血管內皮屏障功能調節

前言：本站為你精心整理了血管內皮屏障功能調節范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

血管內皮屏障功能的調節機制相當復雜。α-凝血酶等炎癥性介質引起內皮通透性增高的機制可能是通過G蛋白激活磷脂酶，介導三磷酸肌醇等第二信使產生，并進一步激活蛋白激酶C和肌球蛋白輕鏈激酶，最終引起球蛋白輕鏈磷酸化，從而導致內皮細胞F-肌動蛋白骨架重排，中心張力增加，細胞間裂隙形成，內皮細胞通透性發生改變。

ResearchProgressonRegulationofVascularendothelialBarrierFunction

XIAOZhen-Liang,SUNGeng-Yun(InstituteofRespiratorydiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037)

AbstractTheregulatorymechanismsofvascularendothelialbarrierfunctionarecomplicated.Inflammatorymediators,suchas-α-thrombin,activatephospholipasestomediategenerationofIP3ansothersecondmesssengersthroughreceptor-coupledGprotein.ProteinkinaseCandmyosinlightchainkinasearethenactivated,leadingtophosphorylationofmyosinlightchains,rearrangementofF-actinskeleton,interendothelialcellgapformationandincreasedendothelialpermeability.

KeywordsBarrierfunction;Endothelium;Permeablity;Regulation

血管內皮包括內皮細胞（EC）單層和基膜，是血管腔面的一層半選擇性通透屏障。血管內外溶質和液體的交換受體內皮通透性大小控制。通透性是檢測內皮屏障功能的客觀計量指標。許多炎性、成血栓性（thrombogenic）介質均可損傷內皮屏障功能，導致其通透性增高，血漿蛋白滲出，引起組織、器官水腫和功能障礙。血管內皮屏障功能障礙是炎癥的主要特征之一，并參與腫瘤轉移、免疫反應及多器官功能障礙的發生。本文就近年來血管內皮障礙功能調節的研究進展，特別是有關的信號轉導機制作一簡要綜述。

一、內皮細胞間連接與內屏障功能

溶質分子跨內皮轉運有三條途徑[1]，即細胞旁擴散（paracellulardiffustion）、穿細胞通道（transcellularchannel）和胞內小泡介導途徑（vesicle-mediatedpathway）。其中細胞旁擴散是主要途徑。正常情況下，內皮對溶質分子的通透有選擇性；大分子物質如白蛋白僅少量經穿細胞通道和小泡介導途徑轉運至內皮外。當內皮屏障功能受損時，由于EC間裂隙形成，內皮對溶質分子的選擇性喪失，大分子物質主要經細胞旁擴散轉運[1，2]。

EC間存在緊密連接、中間連接和縫隙連接[2，3]。縫隙連接主要存在于動脈EC間，靜脈EC間也有少量存在，新近發現人臍動、靜脈內皮的縫隙連接含有Cx37、Cx40和Cx43三種連接素（connexin）[3]。緊密連接和中間連接則普遍存在于EC間。細胞間接損傷導致EC間裂隙形成和內皮通透性增高，是通透性水腫發生的基礎。

（一）緊密連接緊密連接多存在于EC的近腔面。有的環繞整個細胞形成閉鎖小帶；有的則間斷存在，稱為閉鎖斑。閉鎖小帶只見于腦血管內皮，其它器官EC間主要是閉鎖斑。電鏡觀察發現，EC間的緊密連接部位存在由雙側胞膜形成的葉片（leaflets）狀結構，彼此粘合緊密，對溶質分子的跨內皮轉運起限制作用。緊密連接的胞漿面還存在著一種分子量為225kD蛋白質ZO-1[1，2]，與胞內F-肌動蛋白骨架相連。

