胃蛋白酶

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胃蛋白酶范文第1篇

[關鍵詞]胃蛋白酶原；胃部疾病；臨床應用

胃粘膜分泌的胃蛋白酶原1%通過胃粘膜毛細血管進入血液循環，當胃粘膜發生病變，血清中胃蛋白酶原的水平也會發生相應的變化。所以檢測血清中胃蛋白酶遠的表達水平對監測胃粘膜形態及功能變化有一定意義。

MerinoAM等檢測了268例不同腫瘤患者的腫瘤組織中PGII的原位表達[1]，發現除在胃腸組織中表達外，PGII還表達于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等癌組織。從而證實PGII在胃腸外癌組織中的廣泛表達，而它與腫瘤發展的關系也逐漸被揭示。

日本、芬蘭將胃蛋白酶原作為早篩指標取得了成果，減少了胃癌發病率，近年來國內對胃蛋白酶原臨床應用的研究也在不斷開展。本文就目前國內外胃蛋白酶原臨床應用的進展情況進行綜述。

1PG的生理

1.1PG的分類

胃蛋白酶原（PG）是一種具有消化功能的內切蛋白酶前體，屬于天冬氨酸蛋白水解酶，是由375個氨基酸組成的單鏈多肽，其分子量為42KD，在酸性條件下被激活[2]。人胃蛋白酶原可分為兩種生化特征和免疫活性不同的胃蛋白酶原亞群：按胃蛋白酶原在瓊脂凝膠電泳下的遷移率由快至慢分為PGl-PG7七種同工酶原，其中PGl-PG5有共同的免疫原性，合稱PGI（又稱PGA）；PG6和PG7遷移率較慢，合稱PGII（又稱PGC）[3]。

1.2PG的分泌部位與分布。

PGI和PGII在細胞來源及組織內分布各不相同[4-6]，PGI來源由于胃底腺的主細胞和頸粘液細胞分泌，PGII則由全胃腺和遠端十二指腸Brunner氏腺分泌，前列腺和胰腺也產生少量PGII，胃粘膜合成的PGII約為總量的25%。只有少量（約1%）PG透過胃粘膜毛細血管進入血循環，血清胃蛋白酶原的濃度可反應胃粘膜的分泌水平，也可反應不同部位胃粘膜的形態和功能。血清中具有PGI和PGII兩種形式。在尿中也有PG，但主要為PGI。中也有PG的分布，但只有PGII。PGI在胚胎胃粘膜中高度表達，在胃中幼稚細胞即能分泌一定量的PGI，而PGII最初出現在胚胎后期，約胚胎的第32~36周，是胃粘膜細胞分化成熟，消化功能逐漸完善的標志。不同種的PG的產生似乎與以下幾種因素相關：結構基因的數量、個體等位基因的差異及翻譯后的修飾[7]。PG連續分泌的最大速率是由其最大合成速率決定的，PG的合成是一個獨立連續的使得消化細胞充滿顆粒的過程，溢出性分泌是PG分泌的唯一的而且是最基本的形式[8]。

2PG的臨床應用

2.1用于胃癌的早期篩查

日本Kitahara等早在1999年以PGI、PGII加胃鏡活檢普查了5113人[9]，以血清PGI

2.2作為胃癌術后復發的判定指標

胃癌患者全胃切除后血清PG含量作為隨訪指標，可為胃癌復發提供重要線索。林惠忠等測定了62例胃癌患者和61例健康人的血清PG[15]，發現胃癌患者PG水平明顯低于健康人的PG水平，且在早期胃癌即發生改變，進展期胃癌則更低。進一步測定術后患者血清PG，發現手術后PG較術前明顯降低。跟蹤隨訪后發現在部分胃切除患者胃癌復發后血清PG無明顯變化，而全胃切除患者胃癌復發后PG顯著升高。從而證實血清中PG，尤其是PGI、PGI/PGII是監測全胃切除術后復發的良好指標。

2.3用于腸膽反流的診斷

張立魁認為少量的未被活化的胃蛋白酶原經門靜脈血液再分泌或直接進入膽道[16]，從而可以在膽汁中檢測到。故以核素判斷腸膽反流為基礎，分析胃蛋白酶原法診斷腸膽反流的可行性。結果，在反流組患者膽汁中PGⅡ的質量濃度低于無反流組，且差異有統計學意義，認為其PGⅡ質量濃度低于無反流組是因為胃酸反流進入膽道，從而分解了胃蛋白酶原。同時參照應用淀粉酶值判斷胰膽反流的方法[17]，取PGⅡ26.45μg/L作為判斷“T”管引流患者有無腸膽反流的界值，膽汁中PGⅡ質量濃度低于26.45μg/L則認為存在反流。認為使用胃蛋白酶原Ⅱ法判斷腸膽反流的陽性率（27.59%）低于核素法（37.93%），操作較為繁雜，不如口服核素法直觀，且可靠性稍差，但患者避免暴露于放射性輻射的可能，無痛苦，可以作為觀察十二指腸膽道反流的一種選擇方法。

