抱恙在身
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抱恙在身范文第1篇
在《基礎教育課程改革綱要》中明確提出"要使學生具有初步的環境意識"，新課標也強調，"增強對環境、資源的保護意識和法制意識，初步形成可持續發展的觀念，逐步養成關心和愛護環境的行為習慣。因此，在地理教學實踐中，應逐步培養學生的環保意識。
1.充分挖掘現行教材中能夠進行環保意識培養的內容，通過課堂教學使學生獲取環保知識
要講清中學地理教材中有關自然資源的利用和保護的知識。初中地理教材中的世界氣候，自然景觀的地區差異，世界的自然資源和中國的氣候、河流、湖泊，中國自然資源的合理利用和保護，及中國的區域地理差異等知識。教師講授時，不僅要講清楚自然資源的概念，而且要詳細講解有關自然資源的利用和保護的知識。在講授黃河時，要說明黃河及流域概況的知識，同時要指出，黃河所流經的黃土高原在歷史上是一片"草豐林茂，沃野千里的綠洲"，但由于常年毀林開荒，植被遭到嚴重破壞，造成大量的水土流失和生態失調，導致泥沙淤積下游，形成地上"懸河"，給廣大民眾帶來憂患。同時還應著重介紹，解放以來黃河兩岸的人民在黨的領導下，堅持治理改造黃河，化害為利，趨利避害，使晉陜等沿河省區出現了田園似錦、棉麥豐收的喜人景象，生態面貌發生了巨大變化。這樣既體現了愛國主義教育，又進行了具體生動的環境教育，寓環境保護教育于地理課的教學之中。
新的課程標準把環保、人口、可持續發展等，作為高中地理教學的重點，高中地理教材把人類對生活的地理環境、人類活動與地理環境的關系作為核心內容，使學生樹立人與自然協調的可持續發展觀念，培養學生關注和保護環境的意識。因此，通過講解使學生認識到自然資源不是取之不盡，用之不竭的，環境對廢棄物的容納能力是有限的，對資源的無節制掠奪開采，對環境的任意污染與破壞，必然受到自然界的懲罰，通過破壞環境來侵犯他人的利益，危及子孫后代的生存，必將受到社會的譴責，從而明確人對自然的道德責任和義務，樹立"保護環境光榮，破壞環境可恥"的新型社會主義榮辱觀。
2.在課堂上，通過時事和歷史事件讓學生認識到環境污染的危害性
科學技術突飛猛進，人類從自然界提取的資源越來越多，排放的廢棄物也與日俱增，資源消耗過大，生態破壞加劇，已使地球不堪重負，環境污染和生態破壞對人類生存和發展構成了嚴重威脅，在地理課堂上通過時事和歷史事件問題，適時的滲透在地理教學中，使學生進一步了解環境污染對人類生存的影響，窺視環境問題的嚴重性。如： 2003年，在我國發生的非典疫情，它與生態環境的變化存在著內在的、必然的聯系，環境的急劇惡化誘發水生物、野生動物和致病微生物的突變，而濫捕濫殺、食用野生動物的行為使致病微生物傳播到人體，進而危害人類的身體健康。在地理課上通過時事和歷史事件的滲透教學，使學生學到地理知識的同時，還接受到環境教育，通過對這些事件的了解研究，讓學生學會用地理學知識分析、評價這些事件的形成機制、演變過程與對策。
3.嘗試地理教育方式方法的改革，有效培養中學生的環保意識
3.1 通過設計爭議性問題開展討論，培養中學生的環保意識。世界上的事物是復雜的，許多事物的存在既對人類的發展有益，也可能對人類有潛在的危害?？茖W技術是把雙刃劍（如農藥的使用、氟利昂利用的興衰、核能發電等），使學生認識到這點是非常重要的。環境問題的存在往往受多種因素的制約，在不同的地區，不同的時期有不同存在的形式；不同階層的人對同一環境問題也會有不同的看法，因此，在地理教學中設計爭議性問題，組織學生進行多方面的討論，讓他們通過內部矛盾的沖突，深入理解環境問題，提高自身的環保意識。如在講高中地理 "新能源"一節時，設計"要不要發展核電"這一爭議性問題，引導學生進行思考，組織討論。核電站是全世界公眾關注的環境問題焦點之一，有些學生認為核能是一種清潔、廉價、能量密集、地區適應性強、具有巨大發展前景的新能源，應積極發展核電站；另外一些學生則認為前蘇聯切爾諾貝利災難性的核事故固然罕見，但人們不能忽視來自具有很高放射性的核廢料的威脅，應削減或停止核電發展計劃。學生看問題的角度不同，就會產生對核電不同的看法。通過激烈的爭論，其意義遠不止是讓學生知道應該不應該發展核電站。
3.2 重視開放性教學，加強環境教育，培養學生的多方面才能。所謂開放性教學就是指環境教育中利用一些開放性教學材料，這些材料不限于常用的課本，教師不給出固 定格式的結論，而是由教師指導學生通過搜集、閱讀文字資料，實地調查問題現狀等學習活動，使學生自己得出恰當的結論。
3.3 充分利用各種實踐活動，將環境知識轉化為環保意識。環境意識的形成必須依賴于學生的實踐，而且只有在他們的實踐中才能表現出來。如果沒有接觸過協調環境關系有關的活動，那么熱愛環境、保護環境只能是一句空話，所以，在地理教學中必須十分重視理論聯系實際，加強環境教育。
（1）把地理知識與周圍看得見、摸得著的環境緊密聯系起來。如在學習選修五"自然災害"這冊書中，要求學生根據自身的感受，了解我們身邊發生的自然災害，特別是經常影響本地的旱澇，寒潮等災害性天氣，使學生們知道這些主要是由自然原因產生的環境問題，人類只有認識自然規律，趨利避害，按客觀規律辦事，才能收到事半功倍的效果。
