糖生物學中的相關概念
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1糖及其復合物的結構與功能特點
糖結構的復雜程度和信息存儲量遠高于核酸及蛋白質，糖鏈中糖基本身結構及其連接方式不同，糖復合物中糖基化的位點與數目不同，其合成不具備模板屬性而是依賴于糖基轉移酶及糖苷酶。糖結構的多樣性和復雜性并不完全由相關酶的基因決定，其還受不同細胞中酶濃度的影響，依賴于遺傳學與局部環境的相互作用。糖組成了核酸發揮其功能所需的線性骨架，DNA與RNA均有含磷酸連接的多核糖核心成分。糖亦是蛋白質不可缺少的物質，哺乳動物中幾乎所有分泌性蛋白、細胞表面蛋白都含有大量共價鍵相連接的糖鏈，可影響蛋白質的構象及功能。其中，依據糖鏈與蛋白質骨架的連接屬性可分為N-糖鏈(GlcNAc-Asn-X-Ser/Thr)、O-糖鏈(GalNAc-Ser/Thr)和GPI-錨連的糖鏈(蛋白質C端-磷酸乙醇胺-糖磷酸肌醇)[2]。由此可見，核酸與蛋白質的結構維持及功能發揮均離不開糖類，而糖鏈的復雜結構賦予了其功能的廣泛性與多樣性。糖及其復合物參與機體各種生理及病理過程，包括發揮細胞間接觸與黏附的關鍵功能[3]，維持蛋白質結構的穩定性[4]，參與膜結構的形成[5]，及細胞內各種信號通路的產生與調節[6]。鑒于糖類特殊的異質性，對糖生物學功能整體復雜性的了解仍不多，但近十年來隨著各種研究技術與工具的不斷革新，尤其是糖芯片技術的發展，在全世界研究者的共同努力下已經使得通過對糖基化狀態進行調節而研究疾病機制并發展新型療法成為可能[7]。
2糖與免疫系統
2.1糖類抗原
免疫學的核心問題是機體識別外來入侵物質，并將其清除。糖類作為被免疫系統識別的重要抗原，其廣泛存在于多種病原體表面。如微生物的免疫原成分絕大多數為糖類或糖復合物，其中最普遍的是存在于細菌細胞壁中的肽聚糖[8]。此外，革蘭氏陽性菌細胞壁中的磷壁酸，革蘭氏陰性菌細胞壁外膜中的特異性脂多糖，以及某些細菌外層莢膜中的結構各異的多糖，病毒包膜中的糖蛋白，以及真菌細胞壁中的纖維素、幾丁質和甘露聚糖等多糖，均是重要的病原體相關分子模式(PAMP)，病原體利用其黏附并入侵到人體組織和細胞中，因而PAMP是免疫系統識別并啟動免疫反應的重要結構[8-9]。來源于植物的糖類也是一種抗原類物質，盡管目前研究較少，但已發現其中一些多糖作為免疫調節劑以天然免疫相關的細胞與體系為靶點[10]。人體中具有某些特殊的糖類抗原，無需免疫誘導即已經存在相應的抗體，其中研究較多的兩類分別與輸血和器官移植密切相關。如人體ABO血型的分類依據即為體內糖蛋白和糖脂中糖鏈非還原端的局部結構，且血型抗原不僅存在于血細胞表面，還存在于許多組織表面，由此拓展出組織-血型抗原概念。又如，研究發現豬等較高等哺乳動物體內含有一種二糖結構，即α半乳糖基-1,3半乳糖基，而人類基因中形成該二糖結構的酶的基因發生了堿基缺失而喪失了酶活性，因而無法合成此二糖。但此酶基因突變過程中卻產生了另一改變，即生成了抗此二糖的抗體，這種現象與ABO血型中的輸血排除反應類似，可造成物種間器官移植排斥反應[10]。
2.2免疫系統中與糖類相關的成分
