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關鍵詞: 化學制藥 基礎化學實驗 形成性評價
基礎化學實驗是化學制藥技術專業的職業素質課程,內容涵蓋無機化學實驗、分析化學實驗和有機化學實驗。基礎化學實驗是化學制藥技術專業學生步入大學后接觸的第一門實驗課程,基礎化學實驗課程的教學目標是習得基礎實驗知識,掌握基本實驗技能,養成良好的實驗態度與習慣,并為后續的藥物分析、藥物合成等后續課程打下堅實的基礎。
一直以來,化學制藥技術專業的基礎化學實驗的評價考核中都是作為相應的理論課程學業考評的一部分進行,考核的形式以試卷書面為主,考核的內容主要是實驗的現象與數據的處理與運算。但基礎化學實驗作為實踐課程,僅僅依靠對學生試卷完成情況進行評價并不能客觀、準確地反映學生真實的學習水平。為此,筆者探索在化學制藥技術專業的基礎化學實驗課程的學業評價體系進行改革,以使考核的結果更能真實地反映學生的實際學習情況,提高基礎化學實驗的教學質量。
1.引入形成性評價體系
在化學制藥技術專業的基礎化學實驗考評中引入形成性評價體系代替傳統的終結性評價。引入形成性評價的目的是通過師生共同監控、反思與調節教學的全過程,開發學生的潛力,改進學生的學習方法,提高教育教學質量[1]。形成性評價可以動態反映學生學習狀態的評價體系,持續性地從知識、能力、素質等三個方面動態評價,既重視學生基礎化學實驗最基本知識和能力的掌握的情況,又體現以人為本,關注不同學生的接受程度,使學生的培養不拘泥于單一死板的考核指標,全面科學地對學生的學習情況進行評價,從而有助于提高學生的專業素質。
2.實驗教學內容革新
基礎化學實驗考核革新作為化學制藥技術專業課程改革的組成部分,其思路是知識、能力和素質并重,以考核的革新推動整個化學制藥技術專業課程的全面革新。在基礎化學實驗課程中進一步加強對基本知識和基本技能的掌握程度考核,2009―2014年我系每年都組織全系性的大型實驗基礎技能大賽,以初賽、決賽和總決賽的形式進行層層選拔,對基本技能掌握優異的學生進行獎勵和表彰,并將優勝者的成績記入學業考評成績,極大地提高學生對原本單調、枯燥、重復的基本技能訓練的興趣,學生間的相互比拼能讓學生發現自身實驗技能上存在的不足,更好地幫助學生提高操作技能。
在加強學生基礎化學實驗的基本技能培養的同時,增加綜合型與設計型實驗所占的考評比例,由于基礎化學實驗是大一階段開設的課程,學生開展綜合性和探究性實驗的經驗還比較欠缺,這個階段一般可以采取PBL教學模式,由教師的設定需要解決的問題,學生以學習小組的模式開展探究,由小組設計初步的實驗方案,師生共同對方案進行討論完善,教師提供創新型實驗活動的平臺,在教師的輔導下學生小組配合共同完成實驗的探究。教師根據學生實驗方案的設計、團隊協作和具體實驗操作與數據處理分析情況進行評價,并將評價結果記入學業成績,督促學生自覺參與到實驗探究過程中,增強學生運用自身知識與技能解決問題的能力。
3.開放實驗室改革
基礎化學實驗由于其內容局限于無機化學實驗、有機化學實驗和分析化學實驗,各實驗室所配置的儀器基本都是以玻璃儀器為主,輔以少量的檢測、合成設備的,不能高精度的測定與大型的綜合合成實驗。一直以來基礎化學實驗室的開放僅限于相關課程的使用和少量的學生課外活動,實驗室的開放率和設備的利用率都很低。在基礎化學實驗考核的改革中,要想真正取得實效必須堅持以人為本,靈活開放實驗室,切實提高實驗室的有效利用率,除保證正常實驗課的使用要求外,合理設置實驗室值班教師和學生助理,配合完成實驗內容的革新的學生自主設計完成實驗或者學生個人針對自身實驗技能欠缺所進行的針對性訓練。
4.改革基礎化學實驗的日常教學與教材