（2）結合參觀訪問，增加感性知識，深化理性知識的學習。如在學習工業"三廢"的危害及治理的內容后，帶領學生到中牟縣汽車產業園區考察，參觀工廠的污水處理設備，并聽廠領導的介紹。同學們對工業"三廢 "的治理過程有了清晰的了解，不但獲得環保的技能知識，而且在親身的感受中潛移默化地提高了環保意識。
（3）結合春游，讓學生在大自然中體會環境保護的必要性。如去年我班到中牟縣雁鳴湖景區春游，我就緊緊抓住這個機會，引導學生在觀察中思考討論："雁鳴湖"景區旅游業的現狀、發展與環境保護的關系；建造雁鳴湖休閑度假村的實際意義，為什么政府要花這樣多的資金造這個龐然大物等等。
抱恙在身范文第2篇
環境污染、資源短缺、生態危機等已經成為世界性難題。造成環境污染的因素有很多， 其中化學污染對環境、人類健康和社會發展的危害越來越受到全社會的普遍關注。中學階段是一個人成長和發展的關鍵時期，在中學化學教學中加強對學生環境保護意識的教育，對他們今后走向社會具有潛移默化的作用。因此在中學化學教學中滲透環保意識是每一個中學化學教師義不容辭的責任?；瘜W與環境密切相關，化學中的環境保護素材十分豐富，在化學教學中開展環保教育，有著得天獨厚的優勢。那么，怎樣在化學教學中滲透環保教育呢?
一、在傳授化學知識的過程中滲透環保教育
把化學知識教學與環境保護教育有機結合起來，既能提高學生的環保意識，又能增強學生學習化學的興趣。例如，學習“空氣”時，讓學生了解本來空氣的成分是比較固定的，適合人類和動植物的生存，但近幾百年來，工業污染改變了空氣的組成，從而改變了我們的生態環境。在介紹煤時，讓學生了解煤的組成，煤燃燒時會釋放一氧化碳、二氧化碳、二氧化硫、二氧化氮等，其中一氧化碳是劇毒物質，二氧化碳會引起溫室效應，二氧化硫、二氧化氮會使雨水變酸。在講授水與氫時，讓學生在認識水對于人類生活、工農業生產的重要性和水資源的有限性的基礎上，知道工業廢水、生活污水的任意排放會造成水體污染、水質惡化，以至給人類造成災難。學習水的凈化等知識時，向學生介紹硬水對人體健康、人們生活和工業生產的不利影響，使學生了解硬水軟化的方法和基本原理，學會處理硬水。在二氧化碳的教學中，讓學生了解二氧化碳循環對生態系統的作用，二氧化碳與溫室效應的關系，一氧化碳對空氣的污染，煤氣中毒、吸煙危害健康與一氧化碳毒性的關系及一氧化碳中毒的預防。在介紹氮、磷、鉀等化肥時，既介紹化肥對提高農作物產量的積極作用，又介紹其對農產品、土壤、水體造成的污染。……
二、在化學實驗教學中滲透環保教育
化學實驗教學是實施環境教育的重要途徑。在化學實驗教學中，教師可通過言傳身教，引導和增強學生的環保意識，使學生養成良好的環保習慣。
1、以環保意識備好實驗課。備有關實驗課時，要設計好對學生進行環保教育的內容，以及有關實驗的教學內容和方法，特別是在有毒氣體的實驗中，要做好毒氣泄漏的預防、處理、吸收及停止實驗的方法設計，實驗中廢棄物的處理、回收與再利用的方法設計等。
2、以身作則，規范實驗操作。教師的行為是一種無聲的語言，因此教師以身作則、規范實驗操作對進行環保教育有重要的意義。在實驗教學中，教師要言行一致，做到實驗操作正確規范，尤其是涉及環境教育的實驗。
3、改進實驗，體驗環保。
在不影響實驗結果的前提下改進實驗，盡量減少實驗中有毒或有害物質對人的危害及對環境的污染，既是實驗安全的要求，又有利于對學生進行環境保護教育。例如，可燃物燃燒條件的探究實驗，可將現有儀器改裝成能防毒氣逸出的實驗裝置；又如，氨分子擴散的探究實驗，可以將氨水改為醋酸，將酚酞改為紫色石蕊試液。 轉貼于
4、開展微型實驗，減少環境污染。開展微型實驗是當前國際上化學實驗教學改革的趨勢。這種實驗是用盡可能少的試劑來獲得比較明顯的反應結果和準確的化學信息，實驗中反應物和產物的量都很少，產生的有害物質對環境造成的污染可降到最低程度。如在金屬的化學性質探究實驗中，改在試管中進行的實驗為在點滴板上進行。
三、在豐富多彩的課外活動中開展環保教育
結合化學教學的課外活動既能培養學生理論聯系實際的能力，又能相機開展環境教育。
1、組織學生參觀化工廠。結合課堂知識，帶學生去參觀附近的化工廠，可引導學生用所學的知識去分析車間的生產流程，并提醒學生注意工廠對廢水、廢渣、廢氣的處理。
2、舉辦環?？萍贾R專題講座。結合目前國內外形勢和環境科學的熱點問題，根據學生的知識基礎，可定期給學生舉辦環境保護知識專題講座，如“世界著名的公害事件”、“吸煙與健康”、“溫室效應”、“酸雨的形成與危害”等，在開闊學生視野的同時使學生受到良好的環境教育。
3、指導學生課外閱讀。利用課余時間，可指導學生閱讀與環境知識有關的報紙、雜志和科普讀物，搜集整理有關環境污染與保護的資料，并要求學生做讀書筆記。另外，還可利用學校的黑板報宣傳欄、廣播室、手抄報等多種媒體，大力宣傳環境知識，營造環境教育的良好氛圍，使學生都參與到環?；顒又衼?。
抱恙在身范文第3篇
2006年初，華晨寶馬在中國大陸的本地供應商數量為46家，本地采購額為8.7億元，到2006年底，本地采購額已達20億元。目前，本地供應商數量已經發展到超過60家。預計到2007年底，本地供應商數量將達到100家，本地采購額將增長80%，達到36億元。
華晨寶馬汽車有限公司總裁兼首席執行官吳佩德先生表示：“穩步推進本地化采購進程是華晨寶馬的長期戰略。這不僅僅是為了滿足政府對于國產化率的要求，同時也為了提升我們企業產品的市場競爭力。中國是一個擁有巨大商機的市場，華晨寶馬將繼續遵循高檔品牌戰略，與供應商保持和擴大共贏的合作伙伴關系，在幫助中國的汽車零部件企業走向世界的同時，不斷提高企業的自身實力，努力成為中國高檔轎車市場上的領先企業。”
