋白激酶B），接著激活成肌基因的轉錄[5]。因此PI3K-Akt信號與成肌分化緊密相關。近年來，一些新的信號通路、分泌因子和信號分子不斷被發現能調控PI3K-Akt信號。如肌醇磷酸酶SKIP，它通過水解PI3K合成的脂質第二信使PI-3，4，5-P3，參與Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否調控PI3K-Akt信號介導的成肌分化仍有待研究。

基因的過表達是研究基因功能的重要手段之一，將外源基因有效地導入靶細胞表達是后續研究的先決條件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重組病毒表達系統之一，可用于在哺乳動物細胞中瞬時及高水平地表達目的蛋白。具備宿主范圍廣，不依賴細胞周期，病毒滴度高，有較好的生物安全性等優點[9]。腺病毒表達系統中的難點主要在于如何將外源基因表達框或者外源的shRNA表達框構建至腺病毒骨架載體上。由于腺病毒骨架載體比較大（～30 kb），而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個，如果用常規的酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達框構建至腺病毒骨架載體上，則成功率很低，因此，目前的腺病毒表達系統基本上都是用同源重組的方法將外源基因構建至腺病毒骨架載體上。

本試驗采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表達系統和Gateway 技術，與市面上其他腺病毒表達系統往往利用大腸桿菌或者293細胞自身的同源重組系統不同，即利用LR 重組酶進行體外重組。與當前其他腺病毒表達系統相比，這種體外重組更加方便、快速，重組效率更高。在本研究中，構建了含山羊SKIP基因的腺病毒載體，并且經酶切鑒定分析和PCR結果證實SKIP重組病毒構建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12細胞，表達能有效介導基因轉染，為下一步證實SKIP對骨骼肌細胞成肌分化的調控等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] IJUIN T， MOCHIZUKI Y， FUKAMI K， et al. Identification and characterization of a novel inositol polyphosphate 5-phosphatase[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275（15）：10870-10875.

[2] TURECKOVA J， WILSON E， CAPPALONGA J， et al. Insulin-like growth factor-mediated muscle differentiation collaboration between phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-signaling pathways and myogenin[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（42）：39264-39270.

[3] GONZALEZ I， TRIPATHI G，CARTER E， et al. Akt2， a novel functional link between p38 mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in myogenesis[J]. Molecular and Cellular Biology，2004，24（9）： 3607-3622.

[4] CENNI V， SIRRI A， RICCIO M， et al. Targeting of the Akt/PKB kinase to the actin skeleton[J]. Cell Mol Life Sci，2003， 60（12）： 2710-2720.

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[6] IJUIN T， TAKENAWA T. Regulation of insulin signalling and glucose transporter 4（GLUT4） exocytosis by the phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate （PIP3） phosphatase， SKIP[J]. J Biol Chem，2012，287（10）：6991-6999.

[7] MANNING B D， CANTLEY L C. AKT/PKB signaling： navigating downstream[J]. Cell， 2007，129（7）：1261-1274.

基因重組范文第3篇

【摘要】 目的 構建鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通過體外細胞轉染獲得單一來源、基因序列清楚的體內實驗的感染毒種。方法 以湖北麻鴨DHBV分離株（DQ276978）為模板，用PCR法從該DHBV全基因組克隆質粒（pMD-DHBV）和DHBV陽性血清中獲取3部分基因片段，總長44kb，克隆至載體PCR21的SacI和NotI酶切位點，構建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質粒，并酶切鑒定其插入方向。將構建的重組質粒經脂質體LipofectineTM 2000導入雞肝癌細胞系(LMH)細胞中轉染表達，收集純化后的轉染細胞培養上清液作為體內實驗感染的標準毒種。結果 PCR鑒定、酶切鑒定及序列測定，證實成功獲得正向插入的1.5倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot檢測表明，該重組質粒在LMH細胞內存在各種病毒復制中間體；通過電鏡觀察，轉染細胞上清液中存在DHBV完整病毒顆粒。結論 經體外重組，構建出攜帶1.5倍加長DHBV基因組片段的重組質粒PCR21-DHBV15，并可在雞肝癌細胞LMH中介導高水平病毒復制，從而獲得含可自我復制病毒顆粒的轉染細胞上清液作為動物體內感染接種物。