基礎化學實驗的考核革新要取得實效,不僅考核的內容與形式要革新,而且日常的實驗教學也要革新。目前的基礎化學實驗教學由于實驗涉及的科目與范圍廣,實驗需要完成的內容繁重,實驗指導教師在有限時間內要完成規定的教學任務,多采取實驗室現場講解與示范的教學形式。學生按照教師的示范完成實驗,缺乏獨立思考與反思,長此以往,學生對教師的講解與示范產生依賴性,懶于預習實驗,機械地模仿教師完成實驗,看似規范的操作與合理的數據處理,實則缺乏獨立自主的動手能力及思維能力,完全流于形式,更談不上培養學生的創新意識,學生并沒有真正掌握應該實驗目的所要求的知識與技能。
為了改變這種學習狀況,實現基礎化學日常教學的革新,首先必須對實驗教材進行革新,在實驗教材作為實驗進行時的指導教材的基礎上,教師根據實驗項目所涉及的基本操作和實驗項目所必須掌握的相關理論知識編寫講義,在配合實驗室開放的前提下,在實驗開始前教師對于學生以學習小組的形式在實驗室進行講解與示范,學生利用課余時間自行在實驗室操作練習和查閱相關資料學習相關理論知識,在實驗正式開始前完成指定的預習任務。實驗教師在實驗正式開始前對學生以抽問的形式檢查學生的預習情況,并進行記錄作為評價成績的組成部分,督促學生自覺完成相關預習任務。在實驗項目正式開始時,實驗教師將主要精力放在實驗設備用法、解答學生在課前練習中出現問題的提問、監控學生獨立完成實驗結果的驗收和評定上。這樣的改變既能照顧學生對于技能掌握的個人差異,實現以人為本,為不同層次的學生提供充分的練習機會,又能有效利用課堂教學時間,實現基礎化學實驗課設定的教學目標,提高實驗課堂教學效率。
5.形成性評價比例的構成
為確保基礎化學實驗的教學質量,體現化學制藥技術專業應用型的特征,我們在設計基礎化學實驗的形成性評價分值構成按照2∶3∶2∶3的比例進行評價。其中20%為課前的預習情況評價,主要對學生對實驗項目所必需的技能與知識的預習掌握情況進行評價;30%為實驗項目的具體操作的評價,主要是學生實驗項目的操作流程的規范性、科學性及實驗相關的專業素養的評價;20%為實驗報告的評價,主要是學生對實驗現象的觀察與記錄,實驗數據分析與計算能力,以及科研態度的評價;30%是學生完成綜合性和設計性實驗的評價,主要是學生運用已有知識與技能,開展科學探究與團隊合作情況的評價。
6.新型考核評價的效果
通過化學制藥專業的基礎化學實驗的形成性評價體系的革新,更突出了對學生的學習過程的評價,督促學生養成良好的實驗態度與習慣,提高學生的專業素養,為后續的實踐課程的學習打下堅實的基礎。2010年基礎化學實驗作為重慶第二師范學院院級精品課程《基礎化學》的實驗部分接受有關部門的考核合格。2009―2014年化學制藥專業學生的基礎化學實驗部分成績穩步提升,在歷年的學院教學年度評比中學生滿意率保持在98%以上,相關教師參加學院各種比賽獲得一、二等獎三次,取得了優異的成績,有力地促進了化學制藥專業的教學改革,提高了教學質量。
經過幾年的不斷探索與完善,在化學制藥技術專業基礎化學實驗的考核評價體系取得初步成功的基礎上,我們在該專業的其他職業素質課也逐步開始推廣,并根據具體的課程特征對本考核評價方案進行調整,以適應現代社會對化學制藥專業人才提出的新要求。
參考文獻:
【摘要】
目的: 制備去甲雄三烯醇酮(又稱群勃龍,trenbolone,TR)抗體以建立TR特異性檢測方法。方法: TR與琥珀酸酐反應生成TR半琥珀酸酯(TRHS),采用混合酸酐法和對乙基N,N二甲基丙基碳二亞胺(EDC)法將TRHS與牛血清蛋白(BSA)偶聯制備其偶聯物;質譜、核磁共振分析偶聯結果;免疫家兔并用雙向免疫擴散和ELISA檢測抗血清效價,判斷偶聯物的免疫原性。結果: 經質譜鑒定顯示,所獲得的修飾物TRHS相對分子質量為370;核磁共振分析表明,各吸收峰與理論相符;基質輔助激光解析電離飛行時間質譜圖譜分析表明,TRBSA相對分子質量明顯增加、紫外最大吸收峰漂移;TR與BSA混合酸酐法和EDC法偶聯比分別為1∶18和1∶12;混合酸酐法偶聯物免疫家兔獲得的抗血清效價ELISA測得TR特異性抗體效價為1∶320 000;雙向免疫擴散測得的抗血清效價為1∶16。結論: 成功制備了具有明顯免疫原性的TRBSA偶聯物,為TR單克隆抗體的制備和建立TR殘留量的快速檢測方法奠定了基礎。