華晨寶馬的供應商發展戰略建立在三個基石上：寶馬集團的全球供應商在中國的獨資企業、合資企業和中資企業。不管是現有和潛在的合作伙伴，寶馬汽車的供應商必須完全滿足兩個標準：寶馬全球統一的質量標準和全面的競爭力。寶馬集團生產材料采購高級副總裁Klaus Richter博士在向華晨寶馬的供應商介紹寶馬集團全球采購體系時表示,凡是向華晨寶馬供貨的供應商，都有機會進入到寶馬集團全球的采購體系。因為寶馬集團的全球采購系統是一個公開透明的平臺。所有希望進入這個系統的供應商必須在產品質量上達到寶馬全球統一的質量標準，而且要有全面的競爭力。例如，中國的戴卡輪轂制造有限公司馬上就成功地進入寶馬全球采購體系，為BMW 5系提供輪轂。
由于華晨寶馬采用的是寶馬集團全球統一的質量標準，所以，中國大陸的供應商如滿足質量和競爭力兩方面的要求，都將能有機會進入寶馬集團全球采購系統。
豐田任命第一位常駐中國本部長
豐田汽車公司（以下簡稱豐田）于6月22日召開2007年股東大會及董事會議，通過公司重要決議并對公司部分董事成員進行改選任命。
抱恙在身范文第4篇
基金項目：全軍十二?五重點課題（BWS12J018）
作者單位：510010 廣州，南方醫科大學研究生院，廣州總醫院重癥醫學科（劉云松）；南方醫科大學腫瘤研究所（鄧旭斌）；廣州總醫院重癥醫學科（蘇磊）
通信作者：蘇磊， Email：
【摘要】目的 通過觀察熱打擊誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發性增多對神經元細胞凋亡的影響，探討重癥中暑所致腦損害的發病機理。方法 建立神經元細胞熱打擊模型，對照組將細胞置于標準37 ℃、5%CO2細胞培養箱，熱打擊組將細胞置于43 ℃細胞培養箱中熱打擊2 h，熱打擊后繼續37 ℃、5%CO2細胞培養箱孵育，DCFH法檢測熱打擊后0 h、0.5 h、1 h、2 h細胞內ROS含量；Annexin V-FITC/PI雙染色方法和Westen blot檢測熱打擊后0 h、3 h、6 h、12 h細胞凋亡率及caspase-3蛋白表達，同時檢測ROS特異性清除劑MnTMPyP對熱打擊后12 h細胞凋亡的影響。結果 與對照組比較，43 ℃熱打擊后0 h細胞內ROS增加，2 hROS呈爆發性增多（P
【關鍵詞】重癥中暑；腦損害；熱打擊；熱打擊模型；神經元細胞；凋亡；凋亡機制；活性氧
The effect of reactive oxygen species on heat stress-induced neuronal apoptosis Liu Yunsong ， Deng Xubing， Su Lei.Department of Intensive Care Unit， General Hospital of Guangzhou Military Command， Key Laboratory of Tropical Zone Trauma Care and Tissue Repair of PLA， Guangzhou 510010， China
Corresponding author： Su Lei， Email：
【Abstract】Objective To observe the effect of heat stress-induced burst out of reactive oxygen on neuronal apoptosis and investigate pathogenesis of brain damage caused by severe heat stroke. Methods Neurons heat stress model is set up. Control group were incubated at 37 ℃，5%CO2，While heat stress group of cells were incubated at 43 ℃ for 2 h，then all the cells were further incubated at 37 ℃ for different time as indicated.The amounts of ROS were assayed by DCFH staining at 0 h， 0.5 h， 1 h， 2 h after heat stress. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining and expression of caspase-3 were determined by westen blotat 0 h、3 h、6 h、12 h after heat stress. In addition， MnTMPyP is the specificscavengers of ROS，which effect on apoptosis is also studied at 12 h after heat stress.Results Compared with control group，amounts of ROS was significant increased at 0 h after heat stress，the burst out of it was at 2 h after heat stress（P