【關鍵詞】 鴨乙型肝炎病毒

鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與人類乙型肝炎病毒（HBV）同屬嗜肝DNA病毒科，它們在形態結構、基因序列、病毒復制、致病機制及感染宿主規律等方面均較為相似，DHBV感染鴨模型使人們認識了嗜肝病毒的復制周期以及病毒持續存在和病毒徹底清除的機制。我們在對湖北麻鴨DHBV自然感染率調查的基礎上，選擇對DHBV易感且取材方便的湖北麻鴨作為實驗鴨種，并分離出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。進而以該毒株為模板，構建了15倍DHBV全基因重組質粒，通過該質粒在雞肝癌細胞系(LMH)中穩定轉染表達出含有可自我復制的病毒顆粒的細胞培養上清液作為單一來源、基因序列清楚的實驗毒種，以期建立標準化的湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內模型。另外，將該DHBV重組質粒與不同劑量人類載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表達質粒共轉染LMH細胞，通過抑制實驗以證實該DHBV體外實驗模型的初步應用。

1 材料與方法

11 材料

111 質粒 pMD-DHBV為本實驗室構建的含有湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA全長基因組的質粒；pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBV DNA重組質粒，該克隆質粒(美國 Mandart 教授饋贈)；APOBEC3G真核表達質粒為本實驗室構建保存；PCR21載體(美國Invitrogen公司)。

112 DHBV陽性血清 取自擴增出DHBV DNA全長基因組（DQ276978）的陽性血清。

113 細胞 禽類雞肝癌細胞系LMH，為本室傳代保存。

114 工具酶 LA Taq酶、限制性內切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝膠回收試劑盒(大連 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美國Promega公司)；T4DNA連接酶(美國GIBICO公司)。

115 生化及其它試劑 地高辛(DIG)標記及檢測試劑盒(德國Roche公司)；Waymouth 細胞培養基(美國Sigma公司)；LipofectineTM2000(美國Invitrogen公司)。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒(德國QIAGEN公司)；質粒提取試劑盒和動物培養細胞基因組DNA純化試劑盒(大連TaKR公司)。

12 方法 通過對湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA的全長克隆質粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕，已明確其基因組的結構及與復制相關的重要元件的序列位置，在此基礎上運用3片法構建出能自我復制的重組質粒。

121 構建質粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；設計引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經PCR擴增DHBV陽性血清獲得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。將上述3片段插入PCR21的相應酶切位點后即得到15倍DHBV全基因重組質粒PCR21-DHBV15。

122 PCR鑒定 引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2為DHBV基因S區和C區的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反應液組成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加滅菌純水至50μl。PCR循環參數：94℃5min；94℃50s，61℃45s，72℃50s，40個循環；72℃10min。

123 酶切鑒定 用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分別進行酶切鑒定。

124 序列測定 取一株陽性克隆質粒送上海生物工程技術服務公司測序。

125 脂質體LipofectineTM2000介導的DNA轉染 在LMH細胞達到80%～90%融合時進行轉染，設未轉染LMH細胞對照和pSP65-DHBV16質粒對照。

126 蛋白印跡(Southern Blot)分析 提取轉染LMH細胞內總DNA后，用DIG標記的DHBV全長基因組探針雜交，X-ray膠片發光顯影。

127 轉染細胞上清液中病毒顆粒電鏡觀察 收集轉染細胞的上清液，離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解沉淀，將該沉淀溶解物通過磷鎢酸負染法進行電鏡觀察。

128 APOBEC3G真核表達質粒對DHBV的抑制效應實驗 質粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達質粒pXF3G-HA通過LipofectamineTM2000共同轉染LMH細胞，72h后收集細胞。