免疫系統是研究糖類及其在生物學中作用的理想系統，因為糖類及其復合物幾乎在免疫學的每個環節均顯示出其重要性。所有細胞表面的免疫受體均是糖蛋白，包括模式識別受體(PRR)、主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ和Ⅱ類分子、趨化因子受體、細胞因子受體，以及T和B細胞受體，這些免疫受體分子中的糖鏈作用各異。例如，T細胞受體上的復雜性N糖鏈可控制T細胞受體信號的產生，防止T細胞過度激活[11]；專職抗原提呈細胞(APC)表面MHCⅡ類分子中的復雜性N糖鏈則參與其將細菌脂多糖抗原提呈給T細胞的過程[12]；此外，Toll樣受體(TLR)分子中糖基化區域的狀態直接影響天然免疫信號產生與傳遞[13-14]。除膜受體以外，免疫系統中還存在各種分泌性糖蛋白，包括抗體、大部分補體成分、關鍵性細胞因子及趨化因子。最近研究發現，IgG的Fc段與N-糖鏈連接后可調節該抗體的活性，如末端唾液酸化的抗體傳遞抑制性信號給免疫細胞，而末端無唾液酸時則傳遞激活信號[15-16]。機體攻擊和清除異物的重要補體系統中，除經典通路外，凝集素通路也至關重要，其中可溶性的甘露糖結合蛋白(MBL)與含有甘露糖的聚糖結合后可激活一個相關的蛋白酶，進而引發補體系統級聯反應[17]。淋巴細胞發育及歸巢過程亦有糖類密切相關。參與Notch信號轉導的蛋白分子糖基化的改變，如加入巖藻糖殘基，可介導T和B細胞的分化和譜系定型[18]。淋巴細胞的歸巢依賴于其表面黏附分子的選擇素家族，選擇素可與炎癥或感染鄰近區域中內皮細胞表面的特異性糖類結合，從而使細胞歸巢至所需的部位[19-20]。免疫系統中的細胞可表達和/或分泌多種糖類結合蛋白(GBP)，對于控制固有和適應性免疫具有關鍵作用[21]，包括C型凝集素受體(CLR)家族、結合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素(siglecs)及半乳糖凝集素(galectin)，主要通過識別修飾糖蛋白或糖脂的糖鏈而發揮功能[21]，其與體內的糖鏈結合并調節分子間的空間立體結構。因而參與了各種細胞反應機制，在天然免疫及適應性免疫反應中具有重要作用[22]。其中，CLR家族主要表達在樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞等APC上，且部分存在于NK細胞或內皮細胞表面[23]，其多數在胞質尾區具有內吞模序，在攝取糖基化抗原過程中發揮了重要作用[24-25]。CLR是鈣依賴性糖結合蛋白，其糖識別結構域(CRD)中的特異性氨基酸可與糖鏈及鈣離子相互協作[26]。CRD中含有Glu-Pro-Asn(EPN)氨基酸序列的C型凝集素，如樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整合素分子(DC-SIGN)、甘露糖受體(MR)、朗格漢斯細胞特異性蛋白(Langerin)及L-SIGN/DC-SIGNR，可特異性識別末端含有甘露糖和/或巖藻糖的糖鏈[27]。而CRD中含有Gln-Pro-Asp(QPD)序列的C型凝集素，如巨噬細胞半乳糖凝集素(MGL)和DC-ASGPR，則特異性識別末端含有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的糖鏈[28]。
Siglecs是免疫球蛋白樣凝集素家族的典型代表，屬于細胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族，其配體為含有唾液酸結構的糖復合物[29]。其又分為兩個亞類：一類分子結構相差較大(序列同源性約為25%~35%)，包括唾液酸黏附素(siglec-1)、CD22(siglec-2)、髓磷脂相關糖蛋白(MAG;siglec-4)，此類存在于所有哺乳動物中；另一類為CD33相關性siglecs，具有高度序列同源性(50%~90%)，在不同種類哺乳動物中表達不同(人體中的siglec-3、5、7~11、14，小鼠中的siglec-E、F、G、H)[30]。