【Key words】Severe heat stroke； Brain damage；Heat stress；Heat stress model；Neuron；Apoptosis；Apoptosismechanism； Reactive oxygen species
重癥中暑是威脅健康的嚴重疾病，表現為中心體溫升高超過40 ℃以及各種中樞神經系統功能障礙如譫妄、抽搐、昏迷等[1]。由高熱引起的中樞神經系統損害是重癥中暑的主要特征之一，其損害程度也直接決定了重癥中暑的病情及預后[2]。目前，重癥中暑中樞神經系統損害的病理生理機制尚不明確。凋亡在中暑發病中的作用已逐漸受到重視，越來越多的研究發現高熱可誘導機體大量細胞凋亡[3-4]。到目前為止，關于中樞神經細胞在中暑熱打擊中發生凋亡的研究較少，國外僅Vogel觀察到了熱打擊后神經元細胞凋亡的現象[5]，國內未見相關報道。本研究觀察熱打擊后神經元凋亡以及細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發性增加與神經元凋亡的相關性，探討ROS在重癥中暑中樞神經系統損害中的作用。
1 材料與方法
1.1 儀器A200144
CO2孵箱（中國上海艾測電子科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica）、熒光顯微鏡（德國Leica）、數據處理系統（ DMR） 圖像分析（德國Leica）；流式細胞儀為美國BD公司產品；酶標光度計為美國BIO-RAD產品；貝克曼GS-15R高速冷凍離心機（美國）；ECL化學發光檢測試劑盒購自Amersham公司。
1.2 SD大鼠大腦皮層神經元細胞株培養
SD大鼠大腦皮層神經元細胞購于賽業（廣州）生物科技有限公司，在南方醫科大學腫瘤研究所實驗室進行培養。培養液由含600 mg/mL葡萄糖的DMEM加10%馬血清、終質量濃度為100 μg/mL 的轉鐵蛋白、5 μg/mL胰島素、20 nmol孕酮、100 μmol/L腐胺、30 nmol/L二氧化硒及
100 U/mL雙抗組成，將神經元細胞置于37 ℃、體積5%CO2及飽和濕度條件的孵箱中培養。約2～3 d進行1次傳代，傳代按1∶2至1∶3的比例進行。細胞長至對數生長期后進行實驗。
1.3 熱打擊及細胞存活率測定
取對數生長期神經元細胞，按5×104/孔密度鋪入可拆卸96孔板，待細胞貼壁穩定后進行熱打擊處理。對照組將細胞置于標準37 ℃、5%CO2細胞培養箱2 h，熱打擊組分別置于39 ℃、41 ℃、43 ℃及45 ℃細胞培養箱中2 h，各組分別設置5個復孔。熱打擊后繼續在37 ℃、5%CO2細胞培養箱孵育12 h后加入CCK8（碧云天） 10 μL/孔，具體操作參考說明書進行。用酶聯免疫檢測儀于450 mm處讀取OD值，計算細胞存活率。實驗分別獨立重復3次。
1.4 Annexin V /PI流式細胞儀檢測細胞凋亡
熱打擊組為將細胞置于43 ℃ 2 h，對照組37 ℃ 2 h，熱打擊后分別繼續在細胞培養箱孵育0、3、6、12 h。使用Annexin V/PI試劑盒（invitrogen），按說明書進行操作。在不同時間點收集細胞，調整待檢測細胞濃度為1×106/mL，冰PBS潤洗兩次2次，將細胞重懸于100 μL含 2 ulAnnexin-V-FITC（20 μg/mL） 緩沖液中輕輕混勻，避光室溫放置15 min。轉至流式檢測管，加入400 μL PBS，每個樣品臨上機前加入1 μL PI（50 μg/mL），2 min后迅速檢測。流式細胞儀檢測激發波長EX=488 nm；發射波長Em=530 nm。
1.5 Westen blot 檢測凋亡相關蛋白caspase-3表達
Westen blot參考文獻[6]說明進行。一抗使用caspase-3兔來源激活型抗體（1∶1000，碧云天），二抗使用結合有辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（1∶5000， 碧云天）。抗體孵育完成后使用化學發光劑ECL進行反應、曝光。
1.6 細胞內ROS檢測
使用DCFH-DA法檢測細胞內ROS，按照說明書操作，分別收集熱打擊組及對照組細胞，用終質量濃度10 μmol/L的DCFH-DA分子探針（碧云天）懸浮收集后的細胞，細胞濃度調整為107/mL，并將細胞置入37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。熱打擊組將細胞置于43 ℃ 2 h，對照組37 ℃ 2 h，按照0、0.5、1、2 h時間點，使用激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=525 nm檢測熒光的強弱。
1.7 ROS特異性清除劑MnTMPyP干預
MnSOD活性類似物MnTMPyP（Calbiochem公司）為ROS特異性清除劑，對照組和熱打擊組神經元細胞在進行熱打擊處理前使用濃度為10 μmol/L的MnTMPyP預處理1 h，熱打擊2 h后繼續培養12 h，Annexin V/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Westen blot 檢測caspase-3蛋白的表達。