2 結果

21 重組質粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定 重組質粒PCR21-DHBV15經不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2擴增后可產生依次為211，452，1 430和1 600的目的片段（圖1）。

22 重組質粒PCR21-DHBV15的酶切鑒定 未酶切的重組質粒PCR21-DHBV15為84kb；用SacI和EcoRI雙酶切該重組質粒可產生29和55kb的片段；該重組質粒經BamHI限制性內切酶消化后產生31和53kb的目的片段；用NotI和EcoRI雙酶切PCR21-DHBV15可產生16和68kb的片段；用SacI和BamHI限制性內切酶消化該重組質粒后則產生16和68kb的目的片段。上述酶切結果均與預期相符（圖2）。

23 轉染細胞上清液中DHBV病毒顆粒的檢測 在轉染細胞上清液中檢出大量直徑為30～65nm的球形顆粒，其中一種為大小較均一，直徑為40～50nm的實心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒顆粒；另一種是直徑為30～65nm的類球形空心病毒，中央凹陷，未見絲狀、管狀體，即病毒表面抗原顆粒（圖3）。

24 轉染細胞內DHBV DNA的檢測 分別將pSP65-DHBV16和PCR21-DHBV15轉染LMH細胞，72h后收集細胞，提取DNA進行Southernblot檢測。結果顯示，重組質粒PCR21-DHBV15與雙拷貝DHBV全長基因組質粒pSP65-DHBV16一樣，均在轉染細胞中檢出大量DHBV DNA復制中間體（圖4）。

M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2

圖1 重組質粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定（略）

M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der

圖2 重組質粒PCP2.1-DHBV1.5的酶切鑒定（略）

25 APOBEC3G對DHBV核衣殼相關DNA水平具有劑量依賴的抑制效應 重組質粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達質粒pXF3G-HA共同轉染LMH細胞，轉染后Southern blot檢測細胞內的DHBV核衣殼相關DNA的結果顯示，APOBEC3G對轉染細胞內DHBV核衣殼相關DNA水平具有劑量依賴的抑制效應（圖5）。

圖3 重組質粒PCR21-DHBV15轉染細胞上清液(×60000)（略）

1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：松弛環狀DNA；L：線性DNA；SS：單鏈DNA

圖4 Southern blot 檢測轉細胞內DBBV復制水平（略）

PCR21-DHBV1.5(μg)

20 20 20

pX F3G-HA (μg)

- 20 40

pXF3H(μg)

40 20 -

pXF3H：真核表達載體；

pXF3H-HA：APOBEC3G真核表達質粒

圖5 APOBE3G對細胞內DHBV核衣殼相關DNA水平的抑制（略）

3 討論

在HBV己證實，構建13倍加長或頭尾相接雙拷貝的基因組，可以產生所有HBV轉錄子，并啟動HBV的復制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有類似的結果〔3〕。LMH是DHBV穩定表達細胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的復制，并能分泌完整病毒顆粒。本實驗通過對湖北麻鴨DHBV分離株(DQ276978)的DNA全長基因組核苷酸水平和氨基酸水平的序列分析研究〔1〕，成功構建了15倍加長DHBV基因組重組質粒，經PCR鑒定、酶切鑒定以及序列測定均證明所構建的重組體與預期相符，包含能高效自我啟動DHBV復制的全部元件。核酸水平研究和電鏡觀察也證實該重組質粒能夠在LMH細胞中利用DHBV固有的增強子和啟動子進 行有效復制、轉錄及表達，由此也證明所構建的重組體可以用于體內基因免疫，為其后建立鴨體內實驗感染標準化模型提供實驗依據。另外，我們進一步用本實驗室構建的APOBEC3G真核表達質粒和PCR21-DHBV15重組質粒共同轉染LMH細胞系進行抑制實驗以證實該DHBV體外實驗模型的初步應用。APOBEC3G是一種天然免疫分子，具有抗病毒感染的效應〔6，7〕。實驗結果顯示，APOBEC3G能明顯降低DHBV核衣殼相關DNA的水平，并且顯示出劑量依賴性，表明APOBEC3G也可能非特異性地抑制DHBV復制，但其作用機制尚待進一步研究。

