CRISP家族成員生物學功能的最新進展分析

前言：本站為你精心整理了CRISP家族成員生物學功能的最新進展分析范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

哺乳動物中crisp的生物學功能

CRISP在哺乳動物中分布比較廣泛,繼有學者在哺乳動物附睪中發現酸性附睪蛋白后,相繼又在哺乳動物生殖系統中發現了大量CRISP成員。這些CRISPs之間序列同源性高達40%~80%,而且都分布于外分泌腺體中。依據組織特異性和序列同源性CRISPs可分為CRISP-1,CRISP-2,CRISP-3和CRISP-4四類[4]。

CRISP-1CRISP-1主要分布于睪丸中[1],由各種哺乳動物的附睪分泌。根據所屬物種的不同,CRISP-1通常在大鼠中被稱為附睪蛋白(DE),在小鼠中被稱為酸性附睪糖蛋白(AEG),以及在人類中被稱為AEG相關蛋白(ARP)[1]。Cohen等[2]和Roberts等[5]研究發現,CRISP-1于精子獲能過程中釋放。在精子獲能和隨后誘導的精子頂體反應期間,與精子頂體區域結合的CRISP-1能夠遷移到赤道部分從而參與精卵融合。此外,也有研究報道CRISP-1首先可與精子卵透明帶發生相互作用,隨后通過與卵細胞補充位點的結合從而促進配子融合。但是,過量的外源CRISP-1卻能夠阻斷精卵的結合[6]。Busso等[7]和Roberts等[8]證實,在精子獲能期間CRISP-1能夠抑制大鼠精子蛋白酪氨酸的磷酸化以及孕酮誘導的精子頂體反應。這意味著CRISP-1能夠抑制精子獲能過程,因此被視為去獲能因子。進一步的研究結果表明了CRISP-1是通過具有離子通道調節活性的CRD結構域來擔任去獲能因子的角色的[2]。此外,Cohen等[6]研究還發現,CRISP-1對精子質膜的穩定也起著非常重要的作用。總而言之,CRISP-1在受精過程中是一種多功能蛋白,參與多種重要的生理學過程。

CRISP-2CRISP-2又稱為睪丸特異精母蛋白(testisspeci-ficprotein1,TPX-1),其組織特異性很高,主要在人、大鼠和豚鼠精子的頂體和尾部表達[9-10]。近年來研究表明,精母細胞可通過表達和分泌CRISP-2,從而調節精子細胞與支持細胞(sertolicell)的連接。Gibbs等[11-12]研究發現,CRISP-2不僅能夠通過CRD結構域來調控心肌RyR(ryanodinereceptor)通道的活性而引起Ca2+的變化,還能與MAP3K11(MAPkinasekinasekinase11)修飾蛋白結合。在MAP3K11修飾蛋白的作用下,CRISP-2發生磷酸化,從而參與精子頂體發育的過程。2008年,Jamsai等[13]報道CRISP-2還可與配子發育蛋白1(gametogenetin1,GGN1)結合形成CRISP2-GGN1復合物,該復合物在精子尾部重組和運動中也發揮著重要作用。與CRISP-1的功能相似,CRISP-2也能夠參與精卵融合的過程[14],這說明不同的CRISP也可能具有相似的功能。

CRISP-3CRISP-3又稱SGP28(specificgranuleproteinof28kDa),是一種特殊的、分子量為28kDa的顆粒蛋白。CRISP-3首先是在人類中性粒細胞中發現的。Laine等[15]和Kratzschmar等[16]在人類的唾液腺、胰腺、前列腺中也發現了高表達水平的CRISP-3mRNA,但是在附睪、卵巢、結腸中CRISP-3的表達水平則較低。此外,Bjartell等[17]在人類組織液,如唾液、汗液、血液和精漿中,也檢測到了分泌的CRISP-3蛋白。近年來有研究報道,晚期前列腺癌病人在睪丸切除后血清中CRISP-3濃度下降,推測CRISP-3的表達可能與雄性激素受體功能相關。2010年,Pathak等[18]報道,CRISP-3能夠與人類精漿中含有94個氨基酸的前列腺分泌蛋白(prostatesecretoryproteinof94aminoacids,PSP94),也被稱為β-微精原蛋白(β-microseminoprotein,MSP)發生相互作用。在前列腺腫瘤中,PSP94的表達水平表現出明顯的降低,甚至消失,而CRISP-3的表達水平則明顯增高。由于在某些病理過程中,CRISP-3的表達水平發生明顯的改變,因此可作為某些疾病的理想標記物[19]。研究發現,在子宮內膜、腎上腺上皮癌癥細胞以及慢性胰腺炎病人的胰腺細胞中,CRISP-3會有定量的過表達,這意味著CRISP-3不僅在組織炎癥和免疫應答過程中發揮重要作用,還被認為是宮外孕、前列腺癌以及慢性胰腺炎的一種潛在生物標記物。近年來,有文獻報道,源自中性粒細胞的CRISP-3與某些參與植物抗菌防御相關蛋白的序列同源性較高。因此,推測其在先天免疫防御上也發揮著重要作用[1]。