細胞骨架包括微絲、微管和中間絲。微絲主要由F-肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-輔肌動蛋白組成，F-肌動蛋白骨架包括不同的微絲束類型，如應力纖維、細胞周邊的致密外周束（denseperipheralband）、中央短纖維等[4，5]。它們之間可以相互轉化。位于核周的中央短纖維產生的中心張力（centripetaltesion）是調節內皮通透性的直接動力。中心張力來源于肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化介導的肌動-肌球蛋白間相互作用[3]。它與由EC間連接、EC-基膜間粘附所產生的拴縛力（tetheringforce）是一對作用方向相反的力。前者使EC產生收縮；后者的作用則將EC與EC、EC與基膜拴縛在一起。兩者平衡時，EC間隙和骨皮通透性維持正常狀態；當內皮受到炎性介質如α-凝血酶等刺激時，F-肌動蛋白骨架發生重排，中心張力增加并通過ZO-1使細胞間連接發生改變，結果細胞收縮變圓，EC間裂隙形成，內皮通透性增高[5，6]。

（二）中間連接內皮中間連接發生在相鄰細胞的鈣粘附素（cadherins）分子之間，由Ca2++介導，以同質粘?。╤omotypicadhesion）的方式使兩側的鈣粘附素分子端-羰連接[2]。同持粘附是指同種分子之間發生的粘附。鈣粘附素分子的中一端通過紐帶蛋白（vinculin）、α-輔肌動蛋白和catenin與F-肌動蛋白呈鏈狀連接，因此F-肌動蛋白骨架的變化可通過以上鏈狀結構影響中間連接，使EC間裂隙和內皮通透性發生改變。Ca2+通過影響鈣粘附素之間及鈣粘附素與catenin之間的連接參與內皮屏障功能的調節，起著“鈣開關”的作用。胞內Ca2+濃度（[Ca2+]i）升高，內皮屏障功能下降；Ca2+]i下降到原來水平，內皮屏障功能又恢復正常[2]。

總之，細胞旁擴散是溶質跨內皮轉運的主要途徑；中心張力和拴縛力之間的平衡，直接影響細胞間連接和EC間裂隙形成，是內皮屏障功能的決定因素。

二、基膜對內皮屏障功能的影響

血管內皮屏障包括EC單層和基膜?；び赡z原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白、糖蛋白和纖維蛋白等生物大分子構成。這些分子相互交聯形成復雜的網狀結構，是EC的惰性支持物。近年來發現，內皮基膜對溶質和液體的跨內皮轉運有重要影響。實驗發現，去除基膜后內皮對白蛋白的通透性可增加14倍[7]。

（一）基膜成分與內皮通透性膠原是構成基膜的主要成分之一，對39-110kD的溶質分子有選擇通透性；用Ⅰ型膠原覆蓋微孔濾膜，可使其對白蛋白的通透性降低30%；在培養液中加入抗壞血酸，可通過刺激膠原合成增加，降低人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）單層對大分子物質的通透性[8]。Partridge等發現，104U/ml的腫瘤壞死因子α（TNFα）即可誘導牛肺微血管內皮細胞單層通透性增高。其機制是TNFα誘導EC產生了一種96kD的明膠酶，裂解了基質成分如纖維連接蛋白、層粘蛋白、明膠及IV、V型膠原[9]。Partridge還發現，低氧引起內皮通透性增高時，EC間裂隙增寬，肌動蛋白骨架重排，同時纖維連接蛋白、波影蛋白（vitronectin）等基質的含量也下降[10]。有人用透明質酸酶處理內皮基膜以去除透明質酸，結果通透性較對照組增加了6倍[11]。這表明基質成分的改變會影響內皮屏障功能。

（二）EC與基膜粘附EC與基膜經整合素介導，以灶性接觸（focalcontact）的方式發生粘附，形成粘附斑（adhesionplaque）。整合素分子由兩個非共價鍵結合的亞單位組成，兩條鏈均為完整的膜蛋白，其分子量分別為120-180kD和90-180kD。整合素以跨膜受體的形式存在，橋接細胞外基質蛋白與細胞骨架蛋白（即肌動蛋白、紐帶蛋白和α-輔肌動蛋白）。整合素與配體結合的特點是，一種整合素可與多種配體結合，而同一種配基亦可與多種整合素結合。已知的整合素已超過21種，介導EC與基膜間粘附的主要由β1和β2參與組成的整合素。新近發現，EC與基膜間粘附對纖維內皮屏障完整性具有明顯意義。用合成肽Gly-Arg-Ser(GRGDS)阻斷整合素的RGD基團與膠原蛋白、纖維連接蛋白、波影蛋白和層粘蛋白結合，結果導致EC收縮變圓，甚至從基膜上脫落，從而引起內皮通透性增高[12]。

