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      人IL-12對結腸癌干細胞生物學特性的影響

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      人IL-12對結腸癌干細胞生物學特性的影響

      1材料與方法

      1.1主要試劑及動物細胞培養液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重組表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF-2)均購于GIBCO公司。含綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體表達質粒(pGC-FU)購于GENECHEM公司,pORF-hil-12G2質粒購于InvivoGen公司,胰酶、DEPC、Tris堿、EDTA均購于Sigma公司,抗人CD133/PE抗體及抗人CD44/APC抗體購于BDPharmingen公司,BCA蛋白定量試劑盒購于ThermoFisherScientific,實驗用6-8W齡雌性裸鼠由第三軍醫大學實驗動物中心提供,由該中心負責飼養和管理。

      1.2培養、分離、鑒定結腸癌CSCs結腸癌SW480細胞株購于ATCC,在干細胞條件培養基中(不含胎牛血清的DMEM/F12培養基,含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF-2、1×B27和1%青鏈霉素)中篩選培養2周后,流式細胞儀分選出CD133+/CD44+SW480細胞作為結腸CSCs,分析其自我更新及分化。分選出的CSCs用干細胞培養基培養于37°C、5%CO2孵箱中,細胞增殖實驗、克隆形成能力、成球能力及NOD/SCID體內成瘤能力鑒定其“干性”特征[8]。

      1.3構建IL-12過表達慢病毒模型及轉染CD133+/CD44+SW480細胞PCR擴增含IL-12p70基因片段的pORF-hIL-12G2質粒獲得IL-12基因,通過酶切及連接構建重組IL-12/慢病毒質粒,取陽性克隆搖菌后行PCR鑒定,酶切鑒定及測序。鑒定正確的克隆搖菌擴大培養,用除內毒素大提試劑盒提取質粒DNA,293T細胞包裝病毒,IL-12/慢病毒顆粒感染CD133+/CD44+SW480細胞,穩定轉染的細胞稱為“慢病毒/IL-12細胞”[8]。

      1.4IL-12對結腸CSCs生物學性的影響1.4.1IL-12對結腸CSCs分化的影響(SP免疫組化試劑盒檢測CK20)為了觀察IL-12對結腸CSCs的體外分化能力的影響,我們取轉染IL-12過表達慢病毒質粒的細胞及未轉染的CD133+/CD44+SW480在條件培養基中形成的克隆細胞球,移入含10%胎牛血清培養基中連續觀察其生長情況,對兩組細胞進行免疫組化染色,顯微鏡觀察后照相。結果判斷:被測細胞胞漿染色黃-棕色為陽性表達。

      1.4.2IL-12對結腸CSCs克隆形成能力的影響將轉染IL-12過表達慢病毒質粒及未轉染的CD133+/CD44+SW480細胞計數后,調整細胞濃度。各取10000個兩組細胞分別接種6孔板中,加入適量條件培養基,5%CO2,37°C培養。每隔1天半量換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長情況,7d后終止培養。

      1.4.3IL-12對結腸CSCs侵襲性的影響實驗分組:慢病毒/IL-12轉染組;空載體轉染組;未轉染組(即空白對照)。使用前水化Matrigel基質膠,然后基質膠包被Transwell小室,置于37°C,5%CO2細胞培養箱中孵育。薯蕷皂甙元處理后24h接種細胞,1×104/ml細胞分別接種基質膠包被的小室,無血清培養基培養的細胞加入上層小室,含10%胎牛血清的完全培養基培養的細胞加入下層小室,將小室置于無菌24孔板中,加入250μl培養基。下室加入500μl培養基,5%CO2,37°C靜置培養48h。取出小室,PBS輕輕淋洗,用棉頭拭子小心移走膜上層的細胞,95%乙醇侵入到膜下層的細胞40min。PBS淋洗3次,蘇木素染色。倒置顯微鏡(×200)下計數微孔膜下層的細胞,每孔隨機選擇5個視野,計數每個視野細胞數目,每個實驗重復3次。14.4IL-12對結腸CSCs體內腫瘤形成能力的影響動物實驗遵循第三軍醫大學臨床學院倫理要求(批準號ID,SCXK(軍隊)2007015)。6-8周雌性NOD/SCID小鼠培養于無菌環境中,慢病毒感染后48h,NOD/SCID小鼠(n=15)皮下注射慢病毒/IL-12細胞5×103,或空載體轉染的結腸CSCs5×103。接種后觀察小鼠毛色、食欲、大小便等基本生命狀況,30d后評估腫瘤形成。試驗結束后切取腫瘤組織,稱重并作相應檢測,游標卡尺測腫瘤長短徑,腫瘤體積=長×寬2。