2.4作為胃腸外疾病的監測手段

2.4.1卵巢癌

RojoJV，MerinoAM等檢測了72例上皮細胞卵巢癌患者癌組織中PGII的表達[18]，發現19例PGII表達陽性，與臨床病理特點無明顯相關性，而在血清CA125水平低于35U/ml的PGII陽性患者比其他患者有一個較好的預后。

2.4.2前列腺癌

DiazM，RodriguezJC等研究了24例接受抗雄激素治療伴有骨轉移的原發性前列腺癌患者的組織PGII表達[19]，其中12例（42.8%）PGII表達陽性，進一步調查預后發現PGII的表達與長期預后有顯著相關性。從而得出結論PGII可以作為一個有用的激素相關性前列腺癌預后的生物學標記。

2.4.3乳腺癌

VizosoF，SanchzLM等測定了243例乳腺癌患者腫瘤組織中胃蛋白酶原的表達[20]，其中113例表達陽性，且高分化的癌組織PGII表達顯著高于低分化的癌組織。經過48.5月的預后調查發現癌組織中PGII的低表達預示著良好的無復發預后和整體預后，從而得出結論PGII的表達較低可以提示患者的早期復發和不良的預后。

2.4.5葡萄膜黑色素瘤

AlvarezML等研究了22葡萄膜黑色素瘤組織中PGII的表達[21]，其中11例PGII表達陽性，其在伴有鞏膜侵犯的患者組織中的PGII表達陽性的幾率高于無鞏膜侵犯者，PGII的表達與較差的預后有顯著的相關性。

3小結：

綜上所述，現今胃蛋白酶原研究主要集中于將其用于胃癌前期病變的早期篩查。此種血清學檢測是更為簡便、經濟、安全、和有效的方法，已逐漸被接受為一種篩查方法，但目前很多臨床研究測定其篩查界值結果各異，雖然作為胃癌篩查指標目前應用較多的界值為PGI

胃蛋白酶原與胃腸疾病、胃腸疾病外其它疾病的相關性也有一定的研究，但目前尚不成熟。隨著胃蛋白酶原檢測方法的進步及不同胃部疾病胃蛋白酶原表達情況的深入研究，有待于進一步探討不同胃部疾病及胃部疾病的不同證型患者胃蛋白酶原的表達情況，并界定最佳界值，以其使胃蛋白酶原不僅僅用于胃癌的早期篩查，而是進一步用于胃部疾病的診斷，并通過胃蛋白酶原水平判斷胃部疾病的具體病變部位。

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胃蛋白酶范文第2篇

[關鍵詞] 慢性胃部病變；血清胃蛋白酶原；變化；糜爛性胃炎

[中圖分類號] R573 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）09-211-04

Clinical study on changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases

WANG Mingnan HUANG Deqiu WU Shaolin OU Yongguang XIE Xinkun

Department of Laboratory， Zhaoqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To discuss changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases. Methods 216 cases with chronic gastric diseases from Jan 2014 to Dec 2016 were selected as subjects， among them， 54 cases of superficial gastritis， 30 cases of erosive gastritis， 44 cases of atrophic gastritis， 36 cases of gastric ulcer， 40 cases of duodenal ulcer， 12 cases of gastric cancer. PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of difference groups were compared， and PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of Hp+ and Hp- patients were compared. Results PGⅠ levels of erosive gastritis， gastric ulcer， duodenal ulcer were higher than those of control group， and atrophic gastritis and gastric cancer was lower than those of control group， which showed significant difference（P

胃蛋白酶范文第3篇

【關鍵詞】 小兒增食靈合劑；胃蛋白酶；胃酸：小兒厭食癥

小兒厭食癥是指食欲減退的一種慢性食欲障礙性疾病，多發于1～6歲小兒，城市發病率高于農村，近年來發病率有增高趨勢。以我科張士卿教授治療小兒厭食癥的經驗方組方加減的小兒增食靈合劑，通過多年臨床觀察，具有可靠療效。為探討其作用機制，筆者研究了小兒增食靈合劑對厭食癥模型大鼠胃蛋白酶活性和胃酸分泌量的影響，現報道如下。

1 材料

1.1 藥物及試劑

小兒增食靈合劑由甘肅中醫學院附屬醫院提供，規格：240 mL/瓶；批號：200506；臨用時按14.4 g/(kg·d)、7.2 g/(kg·d)分別用蒸餾水配制成相應的水溶液。江中健胃消食片：江中搖曳股份有限公司生產，批號0404003，臨用時用蒸餾水制成混懸液，0.576 g/(kg·d)(2 mL)。試劑主要有乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞、二甲基黃指示劑。