【關鍵詞】 去甲雄三烯醇酮; 半抗原修飾; 偶聯; 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜
[Abstract]Objective: To prepare trenbolone(TR) complete antigen and identify the antigenicity of TR. Methods: TRhalfsuccinate(TRHS) was produced by TR reacting with succinic anhydride, the mixed anhydride and the [3mercaptopropionic acid, 1ethyl3(3diethylaminopropyl) carbodiimide,EDC] methods were used to couple TRHS and BSA. The antigenicity analysis of TRBSA complex was finished by detecting the titre of antiserum separated from rabbits which was immunized with TRBSA. Results: The TRHS molecular weight was determined as 370 by analysis of mass spectrometry, the absorption peak was in accordance with theoretical results by nuclear magnetic resonance. MALDITOFMS analysis showed that the molecular weight map of TRBSA a marked increase and the UV maximum absorption peak drift; the coupling ratios of mixed anhydride and EDC method were 1∶18 and 1∶12, respectively. The results of ELISA and double immunodiffusion test showed that the titre of antiserum to TR was 1∶320 000,1∶16, respectively. Conclusion: RBSA coupling was successfully prepared, which established the foundation for the antiTR monoclonal antibody preparation as well as the method construction of TR Residues rapid test.
[Key words]trenbolone; hapten modification; coupling; MALDITOFMS
去甲雄三烯醇酮,又稱群勃龍(trenbolone,TR),是人工合成的甾類男性激素,是家畜的生長促進劑,服用含該激素的肉制品會給人類的身體健康帶來危害,同時也成為體育比賽興奮劑的一個可能來源。歐盟禁止進口使用該類產品的食品,也是我國海關規定必須檢測的31種獸藥之一[1]。目前,TR在食品中殘留量的檢測主要依賴于質譜技術,如氣相色譜質譜技術(GCMS)、液相色譜質譜技術(LCMS)等[2]。近年來,隨著單克隆抗體技術、現代免疫測定技術的發展,建立方便于基層檢驗檢疫部門應用的快速、靈敏的TR檢測方法,對從源頭上監測、控制此類物質的擴散具有重要意義[3]。TR是小分子化合物,需要與大分子載體(蛋白質)偶聯后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐對TR進行化學修飾,并將獲得的TR半琥珀酸酯(TRHS)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯以賦予其免疫原性,經注射家兔分析其免疫效果。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