      1.5IL-12抑制CD133+CD44+SW480細胞生存機制研究

      1.5.1Westernblot檢測結腸CSCs轉染前后STAT6、p-STAT6、survivin、IL-12和IL-4蛋白表達蛋白抽提試劑盒-II提取細胞上清液總蛋白,濃縮上清至原體積的1/30~1/10,蛋白樣品按照1:4的比例加入5×上樣緩沖溶液,100℃變性5min,分裝。BCA法測蛋白濃度,酶標儀測定550nm處吸光度值。繪制標準曲線,根據標準曲線計算樣品濃度。SDS-PAGE垂直電泳,200mA恒定電流轉膜80~90min。抗原-抗體反應及化學發光法顯色,BIO-RAD凝膠成像分析系統掃描及圖像分析,相對灰度值表示蛋白相對含量。

      1.5.2IL-12對結腸CSCs凋亡的影響收集轉染后各組細胞,PBS洗2次,1000r/min,離心5min,棄上清。用不含EDTA的消化液消化貼壁細胞。收集的各組細胞加入500μl結合緩沖液中重懸細胞,再加入適量AnnexinV-FITC和PI,同時設置陰性對照和補償對照(分別單染),室溫避光孵育20min。1000r/min,離心5min,棄上清,加入500μl結合緩沖液重懸細胞,流式細胞儀測定每個樣本中凋亡細胞所占百分比,每個實驗重復3次。腫瘤抑制率=對照組瘤重-治療組瘤重/對照組瘤重×100%。1.6統計學方法計量資料數據以x±s表示,兩組間比較采用t檢驗,使用SPSS13.0軟件進行統計。

      2結果

      2.1慢病毒-IL-12質粒構建及在CD133+/CD44+SW480細胞中表達前期結果證實慢病毒-IL-12表達質粒構建成功,慢病毒/IL-12細胞上清液高表達IL-12mRNA和蛋白[7],為我們進一步探究IL-12體內作用及機制打下基礎。

      2.2結腸CSCs過表達IL-12對腫瘤球形成能力、侵襲性及分化的影響將CSCs懸浮于無血清的干細胞培養液中,腫瘤球形成后光學顯微鏡觀察腫瘤球數量,結果顯示IL-12降低了結腸CSCs腫瘤球形成能力,轉染慢病毒-IL-12的CSCs不能形成明顯的腫瘤球(圖1A)。但使用IL-12抗體阻斷后能恢復腫瘤球形成(圖1B)。空載體轉染的SW480CSCs形成的腫瘤球更大更緊密(圖1C),但正常結腸細胞WM35不能形成腫瘤球(圖1D)。另一方面,與對照組相比(圖2B),IL-12增加CSCs分化標志CK20表達(圖2A)。與SW480CSCs相比,慢病毒/IL-12轉染CSCs的侵襲性降低40%(表1)。

      2.3IL-12抑制NOD/SCID小鼠原發腫瘤生長研究發現慢病毒/IL-12減緩了CSCs腫瘤生長。慢病毒/IL-12轉染的CSCs形成的腫瘤體積顯著低于對照組[(189±21)vs(1785±32)mm3,P<0.05],質量顯著輕于對照組(P<0.01)。

      2.4IL-12減緩結腸CSCs增殖,促使其凋亡IL-12轉染也影響細胞凋亡及增殖。流式細胞分析顯示,慢病毒/IL-12形成的腫瘤細胞周期發生改變,G1期細胞增加[(68.8±3.6)%vs(52.4±2.8%)],而S期細胞降低[(22.6±2.8)%vs(38.6±4.1%)](圖5A),與對照組相比,凋亡細胞數量明顯增加[(45.2±5.6%vs(4.1±1.2%)](圖6B)。