CRISP-4CRISP-4是CRISP家族最新的成員,主要以雄性激素依賴的方式由附睪上皮細胞分泌[20]。此外,在其他組織,如精囊、胸腺、脾和骨骼肌中,CRISP-4表達水平較低[21-22]。系統發育分析結果表明,鼠源CRISP-4與人源的CRISP-1直系同源(圖3)[21]。研究發現,CRISP-4在精子成熟以及精卵相互作用等方面發揮著重要作用。然而,到目前為止CRISP-4參與配子相互作用時的具體分子作用機制還尚未見報道。近年來研究報道,存在于人類和小鼠精子表面的瞬時受體電位M8(transientreceptorpotentialM8,TRPM8)發生激活后能抑制由孕酮誘導的精子發生頂體反應。2011年,Gibbs等[23]通過膜片鉗技術證實CRISP-4能抑制TRPM8的激活。雖然CRISP-4敲除的小鼠具有正常的交配能力且能生育,但CRISP-4敲除小鼠的精子受孕酮誘導后發生頂體反應的能力要明顯低于野生型。由于CRISP-4在男性生殖道中表達水平較高,并且在精子成熟和受精過程中發揮著重要作用,因此在男性不孕藥的研發及不孕癥的治療上,CRISP-4蛋白可被視為非激素男性避孕的藥物靶點。

無脊椎及低等脊椎動物CRISP的生物學功能

1蛇毒CRISP蛋白

蛇毒分泌液中富含大量CRISP蛋白,關于CRISP蛋白作用機制及分子結構的研究多半來源于對蛇毒CRISP家族成員的研究。研究發現,蛇毒CRISP家族成員對多種離子通道,如Na+、K+、Ca2+通道以及環核苷酸門控通道(cyclicnucleotide-gatedionchannel,CNG)等具有阻斷作用。

1.1CNG通道阻斷劑環核苷酸門控離子(CNG)通道是非選擇性的陽離子通道,在調節視網膜光感受器和嗅覺神經元的感覺傳導中發揮著重要作用。到目前為止,Yamazaki等[24]和Brown等[25]已分別從澳大利亞眼鏡蛇科的棕伊澳蛇(Pseudechisaustralis)和澳大利亞南部紅腹伊澳蛇(Pseudechisporphyriacus)的毒腺中分離出CNG通道蛋白阻斷劑Pseudechetoxin(PsTx)和Pseudecin(Pdc)。其中,PsTx是眼鏡蛇屬中發現的第一個CRISP家族成員。序列分析結果表明,PsTx和Pdc為CRISP蛋白家族成員,具有較高的同源性。電生理實驗結果證實,PsTx和Pdc均能阻斷視網膜光感受器和嗅覺神經元的感覺傳導,但是PsTx對嗅覺神經元和視網膜光感受器CNG通道的親和力比Pdc要高出15~30倍。晶體結構分析結果顯示,PsTx和Pdc蛋白PR-1結構域和CRD結構域之間凹面的氨基酸序列明顯不同,這說明結構域間凹面對PsTx和Pdc與CNG通道的結合具有重要的作用[26]。此外,PsTx和Pdc還含有一個Na+結合位點,但具體功能未知,推測其可能對高級結構的穩定具有重要作用。

1.2Na+通道阻斷劑鈉離子通道是細胞質膜上的一種跨膜糖蛋白,通常由三個亞基組成。鈉離子通道主要選擇性允許Na+跨膜通過,其主要功能是維持細胞興奮性及其傳導,對可興奮細胞如神經元、心肌細胞、骨骼肌細胞和內分泌細胞等在動作電位的產生和傳播中發揮重要作用。2008年,Suzuki等[26]研究發現,蛇毒PsTx和蛇毒Pdc的結構中含有一個Na+結合位點,即Ser73、Gln74以及Ser128。但是,尚未在其它蛇毒CRISP家族成員的結構中發現Na+結合位點,推測可能與Gln74被其它的氨基酸殘基替代有關。目前,關于Na+通道的報道還不夠完善,有待于進一步探究。