1.8 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件包進行分析。計量資料在方差齊性的基礎上應用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異用LSD法比較，以P
2 結果
2.1 熱打擊后神經元細胞活力下降
39 ℃熱打擊對神經元細胞活力無影響，但隨著熱打擊溫度的增高（41～45 ℃），神經元細胞的活力呈現進行性下降，與對照組（37 ℃）比較差異有統計學意義（P
與對照組比較，aP
圖1 不同溫度熱打擊神經元細胞存活率
Fig 1 Cell viability of neurons at different temperature during heat stress
2.2 熱打擊后神經元細胞凋亡增加
與對照組37 ℃比較，43 ℃熱打擊細胞2 h后立即檢測（0 h）未發現細胞凋亡增加，但在熱打擊3 h后細胞凋亡開始明顯增加，細胞凋亡顯示出熱打擊后時間依賴性增加（熱打擊后12 h神經元凋亡達43.2%）（圖2），與對照組（37 ℃）比較差異有統計學意義（P
圖2 熱打擊后不同時間點神經元細胞凋亡率比較
Fig 2 Comparison ofapoptoticneuronal at different time during heat stress
2.3 熱打擊導致神經元細胞內爆發性ROS增加
Pucciariello等[7]研究已發現遭受熱打擊可誘導細胞內ROS水平增加。為了證實神經元細胞遭受熱打擊后是否也會導致ROS水平的增加，本研究使用DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平，發現遭受熱打擊后神經元細胞內ROS水平爆發性增加，熱打擊后0 h即明顯增加，2 h增加了近8倍（與對照組37 ℃比較，P
圖3 熱打擊后不同時間點神經元細胞caspase-3蛋白比較
Fig 3 Comparison of caspase-3 inneurons at different time during heat stress
圖4 熱打擊后不同時間點細胞內ROS比較
Fig 4 Comparison of ROS inneurons at different time during heat stress
2.4 ROS特異性清除劑MnTMPyP明顯抑制了熱打擊誘導的神經元細胞凋亡和caspase-3蛋白的表達
為了證實ROS在熱打擊誘導的神經元細胞凋亡中的作用，研究使用了MnSOD活性類似物MnTMPyP（Calbiochem公司），對照組和熱打擊組神經元細胞在進行熱打擊處理前使用濃度為10 μmol/L的MnTMPyP預處理1 h，熱打擊2 h后繼續培養12 h，檢測細胞凋亡和caspase-3蛋白的表達。發現ROS清除劑MnTMPyP明顯抑制了熱打擊誘導的細胞凋亡，凋亡細胞從47.42%將至18.45%，MnTMPyP處理熱打擊組與熱打擊組比較差異有統計學意義（P
A：MnTMPyP對不同溫度熱打擊神經元細胞凋亡率的影響；B：MnTMPyP對不同溫度熱打擊神經元細胞caspase-3表達的影響
圖5 MnTMPyP對不同溫度熱打擊神經元細胞凋亡的影響
Fig 5 The effect of MnTMPyP in apoptotic neurons at different temperature during heat stress
3 討論
目前研究已證實，高溫和熱輻射誘導細胞凋亡在重癥中暑病理生理過程中起著非常重要的作用[3]。本實驗結果發現43 ℃熱打擊后2 h神經元細胞內ROS水平爆發性增加，43 ℃熱打擊后12 h可導致神經元細胞大量凋亡，進一步研究發現細胞內ROS水平與熱打擊誘導的神經元細胞凋亡密切相關。
細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，這一過程廣泛存在于高級的哺乳動物乃至人類，由各種死亡信號包括低氧、氧化應激、藥物等觸發[8-9]。細胞受各種凋亡信號刺激后通過一個復雜的多水平的調控，多種因素相互作用介導凋亡過程[9]。目前研究已發現，caspase 家族成員是細胞凋亡中核心的啟動者和執行者，信號傳遞到核內切酶而執行死亡功能。在哺乳動物中已發現14種同源分子caspase1-14，其中caspase-3是細胞凋亡的主要執行者，通過特異性地裂解一套底物而導致細胞凋亡[10]。一旦caspase3 活化，細胞凋亡不可避免[10-11]。本研究顯示43 ℃熱打擊后12 h，caspase-3活化程度與細胞凋亡趨勢一致，推測熱打擊誘導的凋亡是通過caspase途徑介導的。