      2.5結腸CSCs表達IL-4和STAT6,IL-12抑制IL-4/STAT6信號途徑Westernblot結果顯示,CSCs表達IL-4升高,表明CSCs內存在IL-4自分泌信號。值得注意的是,CSCs內STAT6被激活。慢病毒/IL-12降低IL-4/STAT6及survivin產生(圖4)。

      3討論

      結腸癌是常見的惡性腫瘤之一,隨著人們生活水平提高,飲食結構改變,其發病率有增加趨勢,尤其在發達國家及發展中國家。直至目前,結腸癌主要的治療手段仍是手術切除,且手術較其他治療效果更佳,尤其是早期腫瘤,但腫瘤轉移及復發仍是晚期患者治療失敗的主要原因。最近研究表明,CSCs能夠始發免疫缺陷小鼠腫瘤生長[1-2],并與腫瘤轉移及復發相關。從理論上講,靶向CSCs治療能夠徹底消除腫瘤復發及轉移,因此靶向CSCs的腫瘤治療策略將比目前的傳統治療方法更有效的根治腫瘤,減少復發和轉移的發生率,為腫瘤的靶向診治提供了新靶標,為根治腫瘤帶來了新希望[14]。免疫抑制仍是多數預期較好的腫瘤治療手段的主要障礙,而細胞因子失衡是機體免疫功能紊亂的主要原因,并導致腫瘤進展及復發[15]。關于細胞因子的抗瘤免疫反應相關研究包括IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等,已有研究表明,IL-12能有效地增多種腫瘤的抗瘤免疫反應,但IL-12對CSCs生存及侵襲性的作用并不清楚。本研究報道IL-12低水平表達/不表達與結腸癌進展的相關性,證實IL-12對直接限制CSCs惡性表型的潛在益處。本研究中,我們成功構建含IL-12cDNA的重組慢病毒質粒,用包裝病毒的工具細胞293T細胞包裝純化后,獲得較高滴度的病毒顆粒,將其轉染CD133+/CD44+SW480細胞,慢病毒/IL-12細胞高表達IL-12mRNA及蛋白,說明穩定轉染IL-12的結腸CSCs系建立,同時也證明慢病毒作為基因研究的載體具有低毒、高效的優勢。結果表明,IL-12損害干性維持部分是因為抑制CSCs增殖;而且,IL-12降低分化標志CK20表達,證實IL-12介導促進分化的信號通路;與SW480細胞相比,慢病毒/IL-12細胞的侵襲性降低了約40%,表明IL-12顯著抑制CSCs侵襲性。

      本研究發現,與轉染空載體的CD133+/CD44+SW480細胞相比,慢病毒/IL-12降低CSCs腫瘤形成,慢病毒/IL-12皮下注射明顯減少腫瘤體積及重量,抑制腫瘤微血管形成,促進腫瘤局部缺血壞死,與對照組相比,IL-12轉染組的腫瘤增殖細胞減少,而凋亡細胞增加,這些發現證實慢病毒/IL-12能夠降低結腸癌移植瘤生長,也許對結腸癌患者有益。IL-12促進CSCs凋亡,降低細胞自我更新及結腸癌移植瘤生長的機制并不清楚,最近研究表明“干細胞”自分泌IL-4,抵抗細胞凋亡,我們研究證實,CSCs高表達IL-4和p-Stat6。綜上所述,結果表明結腸CSCs中存在IL-4和p-Stat6信號通路,與對照組相比,IL-12使結腸CSCs分泌IL-4蛋白降低60%,而且,IL-12影響CSCs凋亡及增殖。盡管我們的數據支持IL-12水平和CSCs及腫瘤生長之間的逆反關系,與對照組相比,IL-12明顯降低結腸CSCs分泌IL-4和p-Stat6蛋白,其潛在機制仍需進一步研究。

      作者:尹曉玲陳應果張建紅周先云陳華俊趙銀晶梁后杰單位:重鋼總醫院腫瘤科重鋼總醫院普外科重鋼總醫院病理科

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