EC與基膜間粘附影響內皮通透性的機制尚未闡明。Burridge認為，基膜中的膠原、纖維連接蛋白、層粘蛋白和波影蛋白與整合素的細胞外區（N-末端）結合；F-肌動蛋白則通過α-輔肌動蛋白與紐帶蛋白相連，紐帶蛋白再通過talin與整合素的細胞內區（C-末端）連接。這樣，整合素不僅介導了EC與基膜間粘附，還將細胞骨架蛋白與基質蛋白“串連”起來，具有顯著的生物力學意義。當內皮受到炎性介質刺激時，EC的F-肌動蛋白骨架發生重排，中心張力的變化即可沿上述結構傳至基膜；同樣，基膜產生的任何力學變化也可逆向傳入細胞內。電鏡發現EC中的應力纖維與粘附斑的胞漿區存在清晰的粘附點，為上述假設提供了直接證據。纖維連接蛋白粘附。用纖維連接蛋白處理牛肺動脈內皮，結果抑制了TNFα誘導的通透性增高。另有報道，一種非整合素家族的跨膜蛋白GP116也可介導EC與基膜間粘附，參與內皮屏障功能調節[2]。

三、內皮屏障功能調節的信號轉導

任何刺激均需通過相應的信號轉導系統，將刺激信號傳入EC中，才能對內皮屏障功能產生影響。G蛋白、磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸激酶（TK）及肌球蛋白輕鏈（MLC）均參與了內皮屏障功能調節的信號轉導。

（一）G蛋白G蛋白是一類由Gα、Gβ、Gγ亞基構成的異三聚體蛋白，有Gs、Gi、Gq、G12四類共十幾種亞型。G蛋白與膜受體偶聯，將刺激信號傳至PLC（特別是PLCβ）、磷脂酶A2（PLA2）、腺苷酸環化酶（AC）、磷酸二酯酶和離子通道。G蛋白激活是從受體將信號傳入EC，并觸發細胞骨架收縮過程中的關鍵環節之一。配體與特異受體結合，導致不同G蛋白亞型的激活。例如H1組胺受體激活時，胞內三磷酸肌醇（IP3）和Ca2+水平升高，提示該反應可能與Gi或Gq蛋白偶聯。而H2組胺受體受到刺激時，AC被活化，cAMP含量增加，表明H2受體與Gs蛋白偶聯[1]。G蛋白對刺激信號有放大作用。一個受體可與多個G蛋白偶聯，而一個G蛋白可同時激活多條信號通路。百日咳毒素能使某些G蛋白亞型與受體失偶聯，阻斷信號轉導。例如與組胺受體偶聯的G蛋白即屬百日咳毒素敏感型；而與α凝血酶和緩激肽受體偶聯的G蛋白則屬百日毒素非敏感型[2]。

（二）PLC信號PLC的主要作用底物是三種磷脂肌醇，即4，5二磷酸磷脂肌醇（PIP2），4-磷酸磷脂肌醇（PIP）和磷酸磷脂肌醇（PI）。PIP2水解產生IP3和二?；视停―AG）。PIP和PI水解只產生DAG，不產生IP3。IP3與內質網上的受體結合使內貯Ca2+釋放入胞漿，導致[Ca2+]i升高。實驗發現，α-凝血酶刺激培養牛肺動脈內皮細胞（BPAEC）后，10秒內IP3水平明顯升高，20秒降至基礎水平；Ca2+]i約17秒升至峰值，從基礎水平59±8nmol/L升至同定Ca2+釋放引起，第二時相則由Ca2+內流引起[13]。磷脂肌醇水解產生的第二信使DAG和IP-3是α-凝血酶誘導上皮通透性增高的關鍵信號。