【參考文獻】

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基因重組范文第4篇

【關鍵詞】 肝炎病毒

關鍵詞 :肝炎病毒，乙型;聚合酶鏈反應;腺病毒科 中圖號:Q74 文獻標識碼:A

0 引言

乙型肝炎是一種常見傳染病，危害極大.我們通過PCR及基因重組技術將adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原HB-sAg基因克隆到腺病毒穿梭載體，構建了重組HBsAg腺病毒穿梭載體，為制備HBsAg腺病毒疫苗的研制打下了基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

模板pⅡ1.2（含HBV adr亞型全基因序列）根據《分子克隆》的操作，采用堿裂解法大量制備質粒pⅡ1.2，紫外分光光度法定量.PCR引物的設計用于擴增HBV S區基因的引物，由上海生工公司合成，序列:For:cgtcta-gagggaacaagagctacagcatg.Rev:cgtctagataagggaatagccccaacg 1.2 方法 根據ExpandTM High Fidelity PCR System

（寶靈曼公司）操作說明進行PCR擴增，反應體系:pⅡ1.2100ng，HBsFor及Rev300nmol?L

-1 ，dNTP200mol?L-1 ，總反應體積50μL.循環參數如下:94℃2min;94℃，15s;56℃，30s;68℃，1min;循環30次，72℃，7min.Klenow酶（Promega公司）補平PCR片段，KpnⅠ/HindⅢ（華美公司）雙酶切，用T4DNA連接酶（Promega公司）將酶切片段克隆入pUC18載體的相同酶切位點，連接產物轉化感受態E.coli JM109，挑單菌落擴增，各取2μL菌液進行PCR反應，并提取質粒用KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，重組質粒命名為pUC/HBs.任選一陽性克隆提取質粒進行DNA自動測序.將KpnⅠ/HindⅢ雙酶切pUC/HBs所得片段按上述方法亞克隆入pAdCMV載體，轉化感受態E.coli JM109，PCR法及KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，重組質粒命名為pAdCMV/HBs.

2 結果

經PCR反應擴增出HBV S區基因片斷大小約1250bp.隨機挑5個轉化菌單菌落擴增，其中4個轉化菌PCR反應及酶切鑒定同時陽性.隨機挑4個轉化菌單菌落擴增，4個轉化菌PCR反應及酶切鑒定皆陽性.

基因重組范文第5篇

關鍵詞：uPA；GFP；腺相關病毒載體；基因轉染

中圖分類號：Q786　文獻標識碼：A　文章編號：1007－7847(2007)03－0242－06

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA還可通過激活纖溶酶及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA激活肝細胞生長因子間接對損傷腎臟起保護作用，因此uPA在降解ECM、逆轉纖維化方面起重要作用，腎臟纖維化的病理改變主要是腎小球硬化和，腎小管間質纖維化，是腎臟ECM合成與降解失衡，導致ECM過度積聚的結果，因此，我們設想采用高效表達載體-腺相關病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體，將uPA基因全長序列轉移到有纖維化病變的部位，以增強病變局部uPA的表達，發揮其降解ECM的作用，從而緩解腎纖維化的進程，為臨床治療腎臟纖維化提供理論基礎。

1　材料和方法

1．1　材料

AAV Helper-Free System(#240071)、pAAV-IRES-hrGFP(#240075)、AAV-293細胞(#240073)和XL10-Gold感受態細菌(#200314)購自美國Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)購自美國invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)購自美國Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)購自美國Fermen-tas MBI公司，限制性核酸內切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)購自美國NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)購自中國長沙安比奧公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技術有限公司合成，測序由上海生工生物技術有限公司完成，兔抗Flag M2抗體(F1804-200UG)購自美國Sigma公司，2周齡SD雄性大鼠購自中南大學湘雅二醫院動物實驗中心，腎小管上皮細胞由中南大學湘雅二醫院小兒腎臟病研究室保存。