Siglecs家族為Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結構包含胞外區、跨膜區和胞內區，多數胞內區含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)或ITIM樣結構，可招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1或SHP-2，在信號轉導中發揮負性調節作用；另有小部分siglecs具有正性調節作用，可激活免疫細胞[29]。半乳糖凝集素屬于可溶性免疫調節蛋白，可能通過調節信號通路在胞內發揮作用，或作為生物活性調節介質在胞外發揮作用[31]，進一步可分為：典型半乳糖凝集素(galectin-1、2、5、7、10、11、13~15)，其只含有一個可被二聚體化的CRD；串聯重復序列半乳糖凝集素(galectin-4、6、8、12)，其單條多肽鏈中含有2個串聯的同源CRD；單個成員galectin-3，其獨有與非凝集素N-末端區域相連的CRD，負責凝集素寡聚化[32]。
3免疫反應中的糖生物學調控
3.1糖類在天然免疫中的作用
天然免疫系統是機體抵御外界的第一道防線，而糖類作為重要的信息分子，參與固有免疫的分子識別及病原體清除等過程，并在其中發揮重要的調控作用。在免疫反應的最初環節，GBP可通過識別細菌、真菌、病毒等病原體上的糖鏈而發揮PRR功能。如CLR家族成員中的DC-SIGN作為DC表面的特征性多功能性免疫分子，可結合大量的病原體，包括多種病毒(如HIV-1)、細菌(如結核分枝桿菌和幽門螺桿菌)、寄生蟲(如曼森血吸蟲)和真菌(如白色念珠菌)[33-34]，特異性識別其表面的糖鏈如甘露糖、Lewis抗原(Le)等。CLR的PRR功能與TLR相似，但TLR并不具備內吞功能，而CLR則在結合抗原后將其內吞并進一步加工以供MHCⅠ或Ⅱ類分子提呈[35]。此外，CLR亦通過串話調節TLR或Fc受體信號而發揮作用。CLR與特異性糖鏈結合后可能通過Syk或Raf-1通路產生信號[33,36-37]，其胞質尾區與信號模序連接或與信號復合體相關聯，進而引發胞內一系列信號級聯反應。如CLR家族成員中的dectin-1通過識別真菌表面β-聚糖結構而觸發Syk酪氨酸激酶信號并激活ERK和JNK介導的級聯反應，從而激活NF-κB[33,38]。又如DC-SIGN可識別結核分枝桿菌的ManLAM成分，經Raf-1介導的信號通路促進促炎細胞因子IL-6和IL-12等產生；而DC-SIGN與巖藻糖結合則啟動Raf-1非依賴性信號通路，誘導抗炎細胞因子IL-10等產生，并抑制促炎細胞因子[39]。表明病原體的各種糖鏈結構可經同一個CLR而觸發不同的信號反應過程。與CLR相似，siglecs也可介導胞吞作用及病原體識別功能。多種病原體均可自身合成或從宿主體內獲得唾液酸而表達唾液酸糖復合物，如空腸彎曲桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟球菌等，其通過“分子模擬”方式逃避宿主免疫系統攻擊，并與宿主siglecs結合而造成感染[40]。該種結合可引起宿主內吞病原體并增強抗原提呈功能以殺傷病原體，但亦可激活宿主細胞內ITIM基序抑制信號通路而抑制炎癥和免疫反應，因而siglecs具有正負調控作用[41]。Siglec-H被證實是漿細胞樣DC上的特異性內吞受體，其與大部分siglecs的差別是不含有ITIM，而是通過銜接蛋白DAP-12發揮作用，可攝取病毒等病原體并傳遞給胞內TLR，最終誘導抗病毒免疫反應[42]。