1.2實驗動物

選斷乳后1周齡的健康SD大鼠50只（甘肅中醫學院動物實驗中心提供），質量（60±10）g，雌雄各半。合格證書：SCXK（甘）2004－007－0001515。

2方法

2.1動物分組

將50只大鼠適應性喂養1周后，依據數字隨機表法分為5組，每組10只。A組：空白對照組。B組：模型對照組。C組：陽性對照組。D組：小兒增食靈合劑小劑量組，簡稱小劑量組。E組：小兒增食靈合劑大劑量組，簡稱大劑量組。

2.2模型的建立與給藥

所有動物在同一條件下喂養（室溫20~24 ℃，相對濕度50 % ）。 A組以常規飼料喂養，其余4組用特制飼料喂養。特制飼料采用魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按照1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2比例混勻［1］ ，捏成餅干狀，每塊約20 g，晾干，4 ℃冷藏備用。所有動物均單籠飼養，自由進食飲水，共飼養5周。每日記錄進食量及身體質量的變化，以造模大鼠攝食量平均下降20 %~30 %為模型成功標準,或身體質量低于對照組10 %~15 %為造模成功［2］ 。造模成功1周后，各組開始灌胃。A組和B組每日灌服等體積蒸餾水，D組和E組灌服相應劑量的小兒增食靈合劑水溶液2 mL，C組每日灌服江中健胃消食片混懸液2 mL。各組大鼠均每日灌胃1次，連續灌胃15 d。

2.3標本的采集

所有大鼠禁食禁水48 h，用乙醚麻醉大鼠，備皮，常規消毒皮膚，于劍突下沿腹白線開一2.5 cm切口，提起胃，在幽門與十二指腸結合部用縫線結扎。各組分別于十二指腸注入生理鹽水，劑量為0.01 mL/g。縫合創口后放回籠中，術后禁食禁水，5 h后斷頸處死動物，取出胃，收集胃液于刻度離心管，以2500 r/min離心15 min，吸取上清液進行胃液分析［3］ 。

2.4檢測方法［4-6］

2.4.1大鼠胃蛋白酶活性的檢測

采用Mett法測定胃蛋白酶活性。先用內徑2 mm、長10 cm的毛細玻璃管吸滿雞蛋清（紗布過濾），然后放于70 ℃熱水中使蛋白凝固，制成蛋白管取出備用（實驗當天制備）。準確吸取胃上清液1 mL于試管中，并加入15 mL的鹽酸（0.05 mol/L），放進兩根蛋白管作為平行樣。試管封口后放進37 ℃恒溫箱保存，24 h取出兩根蛋白管，測量其四端透明部分的長度（mm），求平均值。公式如下：

胃蛋白酶活性單位（U/mL）=四端蛋白管透明部分長度均值2×16

2.4.2大鼠胃酸分泌量的測定

取清晰胃液2 mL，置于小燒杯中，加入二甲基黃指示劑和酚酞指示劑各3滴，混勻，呈櫻紅色，于小燒杯下襯一白紙。用微量滴定管徐徐滴入0.02 mmol/L NaOH標準溶液，隨滴隨搖，直至櫻紅色消失，開始出現橙黃色時，記錄NaOH溶液的消耗量，即為游離酸度終點量，繼續用0.02 mmol/L NaOH標準溶液滴定，至出現酚酞的紅色（微紅色不退），記錄NaOH溶液的消耗量與上所用之和即為總酸度終點量，按下式計算游離酸和總酸度：

游離酸（mmol/L）=游離酸度終點量×10

總酸度(mmol/L)=總酸度終點量×10

2.5統計學處理

所有數據均采用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS11.5統計軟件處理，各指標組間根據方差齊性采用多因素方差分析。

3 結果

3.1 各組實驗大鼠攝食量變化比較

實驗結果表明，造模第1～7 d，B組大鼠日平均進食量低于A組20.1 %左右，第7～21 d，B組大鼠日平均進食量低于A組24.5 %，經統計學處理均有顯著性差異。見表1。

表1各組大鼠日平均進食量比較 （±s，g）組別n第1 d第7 d第14 d第21 d第27 d第33 d A106.80±1.1311.90±1.6914.99±1.6715.38±1.2115.37±1.3415.60±1.49 B106.78±0.789.54±0.8811.20±0.9511.58±0.9511.13±1.7711.36±0.70 C106.16±0.949.51±0.6511.12±1.0112.57±0.9313.82±0.5514.35±0.62 D106.10±0.609.46±0.9511.06±0.6012.60±1.0614.08±1.0315.04±1.28 E106.29±0.949.50±1.1711.49±0.8212.36±1.3914.10±0.4914.45±1.35 注：與A組比較 P?0.05 ,P?0.01；與B組比較 P?0.05, P?0.01

3.2小兒增食靈合劑對胃蛋白酶活性的影響

實驗結果表明，大、小劑量小兒增食靈合劑及江中健胃消食片水溶劑均具有提高胃蛋白酶活性的作用，與A、B兩組比較，有非常顯著性差異（P?0.01 ）。但D、E兩組與C組比較無統計學意義。見表2。

