分離原料乳中假單胞菌的噬菌體

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1材料與方法

1.1.材料與儀器

來自當(dāng)?shù)厥称饭S及醫(yī)院排放的未經(jīng)處理的污水；10株試驗(yàn)用假單胞菌均分離自當(dāng)?shù)啬虘艏业?a href="http://www.jiamaocode.com/lunwen/jiaoyue/swxklw/201304/750078.html" target="_blank">原料奶并由實(shí)驗(yàn)室保存；TSBYE培養(yǎng)基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，NaCl5g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖10g，酵母粉10g，加蒸餾水至1000mL，用于假單胞菌液體以及固體培養(yǎng)；CM溶液：2.5g/LMgSO4•7H2O，0.05g/L明膠，1mol/L的Tris緩沖液6mL，0.735g/LCaCl2，pH7.5，用于噬菌體原種的保存。日立H-7650型透射式電鏡；0.22μm×25mm微孔濾膜北京牛牛基因技術(shù)有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)上海市離心機(jī)械研究所；TGL16G臺式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠；DELTA320精密pH計梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2.實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.噬菌體的分離

1.2.1.1.噬菌體的初步分離將10mL消毒前污水、1mL處于對數(shù)期的宿主菌液、以及一定量的CaCl2溶液加入到100mL滅菌后的新鮮TSBYE液體培養(yǎng)基中，充分混勻并使混合體系的CaCl2終濃度約為10mmol/L。混合液在30℃，100r/min振蕩培養(yǎng)24h后，于4℃下5500×g離心15min，取上清液并用微孔濾膜（孔徑0.22μm）對上清液過濾除菌，所得過濾后上清液即為擬含有相應(yīng)宿主菌噬菌體的原液，在4℃下保存?zhèn)溆谩２捎肧ambrook等人的雙層瓊脂平板印跡法[12]進(jìn)行噬菌體的初步分離。若發(fā)現(xiàn)疑似噬菌斑，則吸取得到含有疑似噬菌斑的瓊脂塊，并將此瓊脂塊加入到1mL的CM溶液中，室溫下靜置24h后，用0.22μm微孔濾膜過濾此混合液，所得清液即為可能含有相應(yīng)宿主菌噬菌體的懸浮液。

1.2.1.2.噬菌斑的純化及噬菌體原種的獲得采用Sambrook等人的雙層瓊脂平板法[12]對可能含有相應(yīng)宿主菌噬菌體的懸浮液進(jìn)行驗(yàn)證，同時進(jìn)行噬菌斑的純化。將噬菌斑純化3～5次直至得到形態(tài)一致的噬菌斑，純化后的噬菌體懸浮液，即噬菌體原種，保存在4℃條件下。

1.2.2.噬菌體的電鏡觀察取20uL純化后的高滴度噬菌體懸液（108~109PFU/mL）滴于覆有Formvar膜的銅網(wǎng)上，靜置沉淀15min，之后以2%磷鎢酸(PTA)(pH7.0)染色15s，用干燥濾紙從側(cè)面吸去染液，自然干燥后用日立H-7650型透射式電鏡觀察。

1.2.3.噬菌體與宿主菌的交叉培養(yǎng)試驗(yàn)采用Sambrook等人的雙層瓊脂平板法[12]，將分離到的3株噬菌體與10株原料奶中分離得到的假單胞菌宿主菌進(jìn)行交叉裂解，根據(jù)噬菌斑鑒定各噬菌體是否存在交叉宿主菌。判定標(biāo)準(zhǔn)：25℃過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)中心清亮透明，邊緣清晰的裂菌性噬菌斑記為“++”；出現(xiàn)邊緣有模糊暈圈的半透明噬菌斑記為“+”；無噬菌斑記為“-”。