Ca2+和DAG通過多條效應途徑參與內皮屏障功能調節。Ca2+和DNG均可直接激活PKC；[Ca2+]i升高也能激活PLC和PLA2。PLC和LPA2分解膜磷脂產生DAG和花生四烯酸。后兩者具有潛在激活PKC的活性，這可能是炎性介質引起內皮通透性增高后纖維較長時間的機制之一?；ㄉ南┧岽x產生可能也參與了內皮屏障功能的調節。以去二氫愈創木酸抑制花生四烯酸的脂氧化酶代謝途徑，結果[Ca2+]i升高的第二時相消失，也抑制α-凝血酶誘導的血管內皮通透性增高。

（三）PKC激活組胺、α-凝血酶等炎性介質可引起內皮屏障功能損害。它們通過與膜上的受體結合，激活偶聯G蛋白，進一步激活PLC；氧自由基、血流剪切力損傷內皮屏障則不經受體結合，直接激活PLC。上述兩類損傷因素激活PLC的途徑雖不同，但最終都激活PKC。

PKC是參與細胞信號轉導的一組重要蛋白質。目前在哺乳動物中至少發現10種亞型，均具有不同的底物特異性。根據其對Ca2+、DAG和磷脂酸絲氨酸（PS）三種激活劑的反應分類三類：第一類包括α、β1、βⅡ和γ，均能被三種激動劑激活；第二類包括ε、δ、θ和η，由PS和DAG激活，對Ca2+不敏感；第三類包括ξ和λ，由PS激活，對DAG和Ca2+不敏感。研究發現，α-凝血酶誘導內皮通透性增高時，[Ca2+]i升高，PKC激活；阻斷Ca2+內流，則PKC激活和內皮通透性增高受到抑制。參與內皮屏障功能調節的PKC亞型尚不完全清清楚楚，但已知由Ca2+激活的PKC主要是PKC-α和PKC-β。凝血酶和過氧化氫誘導的內皮通透性增高由Ca2+激活的PKC介導；緩激肽誘導的內皮通透性增高則由DAG激活的PKC介導。這表明內皮通透性調節的信號轉導隨激動劑不同而有差異。EC中PKC激活分為兩個時相[14]，第一時相快速、短暫，主要由DAG和Ca2+快速增加引起；第二時相出現較晚，持續時間較長（約1小時），可能僅由DAG引起。介導第二時相的DAG來源于PLC和磷脂酶D（PLD）水解磷脂酰膽堿。

（四）TK激活內皮屏障功能受損的另一條途徑由TK介導[13]。TK的主要作用是使細胞骨架蛋白如紐帶蛋白、talin、β-catenin磷酸化，從而使細胞之間、細胞與基膜之間的連接發生改變，EC收縮變圓，內皮通透性增高。炎性介質如α-凝血酶誘導的TK激活可能由跨膜G蛋白介導。PKC激活和[Ca2+]i升高也與TK介導的蛋白磷酸化有關[13]。TK參與內皮屏障功能調節的機制尚待進一步研究。

（五）MLC的磷酸化和去磷酸化近年來關于磷酸化和去磷酸化的研究倍受重視，認為磷酸化和去磷酸化是細胞信號轉導的公共通路或最后通路。蛋白磷酸化和去磷酸化幾乎調節著生命活動的所有過程。內皮通透性調節即是通過MLC和其它蛋白的磷酸化和去磷酸化實現的。

1.MLC磷酸化：研究體外培養的HUVEC和BPAEC單層發現，肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）激活時，EC間裂隙形成，胞內ATP、Ca2+、鈣調蛋白（CaM）含量及MLC磷酸化水平升高?；A狀態下EC內即存在MLC磷酸化，F-肌動蛋白骨架也表現出中心張力。當EC受到凝血酶或組胺刺激時，MLC發生快速單磷酸化和雙磷酸化，誘導肌動-肌球蛋白間相互作用，中心張力增高，EC間隙形成，內皮通透性增高[13，15]。凝血酶刺激后15秒即有MLC磷酸化增加，峰值則出現在刺激后1-2分鐘，約有60%-80%的MLC發生磷酸化并主要以雙磷酸化的形式存在。預先加入MLCK抑制可阻斷凝血酶引起的MLC磷酸化和EC單層通透性增高。