ROS是需氧生物在氧氣代謝的過程中產生的一類比氧氣的性質更活潑的物質[11]。許多促凋亡信號如環境不利因素、損傷、輻射等都可使細胞內源性或外源性ROS升高或氧化還原平衡改變，這種改變既可能作為信號觸發凋亡信號轉導途徑，也可能在凋亡啟動后，加速凋亡過程[12]。近年來許多研究已證實熱打擊細胞可以導致細胞內ROS水平爆發性增加，并且認為ROS直接介導了細胞凋亡的發生[13-15]。中暑動物模型研究發現，遭受熱打擊后的動物腦內ROS水平明顯升高[16]，但目前沒有直接的證據支持熱打擊后ROS的升高是否直接與中樞神經系統損害相關。本實驗使用MnTMPyP（ROS特異性清除劑）干預了熱打擊后神經元細胞內ROS的水平后發現，MnTMPyP可明顯抑制43 ℃熱打擊后12h誘導的神經元細胞凋亡相關蛋白caspase-3的活化以及凋亡的發生，提示熱打擊后神經元細胞內ROS水平爆發性增加直接介導了細胞凋亡的發生。
參考文獻
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抱恙在身范文第5篇
【摘要】 【目的】 探討不同溫度和培養基在申克孢子絲菌酵母相轉化中的作用?！痉椒ā?將4株臨床分離菌株分別接種于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5種培養基平皿上，每種培養基接種5個平皿，分別置于25 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃及38 ℃含體積百分數為5%CO2的恒溫箱中培養。觀察菌落生長情況并計算酵母細胞轉化率。【結果】 在38 ℃，平皿轉化率為25%(只有1株菌發生了轉化);在35 ℃和37 ℃時，平皿轉化率分別是60%和85%;而在36 ℃時平皿轉化率僅為45%。使用50 mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培養基培養，65%培養皿上的菌株發生了酵母相轉化，使用BHI培養基培養，45%培養皿上的菌株發生了酵母相轉化，而使用SDA和PDA培養基培養，只有20%培養皿上的菌株發生了酵母相轉化。37 ℃時，有3株菌在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基上的酵母細胞轉化率均達到90%，1株菌在SDA、PDA和BHI培養基上的轉化率均低于10%。【結論】 溫度是影響申克孢子絲菌酵母相轉化的關鍵因素，培養基的營養成分亦是影響轉化效果的重要因素。
【關鍵詞】 申克孢子絲菌; 酵母相轉化; 溫度; 培養基
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of temperature and media on mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii. 【Methods】 The clinical isolates 4 were inoculated on plates of media after reactivation. Each isolate was inoculated on plates of SDA， PDA， BHI， 50 mg/kg goat blood BHI and 5 mg/kg GSBHI， and 5 plates of each media were prepared because isolates of each meida were incubated at 25 ℃， 35 ℃， 36 ℃， 37 ℃， and 38 ℃. Growth of Sporothrix schenckii was observed and rates of transformation were calculated. 【Results】 At 38 ℃， the transformations rates were 25%(the only one Strain converted yeast). At 35 ℃ and 37 ℃， the transformations rates were 60% and 85%， respectively. At 36 ℃， the transformations rates were 45%. There were 13 of 20 plates converting yeast when 5% goat blood BHI and 0.5%GSBHI were used， 9 of 20 plates when BHI was used， 4 of 20 plates when SDA and PDA were used. At 37 ℃， transformation rates of 3 isolates reached 90% on medium of BHI， 50 mg/kg goat blood BHI和5 mg/kg GSBHI; However， the transformation rates of 1 isolate were less than 10% on SDA， PDA， and BHI. 【Conclusion】 Temperature is the key factor that affects mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii， nourishments of media may also be necessary for transformation.