紫外掃描儀、核磁共振儀、質譜分析儀、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDITOFMS);BSA、TR等購自Sigma公司;琥珀酸酐、三正丁胺、吡啶、異丙醇均由中國醫藥集團提供。
1.2 方法
1.2.1 TRHS的制備及鑒定
1.2.1.1 群勃龍結構的修飾
于燒瓶中加入500 mg TR和1 000 mg琥珀酸酐,然后加入2 ml吡啶溶解,80℃攪拌反應3 h。反應液冷卻至室溫,調整其pH為3.0,得棕黃色黏稠物,過夜后變硬。用熱的異丙醇重結晶提純,紅外燈烘干即為TRHS(圖1)。
1.2.1.2 修飾物的鑒定
采用質譜法對其相對分子質量進行預測,并用核磁共振鑒定。
1.2.2 TR的抗原性修飾
1.2.2.1 混合酸酐法[4]
TRHS與BSA按摩爾比100∶1反應。取TRHS 5.5 mg 溶于2 ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,置4℃冰箱中預冷10 min,于冰浴磁力攪拌,加入三丁胺30 μl,再加入氯甲酸異丁酯15 μl,然后將該溶液置4℃冰箱中反應1 h即為反應Ⅰ液;取20 mg BSA 溶于2 ml蒸餾水,溶解后于冰浴邊攪拌邊用1 mol/L NaOH 調pH為8.5制得Ⅱ液;邊攪拌邊將Ⅰ液緩慢滴加到Ⅱ液中,于4℃攪拌反應過夜。反應產物充分透析,即得TRBSA 偶聯物溶液,將其冷凍干燥保存。
1.2.2.2 對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺
[3mercaptopropionic acid, 1ethyl3(3diethylaminopropyl) carbodiimide,EDC]法[5] TRHS與BSA按摩爾比100∶1反應。取TRHS,N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),EDC按摩爾比1∶1∶1溶于1 ml DMF,混勻后于4℃下活化1 h,此為反應Ⅰ液;取10 mg BSA 溶于3 ml雙蒸水中,加DMF 0.5~1.0 ml混勻, 4℃預冷20 min,得Ⅱ液;邊攪拌邊將Ⅰ液緩慢滴加到Ⅱ液中,于4℃攪拌反應過夜。反應產物充分透析,即得TRBSA 偶聯物,冷凍干燥保存。
1.2.3 TRBSA免疫家兔
將制備的TRBSA用完全福氏佐劑常規法免疫家兔,獲得的免疫血清用ELISA間接法和雙向免疫擴散測定特異性抗血清效價,分析其免疫原性并判斷免疫效果。
2 結果
2.1 群勃龍的化學修飾與修飾物鑒定
修飾產物質譜分析相對分子質量為370,IR(KBr)υmax:3300, 1738 cm-1;1H NMR(400 MHz, CDCl3, rt): δ=0.96(s, 3 H, CH3), 1.32(m, 1 H, CH2), 1.54(m, 3 H, CH2), 1.61(m, 1 H, CH2),1.93(d, 1 H,J=12.4 Hz, CH2), 2.27(m, 1 H, CH2), 2.44~2.60(m, 5 H, CH2), 2.69~2.72(m, 4 H, CH2), 2.86(m, 2 H, CH2), 4.84(t, 1 H, J=7.6 Hz, OCH), 5.81(s, 1 H, CH),6.36(d, 1 H, J=9.6 Hz, CH), 6.44(d, 1 H, J=10.0 Hz,CH),氫為25(圖2),由于羧基的氫活性太強故未出峰,13C NMR所示碳原子數為22個,各根值與理論值相符(圖3)。