3.3小兒增食靈合劑對胃酸分泌量的影響

實驗結果表明，大、小劑量小兒增食靈合劑及江中健胃消食片水溶劑均可使胃游離酸和胃總酸分泌量增加，尤其可顯著提高胃游離酸；與A組比較，P<0.05或P<0.01；與B組比較，P<0.01；但D、E組與C組組間比較無統計學意義。見表3。

表2小兒??食靈合劑對胃蛋白酶

活性的影響 （±s）組別n胃蛋白酶活性

（U）A組10855.25±249.14B組10642.00±126.02C組101565.00±321.72D組101750.25±472.80E組102082.75±446.23 注：與A組比較P?0.01；與B組比較P?0.01表3小兒??食靈合劑對胃游離酸和

總酸度的影響 （±s）

組別n游離酸度

（mmol/L）總酸度

（mmol/L）A組1034.61±3.0864.29±9.52B組1033.06±6.6262.86±13.35C組1043.57±4.65 75.50±3.80D組1042.52±5.0875.38±2.39E組1045.73±3.2376.46±5.24 注：與A組比較P?0.05， P?0.01；與B組比較P?0.01

4討論

導致小兒厭食癥發病的病因較多，但大多數學者認為與脾胃失調、納化失常有關。因此，治療本病關鍵在于運脾和胃。小兒增食靈合劑是張士卿教授將厭食癥機理與“脾健不在補而貴在運”的指導思想相結合，經過多年臨床應用創制而成的。組方中蒼術味微苦，芳香悅胃，功能醒脾助運、開郁寬中、疏化水濕，正合脾之習性，故為君藥；茯苓性平，作用和緩，可健脾補中，與蒼術相配燥濕而不傷脾，補脾而不斂濕，又補中有運，補運結合；檳榔、雞內金可行氣和胃，消食化積；胡黃連善清胃腸濕熱；烏梅酸收，可益氣開胃，與胡黃連配伍又可助其除疳清熱之功；炙甘草益氣補中，調和諸藥。上述諸藥合用，可謂消補并舉，標本同治，補而不滯，消導而不傷正，共奏健脾助運、消食醒胃、行氣消積之功。

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胃蛋白酶范文第4篇

關鍵詞：微生物；彈性蛋白酶；發酵

中圖分類號：Q556+.9文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2007)01-0050-04

Progress in Microbial Production of Elastase

FANG Shang-ling, HU Jia-jun

（College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China）

彈性蛋白酶（elastase）是一種以分解不溶性彈性蛋白質為特征的廣譜蛋白水解酶，主要存在于動物胰臟中，以及皮膚、主動脈、血小板和白血球中。在微生物類群中也廣有分布，細菌、放線菌、真菌中都有分泌胞外彈性蛋白酶的報道[1]。彈性蛋白酶可由動物胰臟提取或由微生物發酵制得[2]。由動物提取純化的彈性蛋白酶是一種肽鏈內切酶，由240個氨基酸殘基組成，相對分子質量為25 900，等電點為pI 9.5[3]。來源不同的微生物彈性蛋白酶都能降解其天然底物――彈性硬蛋白質。同功不同源蛋白酶的特點、性質、相對分子質量和等電點等有所差異，但都是一種廣譜的肽鏈內切酶，具有較廣泛的水解特性[4]。

目前，彈性蛋白酶主要作為治療高脂血癥、防治動脈粥樣硬化癥的生化藥物，治療確切，安全可靠。我國生產彈性蛋白酶主要由豬胰臟提取，原料來源有限制，且酶含量不高，每1 kg鮮胰臟含彈性蛋白酶僅210 000 U，限制了生產的發展。微生物彈性蛋白酶與胰彈性蛋白酶一樣，具有較廣的水解特性，不但能降解彈性蛋白，而且能分解酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質，是一種廣譜的肽鏈內切酶。國外，藥用彈性蛋白酶有通過動物胰臟提取，也有發酵生產，其效果相似[1]。利用微生物發酵大規模工業化生產彈性蛋白酶不僅能提供足夠的治療用藥物酶，也能為開拓該酶其他方面的應用提供充足的酶源。