申克孢子絲菌屬于雙相型真菌，在自然界或室溫培養為菌絲相，在體內或37 ℃培養為酵母相。申克孢子絲菌感染可導致孢子絲菌病，不僅可以引起皮膚組織的病變，還可侵犯內臟器官引起系統性病變，嚴重危害著人類的健康[1-2]。酵母相是申克孢子絲菌的致病相，申克孢子絲菌在體內從菌絲相到酵母相的轉化是致病的一個關鍵步驟[3-4]。目前關于酵母相轉化的研究多集中在基因水平[5-6]，而對于與致病性同樣緊密相關的生化特點研究較少。本文研究了不同溫度和培養基在申克孢子絲菌酵母相轉化中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株
菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035和BMU00471經形態學和分子生物學鑒定為申克孢子絲菌。SUMS0382和SUMS0383分離自我科淋巴管型孢子絲菌病患者，BMU02035和BMU00471由北京大學真菌和真菌病研究中心惠贈，亦分離自孢子絲菌病患者。
1.2 培養基
沙堡弱瓊脂(Sabouraud?蒺s agar， SDA)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar， PDA)基、腦心浸汁瓊脂(brain heart infusion agar， BHI)基、含50 mg/kg去纖維蛋白羊血清的腦心浸汁瓊脂基(brain heart infusion agar plus 50 mg/kg goat blood， 50 mg/kg羊血BHI)及含5 mg/kg葡萄糖腦心浸汁瓊脂基(brain heart infusion agar plus 5 mg/kg Glucose， 5 mg/kg GSBHI)，pH值均為7.0，購自廣州市迪景微生物技術有限公司。
1.3 菌株活化
將實驗菌株接種于 PDA 斜面培養基上，在含體積分數為5%的CO2 25 ℃恒溫箱中培養，每隔7 d傳代1次，連續傳代2次，光鏡下檢查菌落形態，以保證菌株的純度和生長活力。
1.4 酵母相轉化
于超凈工作臺內，采用劃線接種法將每株菌分別接種于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5種培養基上，每種培養基接種5個平皿，分別置于25、35、36、37及38 ℃含5%的體積分數為CO2恒溫溫箱中培養。觀察菌落生長情況，每5 d傳代1次，連續傳代3次。
在所有平皿上的菌株傳代3次生長至第5天時，用接種環挑取少量菌落，置于滅菌載玻片上，滴加乳酸酚棉蘭或酚紅染色后，置于光學顯微鏡下觀察菌落形態。參照文獻[7]計算每個平板上菌株的酵母細胞轉化率，轉化率 > 10%為酵母相轉化成功。
1.5 統計學分析
利用精確概率法對所有菌株在不同溫度和培養基下轉化率的差異進行統計學分析，統計軟件使用SPSS 16.0， P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 菌株活化
4 株申克孢子絲菌經活化后均生長良好，形成棕褐色有皺褶的典型菌落。
2.2 酵母相轉化
2.2.1 申克孢子絲菌在不同溫度的酵母相轉化
在25 ℃的培養條件下，5種培養基上生長的菌株均表現為明顯的絲狀菌落，不能轉化為酵母相。在38 ℃時，25%培養基平皿上的菌株發生了酵母相轉化(為菌株BMU00471，其余菌株均不能生長)。35 ℃和37 ℃時分別有60%(12/20)和85%(17/20)培養基平皿上的菌株發生了酵母相轉化。36 ℃時僅有45%(9/20)培養基平皿上的菌株發生了酵母相轉化(表1)。菌株在各溫度下的轉化率的差異具有統計學意義(P < 0.001)。在光鏡下計數不同溫度時50 mg/kg羊血BHI培養基上生長的4株申克孢子絲菌酵母細胞的轉化率，發現所有菌株在35 ℃和37 ℃的轉化率均明顯高于36 ℃和38 ℃，對于菌株BMU00471，其在35 ℃和37 ℃的轉化率均可達到90%;38 ℃時所有菌株的轉化率最低，菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035均低于10%(圖1)。不同溫度下的酵母相菌落均在轉種后的第2天開始出現，在第2 ～ 4天生長迅速，在第5天生長變得緩慢。在含5%去纖維蛋白羊血清的BHI培養基上，菌株BMU00471在35、36、37和38 ℃均可以轉化為酵母相。在35 ℃和37 ℃時，酵母細胞生長良好，光鏡下觀察發現90%的菌絲可轉化為酵母細胞;在36 ℃，酵母相菌株生長相對緩慢，光鏡下仍可見到較多的菌絲片段和孢子;在38 ℃，菌株生長速度較36 ℃時快，但在光鏡下發現轉化的酵母細胞數量較36 ℃少(圖2)。
2.2.2 申克孢子絲菌在不同培養基上的酵母相轉化