有人對MLC磷酸化過程提出如下假設[16]：PLC介導PKC活化和[Ca2+]i升高；再由Ca2+與鈣調蛋白結合形成Ca-CaM，激活MLCK；最后由MLCK介導MLC磷酸化，Ca-CaM活化MLCK的過程需要PCK參與。cAMP對內皮通透性增高抑制作用，機制尚不清楚。加入外源性的cAMP可減弱炎性介質誘導的MLC磷酸化，表明cAMP保護內皮屏障功能的機制與MLC磷酸化有關[16]。β2-腎上腺素受體激動劑formoterol和異丙腎上腺素能促進cAMP合成增加，故對內皮屏障功能有一定的保護作用[17]。

2.MLC的磷酸化：EC受到組胺、凝血酶刺激后，MLC磷酸化水平迅速升高，5-30分鐘內快速下降。MLC去磷酸化可能是MLCK被激活后又迅速失活，或MLC特異性的磷酸酯酶活性增高，也可能與兩者均有關。內皮受凝血酶刺激后5分鐘內由基礎水平的.64N/cm2增至1.3N/cm2，并持續40分鐘以上?？梢奙LC磷酸化與中心張力變化存在時相上的差異。推測EC收縮存在類似于平滑肌收縮時的“門栓狀態”（latchbridge），即中心張力和細胞收縮狀態的維持與MIC磷酸化無關。有關EC中MLC特異性磷酸酯酶活性的調節，目前知之不多；有人認為MLC的去磷酸化與L型絲氨酸/蘇氨酸磷酸酯酶有關[15]。

四、內皮通透性增高的逆轉和“關閉”（turnoff）

多數炎性介質引起的內皮通透性增高是可逆的。Khimenko實驗室的工作表明，下列因素可使內皮通透性高發生逆轉[18]：⑴β-受體激活；⑵腺苷A2-受體激活；⑶AC激活；⑷加入cAMP類似物；⑸抑制磷酸二酯酶。其機制與EC中cAMP含量增加有關。

內皮通透性增高還可發生自然“關閉”。例如用α-凝血酶連續灌注肺血管，10分鐘后毛細血管濾過系數升至峰值；停止灌注后40分鐘，濾過系數恢復正常；EC收縮和細胞間隙增寬也在30分鐘內恢復正常[19]。內皮通透性增高“關閉”的機制涉及信號轉導過程的多個環節：⑴介質受體失敏，α-凝血酶引起凝血酶受體失敏是受體蛋白被水解，使EC膜上的的功能受體數下降所致。Vu等認為，一旦α-凝血酶引起內皮通透性增高，即不能再激發第二次反應。只有當新的受體合成并轉移至胞膜表面時，才能對刺激產生新的反應。受體失敏的另一機制受體內化，緩激肽刺激可使其位于EC胞膜上的受體數因內化而下降約70%。β-腎上腺素受體則可因磷酸化而失敏；⑵PKC激活的負反饋通路抑制了與內皮通透性增高有關的信號轉導，如PKC可使PLC與G蛋白之間失偶聯，從而抑制了內皮通透性的增高；⑶內源性PKC抑制劑使PKC活性受到特異性調節；⑷磷酸二酯酶活化和MLCK失活。前者使磷酸化MLC水解增多，后者使磷酸化MLC形成減少；⑸可能與EC中的前列環素產生增加有關；⑹G蛋白下調，原因尚不清楚?？梢妰绕ねㄍ感浴瓣P閉”的機制十分復雜，某些環節有待進一步探討。

目前對內皮屏障功能調節的機制已有深入的認識，但也存在一些不同的觀點。例如多數人認為Ca-CaM激活MLCK是MLC磷酸化和F-肌動蛋白肌架重排發生的機制，PKC的作用是介導Ca-CaM的形成。但有人用藥物阻斷[Ca2+]i升高和PKC的激活并不能抑制MLC磷酸化和F-肌動蛋白骨架重排，推測有另外的機制參與[6]。甚至有認為，炎性介質引起的內皮通透性增高與F-肌動蛋白骨架重排和EC收縮無關[20]。內皮屏障功能的調節機制亟待進一步研究。