1.3K+通道阻斷劑鉀離子通道是生物體中最基本的功能蛋白之一,對鉀離子有高度離子選擇通透性,在生理過程中發揮著重要的作用。Tu等[27]從中國臺灣的中華眼鏡蛇(Najaatra)和竹葉青蛇(Trimeresurusstejnegeri)的毒腺中分別分離純化出具有K+通道阻斷功能的CRISP家族成員—natrin和stecrisp。序列分析結果表明,natrin和stecrisp的同源性較高。Natrin是由221個氨基酸構成的蛇毒蛋白,分子量為25kDa。免疫沉淀實驗結果表明,natrin可以與來自骨骼肌的蘭尼堿受體1(ryanodinereceptor1,RyR1)結合[28]。此外,natrin能抑制蘭尼堿與RyR1的結合,同時抑制RyR1鈣通道的激活。電生理實驗表明,natrin可以引起高鉀誘導的離體小鼠胸主動脈的收縮,但對其基礎張力沒有任何影響。黃燕軍等[29]研究證實,natrin能夠抑制大鼠肝臟脂質過氧化作用。此外,natrin還能夠誘導胃癌MGC-830細胞發生凋亡。Stecrisp也是由221個氨基酸構成,但是其表觀分子量在不同條件下是有差異的。有文獻報道,純化后的stecrisp的表觀分子量在變性凝膠電泳中為24kDa,在還原狀態下為28kDa。這種差異表明,stecrisp分子中可能存在穩定結構的二硫鍵。與natrin的多樣性功能相似,stecrisp也具有多種功能,能夠在精卵融合、先天宿主免疫以及阻斷離子通道等方面發揮重要作用[3]。

1.4Ca2+通道阻斷劑鈣離子通道廣泛存在于各種生物組織的細胞膜中,參與神經遞質的釋放和心肌的活動等。到目前為止,已有科研團隊陸續從蛇毒中分離純化出多種具有Ca2+通道阻斷功能的CRISP家族成員,如ablomin(Agkistrodonblomhoffi)、triflin(Trimeresurusflavoviridis)、latisemin(Laticaudasemifasciata)、piscivorin(Agkistrodonp.piscivorus)、ophanin(OphiophagusHannah)以及catrin-2(Crotalusatrox)。序列分析結果表明,這些Ca2+通道阻斷劑的同源性較高,且半胱氨酸殘基的位置相對保守。電生理實驗結果表明,這些富含半胱氨酸分泌蛋白能夠通過阻斷Ca2+通道從而抑制老鼠尾部動脈平滑肌的收縮,但是對由咖啡因誘導引起的收縮則無明顯抑制作用。其中,ablomin、triflin、latisemin具有較高的Ca2+通道抑制活性。

1.5炎癥調節功能2011年,Wang等[30]研究發現,CRISP作為炎癥調節因子在機體內發揮重要作用。實時定量PCR和流式細胞儀檢測結果表明,來源于Najaatra毒腺的natrin能夠以依賴硫酸乙酰肝素和Zn2+的方式,通過激活MAPK和NF-κB通路來誘導血管內皮細胞上黏著分子、細胞間黏附分子-1(intercelluaradhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)以及E-選擇素(E-selectin)表達水平的上調,從而達到最終促進人單核細胞U937黏附于血管內皮細胞的目的。因此,natrin作為免疫調節因子能夠在傷口治愈過程中發揮重要作用。

2HelothermineHelothermine(HLTX)是第一個在爬行動物中發現的CRISP家族成員,主要分布于墨西哥串珠蜥蜴(Helodermahorridum)的唾液腺中。HLTX與其它的CRISP家族成員一樣,也是單鏈蛋白,由223個氨基酸組成,分子量約為25kDa,能夠阻斷多種離子通道,包括電壓門控型Ca2+通道,電壓門控型K+通道,以及蘭尼堿受體(Ryanodinereceptor,RyR)等[31]。體內實驗研究表明,小鼠被持續注射HLTX后,會出現嗜睡、后肢局部癱瘓以及體溫下降等癥狀,這表明HLTX是一個低溫毒素。