NK細胞表面的抑制性受體siglec-7能特異性識別含有Neu5Acα2-8Neu5Ac糖鏈結構的復合物，可增強其與靶細胞的結合從而抑制細胞毒活性，如神經細胞表面就高表達該糖鏈結構而不易被NK細胞所殺傷[29]。半乳糖凝集素通常在胞內合成并儲存，一旦出現感染造成組織損傷時則由死亡細胞或活化的炎癥細胞釋放至胞外，作為PRR或免疫調節物質而在固有免疫反應中發揮關鍵作用，被認為是損傷相關分子模式(DAMP)，與PAMP共同觸發機體固有免疫防御系統。如galectin-3和9可識別利什曼原蟲表面的β-半乳糖苷而刺激機體的固有免疫反應，從而將病原體清除[32]。
3.2糖類在適應性免疫中的作用
固有免疫與適應性免疫系統相輔相成，共同執行機體的對外防御功能。糖類不僅在固有免疫防御機制中發揮重要作用而影響后續的適應性免疫反應，其還直接參與調控機體的適應性免疫反應，通過各種糖復合物識別及糖鏈的糖基化改變而對各種Th細胞亞群反應及B細胞功能等方面產生影響。不同類型免疫細胞表面的糖類組成各異，該種差異可導致免疫細胞亞群數量及功能發生變化，影響適應性免疫反應的類型與進程。例如，Th2細胞表面的α2,6-連接的唾液酸選擇性上調，而在Th1和Th17細胞表面則未見上調，此差異決定了這些T細胞亞群對于galectin-1的敏感性不同[43]。因此，在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中，缺乏galectin-1基因的小鼠體內Th1和Th17細胞特異性抗原選擇性擴增，且DC的免疫原性增加，導致各種自身免疫癥狀加重[43-44]。此外，效應CD4+和CD8+T細胞表面CD45中的GalNAc糖鏈，可被致耐受性APC表面的C型凝集素MGL識別，誘導細胞凋亡或增殖，從而使免疫應答保持在恰當的水平，發揮維持自身穩態的調節作用[45]。又如，DC能通過DC-SIGN識別并結合含有LewisB結構的巖藻糖修飾的卵清蛋白(OVA)而加強對OVA的抗原攝取能力，增加OVA特異性CD8+和CD4+T細胞的交叉提呈[46]；另外兩種MR特異性配體，即硫基LewisA或GlcNAc與OVA相連時，亦明顯增加MR對OVA的靶向攝取能力，從而增加了向OT-Ⅰ(OVA特異性)T細胞的體外交叉提呈，促進T細胞介導的適應性免疫反應[47]。Siglecs家族成員之一CD22，作為B細胞受體復合物的關鍵成分，其特異性結合以2-6連接的唾液酸-半乳糖為末端的糖蛋白，且自身亦發生糖基化改變，從而輔助抗原攝取過程及改變B細胞激活的閾值[48]。各種證據還表明N和O-糖鏈的糖基化可調節受體和配體之間的相互作用以影響各種信號的產生。如半乳糖凝集素通過結合或交聯受體中連接的特異性糖鏈而在多種細胞過程中發揮關鍵作用，包括調節細胞因子受體產生的信號，TCR介導的免疫突觸部位的激活，以及B細胞成熟過程中的BCR-整聯蛋白信號等過程[6,49]。此外，糖基化還可改變TCR激活的閾值。TCR中的糖鏈在N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶Ⅴ的作用下形成分支上的乳糖胺長鏈，可結合半乳糖凝集素而引發后續效應，包括T細胞凋亡、激活、分泌細胞因子等；而高濃度的N-乙酰氨基葡萄糖則可增加分支上的乳糖胺長鏈，抑制TCR激活，產生自身免疫應答[50]。
4糖生物學免疫調控與疾病
4.1炎癥性及自身免疫疾病中的糖生物學調控