1.2.4.不同理化因素對噬菌體感染性的影響

1.2.4.1.溫度對噬菌體活性的影響取100μL噬菌體擴(kuò)增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振蕩混合并吸附10min，如此制備3份噬菌體與其宿主菌吸附后的混合液，將每份吸附后混合液分別加入3管裝有10mL液體TSBYE培養(yǎng)基中，并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2終濃度為10mmol/L，分別靜置培養(yǎng)于4、25、37℃，采用Sambrook等人[13]的雙層瓊脂平板法于24、48、72h測定噬菌體的滴度。

1.2.4.2.pH對噬菌體活性的影響取100μL噬菌體擴(kuò)增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振蕩混合并吸附10min，如此制備6份噬菌體與其宿主菌吸附后的混合液，將每份吸附后混合液分別加入6管裝有10mL具有不同pH的液體TSBYE培養(yǎng)基中（pH分別為4、5、6、7、8、9），并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2終濃度為10mmol/L，靜置于25℃培養(yǎng)，采用Sambrook等人[13]的雙層瓊脂平板法于24、48、72h測定噬菌體的滴度。1.2.4.3.NaCl濃度對噬菌體活性的影響取100μL噬菌體擴(kuò)增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振蕩混合并吸附10min，如此制備5份噬菌體與其宿主菌吸附后的混合液，將每份吸附后混合液分別加入5管裝有10mL具有不同NaCl濃度的液體TSBYE培養(yǎng)基中，并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2終濃度為10mmol/L，靜置于25℃培養(yǎng)，采用Sambrook等人[13]的雙層瓊脂平板法于24、48、72h測定噬菌體的滴度。通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度大于9.5%時，分離所得噬菌體不生長，所以試驗(yàn)中將培養(yǎng)基內(nèi)的NaCl濃度分別調(diào)為1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%。

2結(jié)果與分析

2.1噬菌體的分離純化以10株假單胞菌為宿主，分離出3株噬菌體，即PP6、PP8和PP10。發(fā)現(xiàn)這3株噬菌體分別侵染假單胞菌P6、P8和P10，并出現(xiàn)了圓形透明噬菌斑（圖1），中心清亮透明，邊緣清晰，純化后的噬菌體懸液增殖后滴度可達(dá)到108PFU/mL以上。

2.2噬菌體的電鏡觀察采用透射電鏡觀察分離得到的3株噬菌體的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表1以及圖2、3、4，結(jié)合國際病毒分類學(xué)委員會（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，簡稱ICTV）第8次報告的最新病毒分類系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)[13]，可推測噬菌體PP6、PP8、PP10為輕小(光滑)噬菌體科。

2.3噬菌體與各個宿主菌的交叉培養(yǎng)試驗(yàn)噬菌體與各宿主的交叉裂解試驗(yàn)見表2，由表2可知，3株噬菌體均存在交叉宿主菌，即每株噬菌體除對自身宿主菌具有裂解作用外，對其余9株從原料奶中分離出的假單胞菌（Pseudomonasspp.）也都具有裂解作用。

2.4部分理化因素對噬菌體活性的影響

2.4.1不同溫度對噬菌體活性的影響分別在4、25、37℃下靜置培養(yǎng)72h的噬菌體PP6、PP8和PP10的滴度如圖5所示。總體上看，在不同溫度條件下，噬菌體PP8的滴度相對較高，最高滴度可分別達(dá)到5.25×106PFU/mL（4℃生長48h）；而噬菌體PP6和PP10的滴度則維持在較低水平，最高滴度只分別達(dá)到1.18×106PFU/mL和3.75×105PFU/mL；而且隨溫度升高，噬菌體PP8和PP10的滴度呈遞減趨勢，而噬菌體PP6的滴度則呈遞增趨勢。對3株噬菌體逐一分析發(fā)現(xiàn)，在4℃條件下噬菌體PP8和PP10的滴度分別處于其最高水平，且在此條件下，隨培養(yǎng)時間的延長，噬菌體PP10的滴度逐漸升高，而噬菌體PP8的滴度則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，于48h滴度達(dá)到最高，為5.25×106PFU/mL，約為24h及72h時滴度的2倍。噬菌體PP6的滴度則在37℃條件下處于其最高水平，且在此條件下，滴度隨培養(yǎng)時間延長呈遞減趨勢，24h時滴度達(dá)1.18×106PFU/mL，為最高，至72h滴度下降了近2個數(shù)量級。