3AllurinAllurin是通過分離純化兩棲動物—非洲爪蟾(Africaxenopus)卵膠膜的裂解物而得到的富含半胱氨酸蛋白家族成員,由184個氨基酸組成,分子量為21kDa。Allurin是第一個在雌性生殖道中發現的CRISP家族成員,與哺乳動物CRISP蛋白家族具有較高的序列同源性。通常CRISP蛋白由三個結構域組成,而allurin則僅含有PR-1結構域和鉸鏈區,缺少C末端的離子通道調節結構域[32]。Sugiyama等[33]研究發現,allurin通常以穩定的多聚體形式存在,且這種多聚體不能被SDS和β-巰基乙醇破壞。同哺乳動物精子結合蛋白的功能相似,allurin具有精子引誘蛋白(spermchemoattractantprotein)的功能,能夠在精子發育的不同生命時期與精子結合,幫助其從一個發育時期進入到下一個發育時期[34-35]。

4CRBGP(cysteine-richbuccalglandprotein)CRBGP是從日本七鰓鰻(Lampetrajaponica)口腔腺中分離純化出的一種新型富含半胱氨酸分泌蛋白,其因與CRISP家族成員具有高度同源性,同樣具有16個高度保守的半胱氨酸殘基,因此將其命名為富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白(cysteine-richbuccalglandprotein,CRBGP)。這是首次在原始無頜類脊椎動物中發現的CRISP家族成員。Xiao等[36]已經從七鰓鰻口腔腺中分離純化出分子量為26kDa的天然CRBGP。Chi等[37]研究發現,七鰓鰻來源的CRBGP是Na+通道阻斷劑,能夠阻斷海馬神經元和背根神經元的Na+電流,降低神經元動作電位的頻率和振幅,并引起時程延長。此外,Chi等[37]發現CRBGP對海馬神經元的K+通道也具有阻斷作用。與此同時,Ito等[38]也發現,來源于七鰓鰻的CRISP(CRBGP)能夠抑制去極化引起的小鼠平滑肌收縮,并且推測CRBGP對Ca2+通道也具有阻斷作用。不過仍需電生理實驗進一步證明。此外,CRBGP還具有免疫調節活性,能夠抑制fMLP誘導的中性粒細胞遷移。因此推測,七鰓鰻來源的CRBGP具有多種生物學功能,很有可能在七鰓鰻吸血食肉的過程中阻斷宿主魚體的疼痛反應以及免疫反應等。

5Tex31Tex31是從軟體動物—織錦芋螺(Conustextile)的毒液中分離純化出的一種新型CRISP家族蛋白,分子量約為31kDa,含有22個半胱氨酸,是目前發現的CRISP家族蛋白中半胱氨酸含量最多的成員。Tex31具有類似于絲氨酸蛋白酶的蛋白水解酶活性,能夠水解加工芋螺毒腺中以前體肽形式分泌的多種神經活性肽。這些神經活性多肽經Tex31剪切去除前體肽后具有生物學活性。此外,Guo等[3]和Cohen等[4]發現,由于Tex31的PR-1結構域中含有暴露的保守殘基(His60、Glu75、Glu96和His115),因此推測其他PR-1蛋白也可能會具有蛋白水解活性。

應用展望

CRISP蛋白家族成員在哺乳動物和非哺乳動物中組織分布比較廣泛,具有非常多樣的生物學功能,不僅在精子成熟、精卵融合、免疫防御、多種類型離子通道調控等方面都發揮著重要的作用,還在臨床疾病的檢測預防以及治療等方面也具有良好的應用前景。此外,由于CRISP大多通過與細胞膜上受體結合而發揮作用,若開發為藥物可避開入膜的問題。本課題組在研究最古老的脊椎動物七鰓鰻時,發現其口腔腺中含有大量的CRISP,能夠抑制海馬神經元和背根神經元的Na+電流,以及神經元動作電位的頻率[39]。因此,推測七鰓鰻口腔腺中含有的CRISP蛋白很可能是一種局部麻醉抑制劑,能夠抑制宿主魚體的局部疼痛反應。然而,目前在國內關于此蛋白的功能研究還依然處于起步階段。對七鰓鰻CRBGP生物學功能的進一步研究可為今后開發新型鎮痛藥物奠定重要的理論基礎。綜上所述,CRISP無論是在闡明機體的生理功能,對疾病的分析和治療,還是在疾病的防治中都發揮重要的作用,對其深入的研究將具有較高的科學理論意義和應用價值。

作者：劉宇肖蓉楊東輝劉欣李慶偉單位：遼寧師范大學生命科學學院遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室