參考文獻

LumH,MalikAB.Regualtionofvascularendothelialbarrierfunctionl.AmJPhysion,1994,267:L223-241

GarciaJGN,SchaphorstKL,Regulationfendothelialcellgapformationandparacellularpermeability,JInvestMed,1995,43:117-126

VanRijenHVM,VanKempenMJA,AnalbersLJS,etal.GapjunctionsinhumanumbilicalcordendothelialcellscontainmultipleconnexinsAmJPhysion,1997,272:C117-130

ErmertL,BrucknerH,WalmrathD,etal.Roleofendothelialcytoskeletoninhigh-permeabilityedemaduetobotuliumC2toxininperfusedrabbitlungs.AmJPhysion,1995;268:A753-761

ThurstonG,BaldwinAL,Changesinendothelialactincytoskeletoninvenleswithtimeafterhistaminetreatment.AmJPhysion,1995,269:H1528-1537

ThurstonG,TurnerK,Thrombin-inducedincreaseofF-actininhumanumblicalveinendothelialcells.MicrovaseRse,1994,47:1-20

FoxJR,WaylandH,Interstitialdiffusionofmacro-moleculesintheratmesentary.MicrovaseRes1979,18:255-276

UtoguchiN,IkedaK,Saeki,etal.Ascorbicacidstimulatingbarrierfunctionofculturedendothelialcellmonolayer.JCellPysiol,1995,163:393-399

PartridgeCA,JeffreyJJ,MalikAB.A96-kDagelatinaseinducedbyTNF-αcontibutestoincreasedmicrovascularendothelialpermeability.AmJPhysion,1993,265:L438-447

PartridgeCA,Hypoxiaandreoxygenationstimulatebiphasicchangesinendothelialmonolayerpermeablity.AmJPhysion,1995,269:L52-58

QiaoRL,WangHS,YanWH,etal.Extracelluarmatrixhyaluronanisadeterminanfoftheendothelialbarrier.AmJPhysion,1995,269;C103-109

StickelSK,WangYL,SyntheticpeptideGRGDSinduesdissociationofalpha-actiniandvinculinfromthesitesoffocalcontacts.JCellBiol,1988,107:1231-1239

FlemingI,FisslthalerB,BusseR,Calciunsignalinginendothelialcellsinvolevesactivationoftyrosionkinasesandleadstoactivationofmitogen-activatedproteinkinases.CirRes.1995,76:522-529

NatarajanV,TaherMM,RoehmB,etal.ActivationofendothelialcellphospolipaseDbyhyfrogenperoxideandfattyacidhydroperoxide.JBiolChem,1993,268:930-937

VaerinAD,PattersonCE,DayMA,etal.Regulationofendthelialcellgapformantionandbarrierfunctionbymyosin-associatedphodphataseactivaties.AmJPhysion,1993,265:L438-447

GarciaJGN,DavisHN,PattersonCE.Regulationofendothelialcellgapformationandbarrierdysfunction:roleofmyosinlightchainphosphorylation,JCellPysiol,1995,163:510-522

ZinkS,RosenP,LemoieH,Micro-andmacrovascularendothelialcellsinβ-adrenergicregulationoftransendothelialpermeabilith.AmJPhysion,1995,269:C1209-1218

KhimenkoPL,MooreTM,WilsonPS,Roleofcalmodulinandmyosinlight-chainkinaseinlugnischemia-repefusioninjury.AmJPhysion,1996,271:L121-125

GarciaJGN,BirhnboimAS,BiziosR.ThrombininducedincreaseinalbuminpermeabilityacrosstheendotheliumJCellPysiol,1986,128:94-104

BaldwinAL,ThurstonG.Changesinendothelialactincytoskeletoninvenuleswithtimeafterhistaminetreatment.AmJPhysion,1995,269:H1528-1537