2.4.2不同pH對噬菌體活性的影響總體上看，在不同pH條件下，噬菌體PP8的滴度相對較高，最高滴度可達(dá)到6.05×106PFU/mL（pH為6的條件下生長24h）；而噬菌體PP6和PP10的滴度則維持在較低水平，最高滴度只分別達(dá)到1.32×106PFU/mL和2.10×106PFU/mL；而且隨pH的升高，3株噬菌體的滴度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。pH5～7范圍內(nèi)，3株噬菌體的滴度處于較高水平。此外，72h內(nèi)噬菌體PP8和PP10在pH為4～9的范圍內(nèi)均能生長，噬菌體PP6只能在pH為4～8的范圍內(nèi)生長，在pH為9時未檢測到噬菌體PP6的滴度。噬菌體PP6和PP8在pH為6時得到其最高滴度，在此pH下，培養(yǎng)24h時噬菌體PP8的滴度達(dá)最高，6.05×106PFU/mL，此后隨培養(yǎng)時間延長而逐漸降低，至72h時滴度下降了近2個數(shù)量級；噬菌體PP6在此pH下也于培養(yǎng)24h時達(dá)到其最大滴度，為1.32×106PFU/mL，培養(yǎng)48h時滴度降至3.7×104PFU/mL，但培養(yǎng)72h后滴度又回升至8.7×105PFU/mL。噬菌體PP10則在pH為7時，滴度最高，培養(yǎng)48h時滴度達(dá)到最高，為2.10×106PFU/mL，至72h時滴度下降2個數(shù)量級。

2.4.3不同NaCl濃度對噬菌體活性的影響3株噬菌體分別在不同NaCl濃度條件下靜置培養(yǎng)72h的生長如圖7所示。在NaCl濃度為1.5%～9.5%的范圍內(nèi)，噬菌體PP8和PP10的滴度相對較高，最高滴度可分別達(dá)到3.75×106PFU/mL（3.5%NaCl的培養(yǎng)基中生長48h）和4.00×106PFU/mL（1.5%NaCl的培養(yǎng)基中生長24h）；而噬菌體PP6的滴度則相對較低，最高滴度僅為1.25×106PFU/mL（3.5%NaCl的培養(yǎng)基中生長24h）。在試驗(yàn)的72h內(nèi)，3株噬菌體在含1.5%、3.5%、5.5%NaCl的培養(yǎng)基中生長相對較好，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl達(dá)到7.5%時，3株噬菌體的活性顯著下降，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl達(dá)到9.5%時，3株噬菌體的滴度一直未被檢測到。此外，在不同NaCl濃度下，隨時間的延長，3株噬菌體的生長不具有顯著的規(guī)律性。