如上述，糖類在病原體識別過程的重要作用已被公認，但關于糖及其復合物在控制免疫耐受、自身免疫反應及慢性炎癥中的作用仍相對較新，處于不斷研究與發展中。已有研究表明，在正常組織向炎癥組織轉變時細胞表面糖鏈的組成發生程序性重構[51]。由于白細胞及內皮細胞表面的糖鏈中多數存在唾液酸化和巖藻糖化的抗原表位(如sLeX)，其能與選擇素特異性結合，因而這些細胞表面糖鏈組成發生改變可影響白細胞從固有位置遷出并移動至炎癥部位的過程，使得在白細胞-內皮細胞接觸過程中，抑制選擇素與糖鏈的結合成為抗炎治療的一個具有前景的新靶點[52]。糖及其復合物可通過調控固有免疫機制而影響炎癥性和自身免疫疾病的發展。如缺乏α-甘露糖苷酶-Ⅱ(αM-Ⅱ，該酶能降解復雜性N-糖鏈)的小鼠可發生自身免疫疾病，類似于人類的系統性紅斑狼瘡[53]。其機制并不依賴于適應性免疫系統，而與固有免疫系統成分的慢性激活有關，即在αM-Ⅱ缺陷時原先隱藏的N-糖鏈暴露，導致內源性凝集素(包括MR)對其識別，并在無感染情況下異常激活固有免疫反應，因而發生狼瘡樣自身免疫疾病[53]。炎癥性及自身免疫疾病的發生發展與機體適應性免疫反應緊密相關，因而研究糖類對適應性系統的調控與自身免疫反應之間的相關性尤為重要。各種糖類通過與不同的GBP結合以增強或減弱DC、T細胞或B細胞區室中的致耐受性信號通路。其中，C型凝集素在調節炎癥和自身免疫疾病中具有重要作用。如研究發現，口服富含甘露糖的抗原能通過與黏膜固有層DC表達的C型凝集素SIGNR1結合，誘導口腔耐受并上調分泌IL-10的調節性T(Tr1)細胞數量，從而減輕全身過敏性反應[54]。同樣，在大鼠EAE模型中應用可溶性甘露糖化的髓磷脂肽后，可通過與未成熟DC表面甘露糖受體結合而導致T細胞活性受抑制，并減輕疾病癥狀[55]。Siglecs家族中，CD22可向B細胞傳遞抑制性信號，據報道siglec-G/CD22基因雙敲除的小鼠自發性產生B細胞依賴的自身免疫疾病，其特征為體內存在抗DNA和抗核抗體[56]。在一些炎癥性自身免疫疾病中，如系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎，效應T細胞表面的糖鏈可發生改變，尤其那些是暴露末端GalNAc和Gal-β(1-4)-GlcNAc糖鏈結構的細胞[57]，其與半乳糖凝集素相結合后能下調TCR信號，并改變CD45磷酸酶活性，從而實現對炎癥反應的調控[11,28,45]。此外，免疫球蛋白的不同糖基化狀態也可調節其生物學功能，影響自身免疫疾病的發展和緩解。例如在IgA腎病患者中，IgA鉸鏈區連接的O糖鏈發生唾液酸化及半乳糖苷化水平降低而暴露出GalNAc，導致腎小球腎炎中抗體沉積增多[58]。又如IgG的Fc段中存在末端含α2,6唾液酸的糖鏈，該結構可誘發DC-SIGN介導的Th2途徑，從而決定了靜脈注射用免疫球蛋白(IVIG)在多種自身免疫疾病中的抗炎功能[15]。
4.2腫瘤與糖生物學調控
腫瘤的發生發展與多種因素有關，除基因與蛋白質表達組成的異常外，腫瘤微環境中細胞的糖基化特征及凝集素組成可能是影響細胞形態功能與癌癥進展的另一途徑。腫瘤抗原普遍表現出糖成分的改變，其糖基化主鏈變短或發生重復的序列上糖表位的多價暴露，這些糖類可存在于蛋白質或脂質上，且其多價性常增加與GBP的親和力[59]。多數GBP并不是僅限于識別病原體，其還能與暴露的甘露糖/巖藻糖或GalNAc糖結構的自身蛋白相互作用[60]。某些腫瘤相關抗原(TAA)的糖基化狀態改變后可發生致癌轉變，如癌胚抗原(CEA)和黏蛋白(MUC)1。二者均表達在正常結腸黏膜與上皮細胞表面，其糖基化的改變包括Lewis抗原表達增加(尤其是LeX和LeY)常與腫瘤的不良預后相關[61]。盡管尚未完全了解該種翻譯后水平的糖基化調節促進腫瘤細胞播散及疾病進展的機制，但最近有研究發現DC能通過CLR(如DC-SIGN和MGL)識別CEA或MUC1上的異常糖基化結構，而這些CLR并不識別正常結腸組織的CEA或MUC1[61]。