1微生物來源彈性蛋白酶的國內外研究情況

彈性蛋白酶最初是1949年由Balo等從胰臟中分離純化出來，并指出其含量水平與動脈粥樣硬化癥有關。從此對該酶的研究一直很活躍。

1960年Mandl等從牙周病患者的送檢樣品中首次分離出產胞外彈性蛋白酶的微生物Flavobaterium clastdyticum，并從它的培養液中分離純化出專一降解彈性蛋白的菌源性彈性蛋白酶。此后從細菌、霉菌、放線菌中相繼分離出產酶菌株及其菌源彈性蛋白酶，但初期主要集中于醫學微生物病原學的研究。70年代中期以來，日本和前蘇聯學者對微生物發酵生產彈性蛋白酶進行了大量的研究，并申報了許多專利菌種。其中研究比較詳盡的是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa IFO3455）。另外，1974年，Shiio等從自然界取樣分離的Flavobacterium immotum 9-35具有很強的彈性蛋白酶分泌能力。后來分離出1株利福平抗性的高產突變株Flavobacterium R-102-87，在以葡萄糖、干酪素為營養源的發酵培養基中，30 ℃振蕩培養24 h，酶產量達145U/mL（40 ℃，20 min，使1.0 mg地衣紅-彈性蛋白質完全溶解的酶量為1U）。

前蘇聯學者對放線菌屬和曲霉屬菌株產彈性蛋白酶研究較多。放線菌屬產彈性蛋白酶的代表菌株是Actinomyces rimosus和Actinomyces fradiae119。將Actinomyces rimosus所產的酶純化并與胰彈性酶比較，發現除相對分子質量較大外，其它性質及水解專一性都與胰源酶十分相似。

真菌中產彈性蛋白酶的高產菌株是曲霉屬，前蘇聯Parksrskyte等選出的彈性蛋白酶高產菌Aspergillus versicolor 837，在以硫酸銨為氮源的馬鈴薯汁培養基深層液體培養48 h，然后強烈通風培養4 d，培養液積聚大量胞外彈性蛋白酶。

我國對微生物產彈性蛋白酶的研究則少見文獻報道，直到上世紀90年代才有顏子穎等[5]關于芳香黃桿菌產彈性蛋白酶菌種篩選、發酵條件研究及酶分離純化等方面的報道。他們分離的黃桿菌Flavobacterium sp.17-87在30℃，搖瓶培養24 h，彈性蛋白酶產量達120 U/mL，并從中成功地分離出了黃桿菌彈性蛋白酶結晶。

隨后，曹軍等[6]從不同省區采集的500多個土樣中分離得到多株產彈性蛋白酶菌株，主要集中在黃桿菌屬和色桿菌屬中。經細胞工程技術處理后，黃桿菌屬中F-122菌搖瓶發酵產酶能力達到240 U/mL，活力比原始菌株提高了58%。

陳啟和等[7]從土壤中也篩選到一株高產彈性蛋白酶的芽孢桿菌（EL3），其酶活達100 U/mL。經過誘變選育、培養基優化等系列研究，獲得了大幅度提高酶活性的培養條件。陳麗娟等[8]對枯草芽孢桿菌產彈性酶及提純工藝進行了較為深入的研究。王娟麗等[9]從土壤中篩選了一株彈性蛋白酶高產菌株Bacillus pseudofirmus EL112，酶活性也達100 U/mL。據hiio等報道，產酶活性達155 U/mL，具備了工業化生產價值。

2微生物產彈性蛋白酶的特征

微生物產生的彈性蛋白酶在結構特征上，具有2個標志性特征：（1）與彈性蛋白質有高親和力；（2）酶切位點在脂肪族氨基酸羧基參與形成的肽鍵上。雖然不同來源的彈性蛋白酶的特點、性質、相對分子質量不盡相同，但迄今為止所有分離的彈性蛋白酶最適作用pH均在7.0以上，屬于堿性彈性蛋白酶，酸性彈性蛋白酶尚未見報道。與其它的堿性蛋白酶不同，堿性彈性蛋白酶對甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）殘基有很高的水解特異性。彈性蛋白中Ala、Gly含量高達55%。這也解釋了彈性蛋白酶能高效降解彈性蛋白質的原因。

彈性蛋白酶的水解機制，是首先使彈性蛋白質的結構變疏松并溶解，然后將已溶解的彈性蛋白質降解成可溶的多肽及氨基酸。彈性蛋白質在堿性環境下易變性，結構疏松，有利于彈性蛋白酶對其水解。從嗜堿菌中篩選得到的菌株所產彈性蛋白酶有較高的最適反應pH，其降解彈性蛋白質的酶活性也高。

現已發現的微生物產彈性蛋白酶根據等電點可分為2類：（1）等電點在堿性的彈性蛋白酶，其與底物之間的結合力主要為靜電作用力，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、放線菌屬（Actinomyces）、黃桿菌屬（Flavobacterium）產的彈性蛋白酶。嗜堿芽孢桿菌Ya-B產的彈性蛋白酶幾乎所有正電荷殘基都集中在分子表面，這有利于該酶與彈性蛋白質結合。當pH高于彈性蛋白酶的等電點時，彈性蛋白酶失去邊面正電荷，與彈性蛋白質的結合率顯著下降；（2）等電點在酸性的彈性蛋白酶，其與底物彈性蛋白質之間的結合力主要為疏水作用力，NaCl不能抑制該酶的活性。如：銅綠假單胞菌產的彈性蛋白酶、人胰腺中的彈性蛋白酶、Myxococcus xanthus產的MAP1。Ca2+對保持酶活力，防止酶自身降解必不可少。Micrococcus luteus[8]產生的堿性彈性蛋白酶在Ca2+存在下，在pH6.0～10.5之間、57 ℃以下穩定；EDTA可通過與Ca2+ 結合完全抑制酶活性并導致酶的自溶。