1．2　方法

1．2．1　大鼠腎臟uPA基因的獲得

取Spragoc-Dawleg 2周齡雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取腎臟總mRNA，逆轉錄合成eD-NA第一鏈，PCR法特異擴增uPA cDNA，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，uPA cDNA為1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切產物，置pH8.0 TE緩沖液中，uPA cDNA-20℃保存。

1．2．2　pGEM-T-uPA重組質粒的構建

將uPA cDNA用T4 DNA ligase連接到pGEM-T Easy載體上，并轉染到JM 109感受態細菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃恒溫箱倒置培養14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長勢良好的白色菌落6個，分別接種于3mLLB培養液內(Amp)，于37℃搖床內培養14h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit說明書提取質粒，得到pGEM-T-uPA重組質粒，將重組質粒用BamHI/Xho I雙酶切后，證實含相應的uPA基因片斷，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片斷，-20℃保存。

1．2．3　pAAV-hrGFP-uPA重組質粒的構建

將上一步驟中獲得的uPA基因片段用T4DNA ligase連接到pAAV-IRES-hrGFP質粒的多克隆位點，并轉染到XL 10-Gold感受態細菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃溫箱倒置培養14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長勢良好的白色菌落6個，分別接種于3mL LB培養液內(Amp)，于37℃搖床內振搖培養14～16h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit說明書提取質粒，得到DAAV-hrGFP-uPA重組質粒，將重組質粒用BamH I/Xho I雙酶切后，證實含uPA基因片斷，DAAV-hrGFP-uPA重組質粒送檢測序，準備足夠的pAAV-hrGFP-uPA重組質粒和其他兩個輔助質粒oAAV-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超純質粒，供下一步轉染實驗。

1．2．4　AAV-293細胞培養

AAV-293細胞來源于普通的HEK293細胞系，但是可以產生較高的病毒滴度，HEK293是轉染了腺病毒5型DNA的人胚胎腎細胞，AAV-293細胞在含10％胎牛血清的DMEM培養基中生長，AAV-293細胞貼壁不牢，輕吹大瓶壁即可傳代，在細胞達到50％融合時傳代，且傳代不宜超過20代，同時注意傳代和接種時不要讓細胞

成塊。

1．2．5　pAAV-hrGFP-uPA的產生及鑒定

接種3×106個AAV-293細胞于100mm培養皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培養基，培養2d細胞達到70％～80％融合時，吸取每個質粒溶液pAAV-hrGFP-uPA質粒、pAAV-RC和pHelper(濃度均為1g/L)各10μg加入到15mL柱狀試管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，輕輕混勻，加入1mL 2×HBS于另一柱狀試管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反復吹打混勻，以點滴方式加入DNA/CaCl2/HBS懸液于AAV-293細胞的培養皿中，旋轉均勻分散該DNA懸液，將培養皿放人37℃的培養箱中培養6h，培養結束后，添加10mL新鮮的含10％胎牛血清的DMEM培養基，繼續在37℃培養箱中培養72h，培養結束后，收集培養基和細胞于15mL的柱狀試管中，經過4次冰凍和解凍(37℃)循環，每次持續10min，然后于室溫中離心(10000g)10min，轉移上清(初病毒儲存液)于另一新的試管中置-80℃保存，Buffer TE代替質粒作陰性對照，轉染后48h倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達，以確定轉染成功；轉染后72h收集病毒顆粒，并將獲得的病毒顆粒再次感染AAV-293細胞，以確定其感染能力。

1．2．6　病毒載體的純化與滴度測定

對重組的pAAV-hrGFP-uPA用親和層析、離子交換層析和分子篩層析進行純化：純化后用斑點雜交方法檢測重組病毒的滴度；利用高壓液相層析(HPLC)法檢測重組病毒的純度，具體方法參照文獻。