越來越多證據表明，腫瘤可能利用凝集素與糖類的相互作用而逃避免疫反應[62]。其中半乳糖凝集素能在腫瘤生長和轉移部位創造免疫抑制性微環境，從而利于腫瘤發生發展[63]。腫瘤細胞分泌的galectin-1可通過對T細胞和DC進行調控而促進不同類型的腫瘤細胞產生對機體免疫系統的抑制效應，如黑色素瘤[64]、霍奇金淋巴瘤[65]、肺癌[66]、胰腺癌[67]和神經母細胞瘤[68]等，該種免疫抑制效應的機制涉及改變Th2細胞因子組成以及激活分泌IL-27的DC和Tr1細胞介導的耐受性信號通路[44,66]。此外，galectin-9的過表達導致CD11b+Ly-6G+抑制性粒細胞增多并抑制抗腫瘤免疫反應[69]，而galectin-3則與T細胞的功能缺陷有關[70]。最近研究發現了腫瘤免疫逃逸的新型糖基化依賴機制。膀胱腫瘤細胞過度表達核心-2β-1,6-N乙酰糖胺轉移酶(GCNT1)，能催化延長核心-2O-糖鏈，而galectin-3可結合腫瘤表面MHCⅠ類分子A鏈(MICA)中核心-2O-糖鏈的LacNAc殘基，從而降低MICA與活化的NK受體NKG2D的親和力，抑制NK細胞的活化與抗腫瘤作用，導致腫瘤細胞逃避NK細胞的殺傷而具有高度轉移性[71]。腫瘤細胞表達神經節苷脂GD3也能通過與siglec-7結合而改變NK細胞的細胞毒性[72]。因此，對相關凝集素及其與糖類的相互作用進行抑制，可能成為抗腫瘤治療的一個新方向。然而，亦有研究已發現某些CLR與特異性的抗原結合后能誘導強烈的抗腫瘤反應。例如，CLEC9A是主要表達在人類和小鼠DC上的CLR，其功能是促進對死亡細胞的吞噬以MHCⅠ類依賴性方式交叉提呈而誘導CD8+T細胞反應，在小鼠模型中以癌細胞上的CLEC9A為靶點進行特異性抗原結合，能增強CD8+T細胞介導的細胞毒性抗腫瘤反應[73-74]。用甘露糖修飾黑色素瘤抗原gp100，可增強gp100特異性CD4+和CD8+T細胞反應，其機制為DC表面的DC-SIGN與甘露糖結合而導致抗原提呈增強，促進機體免疫系統對腫瘤細胞殺傷[35]。在利用天然配體與CLR結合為靶點的研究中，不僅能用糖類修飾抗原以改善CD4+和CD8+T細胞反應的啟動，糖基化的納米分子也被設計研發，其以DC為靶點而改善抗原特異性免疫反應；另外，由于APC中的CLR具有促進抗原加工提呈的高效性，其目前還用于增強某些疫苗向DC的傳遞，以及改善CD4+和CD8+T細胞反應的啟動[47]。
5總結與展望
隨著糖生物學領域研究的不斷進展，越來越多的研究者已意識到糖類的重要性。糖類在免疫學系統中具有多方面及出人意料的作用，與蛋白質和脂質一樣對于免疫信號通路不可或缺，其通過免疫調控而影響機體對病原體侵襲的防御、自身炎癥反應與免疫應答、腫瘤發生發展等過程。尤其是不同的凝集素家族可通過識別糖類配體而發揮效應，并具有多功能屬性和多樣性，其越來越多地被作為免疫疾病和腫瘤治療中新型藥物研發的分子靶點。聚焦于糖生物學領域能為免疫學、分子生物學和腫瘤學等各種學科的深入研究開辟新途徑。隨著糖生物學領域取得越來越多的進展及各種糖生物學技術的革新，全世界多個地區均成立了研究糖組學的中心與機構，旨在資助例如多糖成像、測序、合成等科研項目，及建立哺乳動物、植物和微生物多糖的集中數據庫[75]。相信在這些努力下，研究者們在不久的將來即能為人類完全揭開糖的秘密。
作者：張彥潔章麗雅吳菁王俊青任建敏王歆瓊許春娣周同單位：上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