3微生物彈性蛋白酶的基因工程和蛋白質工程進展

3.1彈性蛋白酶的基因克隆和表達

采用分子生物學技術克隆目的基因構建工程菌株，是各國微生物學家的研究熱點。彈性蛋白酶基因的克隆和表達，可從理論上解釋彈性蛋白酶的轉錄表達及酶學反應機制，并為該酶實現工業化生產打下基礎。1987年，胰彈性蛋白酶的基因首次被克隆，并在E.coli LE392中表達成功[10]。Yoda等在E.coli-B.subtilis的穿梭載體pHY300pLK的基礎上，構建含彈性蛋白酶基因的質粒，將Bacillus的堿性彈性蛋白酶的基因克隆到B.subltils中得以表達。表達菌產酶為73 U/mL。

Ryuta 等于1989年克隆了嗜堿芽孢桿菌Ya-B的堿性彈性蛋白酶基因（ale）并測得其核苷酸序列，推出其氨基酸序列，從分子機制解釋彈性蛋白酶具有高的最適反應pH及高酶活性的原因。該基因共編碼378個氨基酸，其中包含27個氨基酸的信號肽及83個氨基酸的前導序列，成熟酶蛋白由268個氨基酸組成。他們將該基因克隆到表達載體，分別轉化到E.coli K-12和B.subtilis DB104中，在后者中檢測到了目的基因的表達。

Chang等[11]深入研究了該酶的信號肽及前導序列的功能，將ale基因的信號肽及前導序列分別克隆表達。結果表明，彈性蛋白酶Ya-B的正確折疊形成有活性的蛋白酶的過程發生在細胞外，此過程需要分泌于胞外的前導序列的協助。Yeh等[12]將ale基因的起始密碼子UUG突變為GUG，AUG，提高了ale在B.subtilis DB104及ale基因缺陷型突變株YaB-DEC中的表達。

黃春基等[13]用PCR擴增及克隆銅綠假單胞菌的彈性蛋白酶基因。方法是從銅綠假單胞菌培養物中提取染色體DNA，PCR擴增彈性蛋白酶基因成熟蛋白編碼區，A-T克隆于pMD18-T載體中，對重組質粒進行酶切和測序鑒定。結果從高GC含量的銅綠假單胞菌染色體DNA中擴增到彈性蛋白酶基因并進行了克隆與鑒定，該研究實現了活性彈性蛋白酶的高效表達。

3.2蛋白質工程改造彈性蛋白酶

Mei等[14]以枯草桿菌彈性蛋白酶BPN、枯草桿菌彈性蛋白酶Carlsberg為模板，用計算機構建了elastase YaB的三維結構模型。對位于S1底物結合口袋兩側的甘氨酸-124（Gly124）、甘氨酸-151（Gly151）定點突變，用帶有較大側鏈的堿基的結合切割。突變蛋白基因在Bacillus subtilis DB104中表達，突變蛋白G124A，G124V，G151A對相應作用底物表現出比野生型高3～10倍的催化能力。同時，突變蛋白G124A、G124V的作用底物僅限于丙氨酸、甘氨酸，G151A僅限于丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸。

4微生物彈性蛋白酶的分離制備

微生物彈性蛋白酶是胞外酶，且等電點較高，分離純化較為容易，可用離子交換法提純。近來，也開始應用親和吸附層析法[15]。

4.1離子交換法

森原和之等采用弱酸性陽離子交換樹脂直接吸附綠膿桿菌IFO 3455發酵液中的彈性蛋白酶，分離該酶并取得成功。Shiio等應用類型法分別從產黃菌R-102-87和Actinomyces rimosus的發酵液中直接分離出彈性蛋白酶成分，從大體積發酵液中濃縮彈性蛋白酶組分十分理想，可達到分離和純化的目的。

4.2親和層析法

吳梧桐等以水不溶性彈性硬蛋白酶的天然底物作為親和吸附劑裝柱，應用酶和底物的親和吸附力進行分離提純，僅進一步柱層析即獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳均一的胰彈性蛋白酶制品。顏子穎等[15]在對產黃菌sp17-87的研究中，應用該法分離出電泳均一純的彈性蛋白酶。以160目牛頸韌帶彈性蛋白質作為親和吸附劑，纖維素粉為載體按1∶20混合裝柱，控制層析條件可使酶與底物結合而不分解底物，從而達到分離該酶的目的。