1．2．7　uPA基因轉染腎小管細胞及其表達的測定

按每孔1.5×105個腎小管細胞接種于12孔培養平板中，培養細胞達到70％融合，每孔添加終濃度為4mol/L羥基脲和1mol/L丁酸納，混勻后，放人培養箱中繼續培養5～6h，吸出培養基，加入1.5mL預溫的含20％小牛血清的DMEM/F12培養基和相應的病毒存儲液0.5mL，繼續培養48h，培養結束后。倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達，uPA基因的表達以Flag標記蛋白進行免疫組化染色來判斷，一抗為兔抗Flag M2抗體(1:200)，二抗為生物素化的羊抗兔抗體，加SABC孵育后進行DAB顯色。

2　結果

2．1　uPA cDN段的獲得

用RT-PCR法擴增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，瓊脂糖凝膠電泳證實所得到的基因片段是正確的(圖1)。

2．2 pAAV-hrGFP-uPA重組質粒的酶切鑒定

pAAV-hrGFP-uPA重組質粒經BamH I/Xho I雙酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAAV-hrGFP-uPA重組質粒的構建正確(圖2)。

2．3　pAAV，hrGFP-uPA重組質粒DNA序列分析

證實pAAV-hrGFP-uPA序列完全正確，無堿基突變。

2．4　pAAV-hrGFP-uPA的產生

分別取 pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper質粒各10μg，經磷酸鈣沉淀法共轉染AAV-293細胞2～3d，Buffer TE代替質粒轉染細胞作陰性對照，陰性對照平皿中AAV-293細胞長滿后有少量細胞漂浮，但平皿上一直布滿細胞，培養基變成桔黃色，提示陰性對照沒有病毒顆粒產生，轉染質粒的AAV-293細胞逐漸聚集成團并漂離平皿，培養基中有大量漂浮細胞，培養基的顏色由桔黃色變為黃色，細胞腫脹、變圓，將質粒轉染組在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細胞呈綠色，表明轉染成功(圖3、4)。

2．5　uPA基因轉染腎小管上皮細胞及其表達

AAV-293細胞產生的病毒顆粒轉染腎小管上皮細胞，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察約60％～70％的腎小管上皮細胞表達綠色熒光蛋白，免疫組化法觀察到腎小管上皮細胞可有效表達flag蛋白，細胞質中具有較多的棕黃色顆粒，陰性對照組均沒有綠色熒光蛋白和flag蛋白的表達(圖5、6)。

3 討論

腎小球硬化和腎間質纖維化歸根結底是腎臟ECM合成與降解失衡導致ECM過度積聚的結果，目前已知參與ECM降解的酶主要有3類：1)絲氨酸蛋白酶；2)基質金屬蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前兩類，uPA屬于絲氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形態發生、組織修復和腫瘤浸潤，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA還能切斷纖溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸序列中的精氨酸-纈氨酸連接，催化無活性的纖溶酶原轉變為纖溶酶，uPA對纖溶酶原的激活是一個正反饋逐級放大效應，纖溶酶是一廣譜蛋白酶，能夠降解存在于基底膜和，ECM的各種糖蛋白包括血纖維蛋白、粘連蛋白、層連蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，進而溶解血管內的纖維蛋白凝塊和ECM成分，并形成細胞外局部溶解區。構成細胞轉移的通道，有利于新生的內皮細胞遷移、生長進入周圍基質，形成新的微血管；uPA又可激活MMPs，該酶是鋅依賴性內肽酶，是參與基質降解的主要成分；還能激活肝細胞生長因子，肝細胞生長因子是一個有力的抗纖維化因子，對損傷腎臟有保護作用，基因治療器官組織纖維化已成為慢性疾病治療領域的研究熱點，利用各種有效的和組織特異性的載體系統將降解ECM的外源基因導入細胞內，到達纖維化的組織和器官，可緩解纖維化程度，有研究報道腺病毒攜帶人uPA基因可誘導實驗性肝硬化動物模型的肝硬化緩解，uPA促進HGF從基質中釋放并活化，緩解肺纖維化，因此，利用基因轉移技術增強uPA基因的表達可能會大大降解ECM成分，緩解腎臟纖維化。