3討論

一般噬菌體分為毒性噬菌體(即裂菌性噬菌體)和溫和噬菌體(即溶原性噬菌體)。毒性噬菌體在固體培養(yǎng)基上形成清晰、透亮的溶菌空斑，即透明噬斑；而溫和噬菌體在固體培養(yǎng)基上形成渾濁的半透明噬斑[14]。本試驗(yàn)分離出的3株噬菌體形成的噬菌斑均表現(xiàn)為毒性噬菌體的噬斑特征，故此3株噬菌體均為毒性噬菌體。根據(jù)以往的報道，已分離得到的假單胞菌屬的噬菌體在電鏡下的形態(tài)各異，主要有短尾噬菌體(Pedoviridae)、肌尾噬菌體(Myoviridae)、長尾噬菌體(Styloviridae)和輕小(光滑)噬菌體(Leviviridae)。如SannaSillankorva等[15]分離的熒光假單胞菌噬菌體IBB-PF7A、張克斌[16]分離的銅綠假單胞菌噬菌體PaP2和PaP3屬短尾噬菌體科；張克斌[16]分離的銅綠假單胞菌噬菌體PaP1屬肌尾噬菌體科；王子微[14]分離的熒光假單胞菌噬菌體KS461-2屬于長尾噬菌體科；已經(jīng)公布于NCBI的假單胞菌屬噬菌體PP7則屬于輕小(光滑)噬菌體科[17]。本試驗(yàn)中根據(jù)3株噬菌體在電鏡下的形態(tài)，可以初步推斷噬菌體PP6、PP8和PP10屬為光滑噬菌體科，但要對這3株噬菌體進(jìn)行準(zhǔn)確的分類，還需要分析噬菌體的基因組，并確定其核酸類型。要將分離到的噬菌體應(yīng)用于食品中，就必須了解不同理化條件對噬菌體生理特性的影響。一般來說，在食品及食品原料的加工、運(yùn)輸或保藏中最易發(fā)生變化的三種理化條件是溫度、pH和滲透壓，而且食品加工、運(yùn)輸或保藏中最常見的溫度為4℃、25℃和37℃，多數(shù)食品pH范圍一般在4～9，NaCl濃度在1%～10%，所以本試驗(yàn)研究了這三種理化因素對噬菌體活性的影響。在國內(nèi)，研究不同理化條件對噬菌體活性的影響時，一般采用的方法是將噬菌體置于不同溫度或不同pH條件下1h，每隔5～20min測定一次噬菌體的滴度，并繪制出噬菌體在不同條件下于1h內(nèi)滴度的變化曲線，從而對噬菌體在不同條件下活性的變化作出評價[18-20]。這種試驗(yàn)設(shè)計雖然能在短時間內(nèi)獲得噬菌體活性變化的信息，但在實(shí)際生產(chǎn)中，食品在運(yùn)輸或保藏中經(jīng)歷的時間超過1h，如原料奶從擠出、運(yùn)輸、貯藏到加工之前，中間甚至要經(jīng)歷24h，所以將噬菌體置于不同理化條件下作用更長的時間，并了解其間噬菌體活性的變化趨勢，對于實(shí)際生產(chǎn)意義更為重大。綜上，本試驗(yàn)參照TarekEl-Arabi[21]對蠟樣芽孢桿菌噬菌體生理特性進(jìn)行研究的方法進(jìn)行試驗(yàn)。不難看出，噬菌體PP8和PP10在4℃下能保持較高的活性，因此，它們在低溫貯藏的食品原料中具有較大的應(yīng)用潛力，可能會與低溫形成協(xié)同增效的作用。而噬菌體PP6則更適合應(yīng)用在不得不處于相對高溫環(huán)境下的食品中。3株噬菌體在pH為5～7以及NaCl為1.5%～5.5%的范圍內(nèi)保持較高活力，在pH為4或9以及NaCl為7.5%～9.5%這樣過酸過堿或滲透壓較高的條件下，活性受到抑制，這是由于在這樣相對極端的條件下，宿主菌的代謝活力受到了抑制[22]，高滲透壓條件會阻止核衣殼的合成和噬菌體核酸的注入[23-25]，同時高滲透壓條件也造成噬菌體凝聚成束，從而減少了和宿主菌相吸附的位點(diǎn)[24]。

4結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)以10株原料乳中假單胞菌為宿主，分離得到3株裂菌性噬菌體，初步推斷噬菌體PP6、PP8和PP10為輕小(光滑)噬菌體；噬菌體PP8和PP10在4℃下能保持較高的活性，而噬菌體PP6則在37℃條件下活性較高；3株噬菌體在pH為5～7以及NaCl為1.5%～5.5%的范圍內(nèi)保持較高活力。3株噬菌體在原料乳或食品中假單胞菌的控制方面，均具有較大的應(yīng)用潛力。

作者：胡子毅孟祥晨楊麗梅楊杰劉歡單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院