5微生物彈性蛋白酶的應用

彈性蛋白酶的用途很廣，目前由于主要從臟器中提取，產量小，價格高，限制了其應用。

彈性蛋白酶在醫藥方面主要作為治療藥物：（1）治療高脂血癥；（2）防治動脈粥樣硬化；（3）抑制脂肪肝發展；（4）治療慢性氣管炎及其它結締組織纖維增生性疾病；（5）外用于消除皮膚焦痂、碎屑，用于燒傷患者的治療以及皮膚潰瘍、口腔潰瘍等癥。由于胰彈性蛋白酶和菌源彈性蛋白酶性質有差別，雖然國外有報道菌源酶可替代胰源酶用作藥品，但具體涉及到某一屬菌株所產的酶，必須在藥理、毒理及藥效方面與胰源酶作充分的比較以確保療效及安全性。

彈性蛋白酶可用于食品工業。許多動、植物蛋白質，特別是一些難以處理和食用的韌帶、大動脈血管、筋腱等蛋白質廢料都可被其降解，因此在農副產品深加工、高蛋白質食品的制作、罐頭加工等方面將會得到廣泛應用。

日用化學工業方面，彈性蛋白酶主要用于療效化妝品的生產。國外近年有報道將彈性蛋白酶加入化妝品，可增進、改善皮膚血液循環，并改善皮膚脂質代謝，增強皮膚、毛發的彈性、柔性，延緩皮膚老化，減少皺紋及色素沉著，還能促進頭發生長，防止脫發。研究表明，對呈老化現象的皮膚施以含彈性蛋白酶的化妝品，可明顯的賦活皮膚細胞，皮膚角化程度減少，潤濕程度增加。同時，應用廉價的微生物彈性蛋白酶將難以處理的動物頸、背韌帶等廢料制成高級化妝品原料，將大大簡化工藝，減低成本，并變廢為寶，

綜上所述，應用生物工程技術，將有可能提供充足的新酶源。在國外，已經應用基因工程技術構建工程菌生產彈性蛋白酶，胰彈性蛋白酶基因已被克隆并在大腸桿菌392中表達成功。選育合適的菌種應用發酵技術實現大規模工業化生產，具有很好的經濟效益和社會效益。

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胃蛋白酶范文第5篇

關鍵詞：彈性蛋白酶；枯草芽孢桿菌；分離；純化

中圖分類號：Q939.97文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2007)11-0040-03

Approach on Preparative Method of Elastase Produced by Microorganism

FANG Shang-ling, HU Jia- jun , ZHU Nan

（College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068 ,China）

Abstract：Objective To investigate the preparative method of elastase produced by microorganism. Methods A elastase-producing strain of Bacillus subtilis was inoculated into fermentation medium and cultivated on a rotary shaker。The broth was collected by centrifugation. The purification of elastase was achieved by combination methods of (NH4)2S04 fractionation, anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-25 and gel filtration chromatography on Sephadex G-75. Results Through the purification procedures shown above, the purification multiple of elastase was 33, the recovery rate was up to 12 % and the specific activity was about 528 U/mg.Conclusion The purer elastase can be obtained by this ideal purification technology.

Key words：elastase; Bacillus subtilis; separation; purification

彈性蛋白酶（elastase）是一種以降解不溶性彈性蛋白質為特征的水解酶，此酶屬于絲 氨酸蛋白酶，可由動物胰臟提取或由微生物發酵制得。從胰臟提取的彈性蛋白酶價格較高，因此，采用微生物發酵法生產彈性蛋白酶具有廣闊的應用前景[1]。本研究以微生物發酵液為原料，采用鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析方法進行彈性蛋白酶純化，并結合SDS-PAGE對純化酶進行測定。

1材料

1.1菌種

彈性蛋白酶生產菌株枯草芽孢桿菌B1由本實驗室篩選并分離。

1.2試劑

彈性蛋白、剛果紅-彈性蛋白（Sigma公司）；K2HPO4（上海恒信化學試劑有限公司）；DEAE-Sephadex A-25，Sephadex G-75（Pharmacia公司）。

1.3儀器

磁力攪拌器（江蘇岸頭分析儀器廠）；旋轉式搖床（中國科學院武漢科學儀器廠）；可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；電熱干燥箱（江蘇海門縣三和農具廠）。

1.4培養基

發酵培養基（w/v）：干酪素3.0 g，葡萄糖4.0 g，玉米提取液0.2 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4?7H2O 0.01 g，pH 8.8。115 ℃下滅菌30 min。

種子培養基（w/v）：牛肉膏0.4 g、 蛋白胨0.6 g、酵母膏0.2 g、NaCl 0.5 g，pH 8.8。121 ℃下滅菌20 min。

2方法

2.1丙酮沉淀法提取彈性蛋白酶

發酵液在4 ℃、5 000 r/min條件下離心30 min，去除菌體，上清液置冰浴中。取上清液，加入與上清液等體積的預冷丙酮，充分攪拌后在4℃下靜置30 min。4 ℃，5 000 r/min離心30 min，棄上清液，即得酶蛋白粗品。收集后測定酶活性。