由于腎臟細胞的有絲分裂指數較低，腎臟基因的轉移效率至今仍不理想，因此，我們以新型的無輔腺相關病毒AAV-2作為載體，采用基因克隆技術，成功構建了攜帶uPA基因和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺相關病毒重組質粒，用來轉移基因，本實驗中所選用的pAAV-IRES-hrGFP質粒作為攜帶目的基因的主要載體，能同時表達目的基因蛋白、GFP和Flag蛋白，質粒中的GFP可作為病毒顆粒轉染細胞成功與否及細胞定位的有效標記，Flag蛋白僅作為標簽提示目的基因蛋白的表達，還可用來分析未知基因表達的情況，腺相關病毒(adeno-asso-ciated virus，AAV)屬微小病毒科，能高效轉染到各種宿主細胞中，AAV作為基因治療載體的優勢主要有：1)AAV是一種人源性的病毒，對人體無

致病性，免疫反應輕微，有利于體內轉染；2)可定點整合至人的19號染色體，并能較穩定的存在，從而避免了其它病毒隨機整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危險；3)AAV攜帶的外源基因可以長期持續穩定表達，并可調控；4)AAV的宿主范圍很廣，包括分裂期和非分裂期的多種細胞：5)具有較好的熱穩定性和抗酸堿性(pH 3.0～9.0)以及抗有機溶劑處理的特點，便于儲存，AAV基因組具有兩個開放的閱讀框架(ORF)，兩端各有1個145bp的末端反向重復序列(ITR)，ORF編碼非結構性蛋白(Rep)和衣殼蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、復制、包裝中起重要作用，Cap蛋白是包裝成完整病毒所需的衣殼蛋白，因此，重組AAV載體(rAAV)是用外源目的基因單位(包括啟動子)替換AAV兩端ITR系列之間的基因系列(Rep和Cap基因)而產生，傳統制備rAAV載體包裝系統主要包括：重組載體、輔助質粒(如Ad8)、輔助病毒(如Ad5)和宿主細胞，該方法的缺點是可導致腺病毒蛋白的污染，容易導致機體對載體的免疫反應，各項研究通過改造AAV載體基因結構、包裝細胞以及改進病毒顆粒的純化方法，可達到更高的病毒產率，rAAV載體經過不斷改進和完善，已經克服了容量小和解決無腺病毒輔助的大量包裝和復制問題：近年來又由于包裝細胞系的誕生，加上其固有的優點，因而成為治療遺傳性疾病和慢性疾病最有前途的基因載體。

本實驗在培養的腎小管上皮細胞中直接觀察到GFP的表達，提示病毒顆粒成功轉染細胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在腎小管細胞中表達，大約有60％～70％的腎小管細胞可感染此病毒顆粒，并整合到腎小管細胞中穩定、高效表達，Flag蛋白的表達反應了uPA蛋白表達的情況，GFP可在450-490nm的藍光激發下發出綠光，GFP的多肽中含有絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸的環化結構，使GFP具有強烈的熒光性，GFP作為一種基因表達的標記物優于傳統的報告基因，如LacZ、CAT、luc等編碼酶蛋白的基因，GFP優點在于：1)GFP基因序列短、分子質量小、融合后不影響目的基因的表達和靶蛋白生理功能，不干擾細胞的生長和功能，且對細胞無毒性作用，因而能在活細胞狀態下檢測基因表達；2)觀察更為方便，GFP是一種能在活細胞內直接觀測、無需底物和內對照的報告基因，將GFP基因轉染至真核細胞中表達后，可以方便地通過觀察活細胞中GFP融合蛋白的綠色熒光分布，分析未知基因表達蛋白在細胞中的分布和定位，因此GFP作為一種極具潛力的標記物為研究基因功能及表達調控提供了極大的便利。

本實驗成功構建了高效轉染多種宿主細胞的重組載體質粒，為今后建立AAV-μPA基因治療的體內腎纖維化模型奠定了良好的基礎，并且為無特殊標記細胞移植治療提供了一種穩定、有效的標記方法，可以追蹤該細胞在體內的分布或分化情況。