2.2 TRBSA的制備
2.2.1 偶聯物的紫外光譜及偶聯比[3]
紫外/可見分光光度儀對BSA進行掃描測定,可見BSA最大吸收峰在278 nm處,TRHS最大吸收峰在353 nm處,混合酸酐法偶聯物的峰形發生明顯變化,278 nm吸收峰明顯降低,且在340 nm處吸收值明顯增大,說明偶聯是成功的(圖4);由圖5可見EDC法偶聯物的峰形也發生明顯變化,278 nm吸收峰明顯降低,且在343 nm處吸收值明顯升高,說明偶聯也是成功的(圖5)。
按文獻[7]估算偶聯比率,選擇20%乙醇為溶劑并以之調零。混合酸酐法:TRHS濃度為0.035 mg/ml,BSA濃度為2 mg/ml,結合比約為1∶18;EDC法:TRHS濃度同混合酸酐法,BSA濃度為1.9 mg/ml,結合比約為1∶12。
2.2.2 BSA,TRBSA相對分子質量
用MALDITOFMS儀檢測BSA和混合酸酐法制備的TRBSA,兩者的相對分子質量分別為67 146和74 471(圖6)。由此估算偶聯比率為20.8。
2.3 TR特異性抗血清效價測定結果
TRBSA免疫的家兔血清,經ELISA測得TR特異性抗體效價為1∶320 000;雙向免疫擴散測得的抗血清效價為1∶16。
3 討論
群勃龍(TR)是在畜牧業養殖中經常使用的一類人工合成的類固醇激素,這類激素的濫用對人和畜的健康、社會和生態環境造成直接和潛在的威脅。因此,20世紀80年代以后許多國家明令禁止在牲畜的飼養中使用這類激素,但由于利益的驅動,世界范圍仍有許多TR等類固醇激素在使用。國內外關于尿、血、組織中檢測到TR等類固醇激素殘留的報道很多[2, 6,7]。目前關于TR殘留量的檢測方法主要依賴于質譜技術。但質譜技術不適用于基層檢驗檢疫部門快速的篩選檢測。
本研究將TR與琥珀酸酐反應并對反應產物TRHS的性質和純度進行鑒定。經磁共振及質譜分析,相對分子質量、氫譜、碳譜均符合TR結構式,并對修飾產物磁共振氫譜、碳譜與軟件所預測的理論值進行了比較,結果顯示完全一致,由此認為本研究所采用的TRHS合成方法是一種實用、有效的TR修飾方法。鑒定后的修飾產物采用混合酸酐法及EDC法與BSA偶聯。在混合酸酐法實施過程中,嚴格控制反應Ⅰ液無水,Ⅰ、Ⅱ液混合時遵循Ⅰ液加入Ⅱ液,以使有機溶劑得以稀釋。此外,在試驗過程中,溫度的嚴格控制可保證蛋白質性質。而在EDC法實施過程中,要嚴格控制EDC使用量[4,5],因為EDC與羧基反應所形成的氨基反應活性中間體(O酰基脲)很不穩定,在水中會很快水解釋放出羧基以及N酰基化脲。過量的EDC產生的N酰基脲會結合在蛋白疏水區域的羥基上,導致蛋白自交聯。NHS的介入,可保持水溶液中中間體的穩定,使整個偶聯反應分成獨立的兩步反應[7],從而保證偶聯效果。
理想的偶聯比率與準確的偶聯物相對分子質量的測定,是構成免疫原性的要素[8]。本研究使用MALDITOFMS預測偶聯物相對分子質量,具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點,是生命科學領域一種強有力的分析測試手段,并正扮演著越來越重要的作用[9]。MALDITOFMS分析可直觀測得偶聯物相對分子質量,并通過計算獲得其偶聯比率。但該法所需設備昂貴,基層單位難以開展。
采用經上述方法作抗原性修飾后的TR免疫家兔并用ELISA和雙向免疫擴散檢測其抗血清效價,結果表明TR被賦予了明顯的免疫原性,兩種方法測得的抗TR特異性抗血清效價分別為1∶320 000和1∶16。TR免疫原性修飾的成功,為進一步制備TR單克隆抗體和建立特異性免疫學檢測方法奠定了基礎,為食品或其他物品中TR殘留量的分析開辟了簡便、特異、快速、敏感的途徑,可從源頭上監測、控制含有TR等類固醇物質食品的擴散。
參考文獻
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