2.2酶的分離純化

2.2.1pH值對鹽析的影響加入65%的硫酸銨作鹽析時的沉淀劑，測量不同pH條件下沉淀出酶的活性，確定最適鹽析pH值。

2.2.2鹽析時硫酸銨最佳濃度的確定發酵液在4 ℃，5 000 r/min條件下離心30 min，去除菌體。冰浴條件下向發酵液中緩慢加入不同量的硫酸銨，鹽析液在4 ℃下靜置過夜。4 ℃，5 000 r/min離心30 min，分別收集酶蛋白和上清液。將收集的酶蛋白粗品溶于0.02 mol/L、pH 8.0的100 mL Tris-HCl緩沖液中透析，測定酶活性，并確定硫酸銨的最佳鹽析濃度。

2.2.3DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析鹽析、透析后的酶液采用聚乙二醇濃縮至適當濃度后過離子交換柱。洗脫液檢測A280值，吸附的蛋白質用NaCl溶液連續線性洗脫。NaCl濃度0~0.6 mol/L，共800 mL，流速為5 mL/min，每管收集5 mL。分別測定各管A280值和酶活性，合并具有活性的各管溶液，并檢測酶液的酶活性。

2.2.4Sephadex G-75凝膠過濾層析[2]收集經過離子交換柱的酶液，用聚乙二醇濃縮至4 mL，加入用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液平衡過的Sephadex G-75凝膠柱中，洗脫并分部收集，流速為5 mL/min，每管收集5 mL，分別檢測各管A280值和酶活性。

2.2.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按照Laemmli方法，采用DYY-Ⅲ型垂直板電泳槽進行SDS-PAGE，電泳后的凝膠直接銀染或考馬斯亮藍染色。

3結果與討論

3.1丙酮沉淀法制取彈性蛋白酶的結果

對經丙酮沉淀純化后的粗酶進行SDS-PAGE凝膠電泳，在相對分子質量32 ×103處有一條單一的蛋白質條帶，與文獻報道的彈性蛋白酶相對分子質量大小基本一致。結果見圖1。

3.2pH值對鹽析的影響

酶在等電點或接近等電點時溶解度最低，所以，需要調整發酵液的pH值盡量接近等電點。圖2是硫酸銨濃度65 ％時，不同pH條件下彈性蛋白酶酶活性的測定結果。由圖2可見，pH4.91時，沉淀所得酶的活性較高，為144.9 U/mL；pH7.1時，沉淀所得酶的活性較低，為128.8 U/mL。因此，在酶分級沉淀的第1步去除雜蛋白質時，將發酵液pH調至7.1，第2步沉淀酶時，可將pH調至4.91。

3.3硫酸銨分段鹽析實驗結果

透析結束后測酶活性，結果見圖3。硫酸銨濃度為65 ％時酶活性較高，可達434.7 U/mL。綜合考慮酶的得率和酶活性，應收集硫酸銨濃度30 ％~65 ％之間的沉淀。經過硫酸銨分段鹽析，酶活性提高了3.45倍，達到434.7 U/mL。

3.4DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析結果

以洗脫液收集管數為橫坐標，蛋白質A280值為左縱坐標，洗脫時NaCl濃度為右縱坐標，繪制的洗脫曲線見圖4。由圖4可見，NaC1濃度為0.125～0.400 mol/L時洗脫出多個蛋白質峰。表明鹽析、透析后的酶液仍含有雜蛋白質。通過洗脫已將多種蛋白質分離開。NaC1濃度高于0.4 mol/L時，基本沒有蛋白質洗出。洗脫液第46～63管，有酶活性存在，第55、56管酶的活性最高。NaC1濃度0.154～0.187 mol/L時，即可將彈性蛋白酶洗脫下來。

3.5Sephadex G-75凝膠過濾層析結果

合并經過陰離子交換層析后有活性的收集管內溶液，透析、濃縮后用凝膠過濾層析柱純化。橫坐標為收集管數，縱坐標為A280吸收度值，繪制洗脫曲線，結果見圖5。

由圖5可見，有2個大的和1個小的蛋白質洗脫峰，大峰沒有酶活性，小峰有酶活性。表明經過離子交換層析后的酶液還含有雜蛋白質，且雜蛋白質的量高于酶的量。在收集管26～38號出現彈性蛋白酶的活性峰。

4結論

綜上所述，通過鹽析，離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析后得到較純的酶，結果見表1。最終彈性蛋白酶純化倍數為33倍，酶比活達到528 U/mg，但回收率有待提高。

參考文獻

[1]陳麗娟，劉宇峰，夏海華，等. 枯草桿菌產彈性酶及提純工藝研究[J]. 生物技術，2003，13（1）：20-21.