在營養豐富的50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基平皿上，酵母相轉化率均為65%，且生長最為旺盛;BHI培養基次之為45%;SDA和PDA培養基最少均為20%，且菌株在不同培養基上的轉化率的差異具有統計學意義(P = 0.002，表2)。35 ℃時，在SDA和PDA培養基上菌株以菌絲相生長，而在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基上則以酵母相生長。36 ℃時，在SDA和PDA培養基上菌株不能生長，在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基上則以酵母相生長。37 ℃時，菌株SUMS0382、BMU02035和BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基上的酵母細胞轉化率均達到90%;菌株SUMS0383在SDA、PDA和BHI培養基上的轉化率均低于10%(圖3)。不同培養基上的酵母相菌落均在轉種后的第2天開始出現，在第2 ～ 4天生長迅速，在第5天生長變得緩慢。 在35 ℃時，菌株BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI培養基上均可轉化為酵母相，且生長良好，光鏡下觀察可見轉化良好的呈“雪茄”樣的酵母細胞(圖4);而在SDA及PDA培養基上，菌株BMU00471呈現不典型的絲狀菌落，并可產生棕素，光鏡下可見大量的菌絲及“梅花”樣孢子(圖4)。
3 討 論
本研究發現在36 ℃時4株申克孢子絲菌臨床分離株均可以轉化為酵母相，而在以往僅Lima等[8]報道1株申克孢子絲菌在動物體內傳代以后才具備在36 ℃發生酵母相轉化的能力。在我們的研究中，36 ℃時有45%培養基平皿上的申克孢子絲菌發生了酵母相轉化，但其酵母細胞轉化率明顯低于35 ℃和37 ℃時的轉化率。36 ℃時菌株轉化數量及轉化率卻同時低于35 ℃和37 ℃，其內在機制在進一步研究中。
本研究發現，35 ℃和37 ℃是申克孢子絲菌酵母相轉化的適宜溫度，與以往的研究相符[7]。在35 ℃和37 ℃，無論是發生轉化的菌株數量還是酵母細胞的轉化率，均明顯高于36 ℃和38 ℃。但35 ℃和37 ℃哪個更適合申克孢子絲菌的酵母相轉化呢?我們的研究顯示，在37 ℃而不是35 ℃，發生酵母相轉化的菌株數量最多，酵母細胞轉化率最高，與Dixon等[7]研究顯示的35 ℃適合申克孢子絲菌環境分離株的酵母相轉化，而37 ℃適合臨床分離株的轉化現象一致。也有學者發現分離自固定型孢子絲菌病的菌株只能在35 ℃發生酵母相轉化，分離自淋巴管型孢子絲菌病的菌株無論在35 ℃還是37 ℃均可發生酵母相轉化[9]。本研究中分離自皮膚淋巴管型孢子絲菌病患者的菌株SUMS0382和SUMS0383，既可在35 ℃也可在37 ℃發生酵母相轉化。在38 ℃僅菌株BMU00471可以轉化為酵母相，其余菌株不能生長。Ghosh等[10]的研究顯示申克孢子絲菌在30 ～ 37 ℃生長良好，在40 ℃生長受到了抑制，并沒有明確指出在38 ℃申克孢子絲菌是否能夠生長和發生轉化。有學者證明鈣調蛋白激酶可以調控申克孢子絲菌從菌絲相到酵母相的轉化[4]。我們推測溫度在申克孢子絲菌酵母相轉化過程中的作用可能與鈣調蛋白激酶的活性有關。
本研究首次發現在臨床常使用的PDA和SDA培養基上，申克孢子絲菌可以轉化為酵母相，然而營養豐富的BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養基上發生酵母相轉化的申克孢子絲菌數量和酵母細胞的轉化率明顯高于PDA和SDA培養基，可見營養成分是影響申克孢子絲菌酵母相轉化的重要條件。以往文獻[10-12]報道申克孢子絲菌的酵母相轉化使用的培養基有胱氨酸葡萄糖血瓊脂基、BHI、含50 mg/kg去纖維蛋白羊血的BHI和胰蛋白酶大豆瓊脂基，均可獲得較好的轉化率，我們利用含5 mg/kg葡萄糖的BHI培養基對申克孢子絲菌進行酵母相轉化，其轉化菌株的數量和酵母細胞轉化率與含50 mg/kg去纖維羊血BHI培養基的一致，值得在臨床推廣。
研究顯示不同培養基上的酵母相菌落均在轉種后的第2天開始出現，在第2 ～ 4天生長迅速，在第5天生長變得緩慢，與Robert[13]在電鏡下觀察到的時間一致。但Hempel[14]將豚鼠的外周巨噬細胞加入培養基中，可將申克孢子絲菌酵母細胞的轉化時間縮短至24 h。
總之，本研究通過探討不同溫度和培養基在申克孢子絲菌酵母相轉化中的作用，明確了溫度是影響申克孢子絲菌酵母相轉化的關鍵因素，培養基的營養成分亦是影響轉化效果的重要因素，從而進一步證實了申克孢子絲菌酵母相轉化條件的多樣性，為抑制申克孢子絲菌在體內的酵母相轉化，阻斷其致病機制提供了研究基礎。
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