RNA干擾作用原理及應(yīng)用

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【摘要】rna干擾是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進化的高度保守的現(xiàn)象之一。RNAi是通過siRNA介導(dǎo)的特異性高效抑制基因表達途徑，由siRNA介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反應(yīng)特征，反應(yīng)中需要多種蛋白因子以及ATP參與。RNAi在基因功能和基因藥物具有廣泛的前景。

【關(guān)鍵詞】RNA干擾siRNAdsRNARNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體ArgonauteRNA聚合酶III啟動子

【Abstract】RNAinterference(RNAi)indiverseorganismsrevealsthesamehighlyconservedmechanismwithanancientorigin.RNAiisthemodeofsequence-specificpost-transcriptionalgenesilencinginanimalsandplantsinitiatedbyhomologousdouble-strandedRNA(dsRNA).discoveryofRNAiandthemolecularmechanismwillhelpusapplyittostudythegenefunctionandexploitthegenedrug.

【Keywords】RNAinterference(RNAi)smallinterferingRNA(siRNA)double-strandedRNA(dsRNA)RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)ArgonautepolIII

1背景

20多年前，在對矮牽牛（petunias）進行的研究中有個發(fā)現(xiàn)：RichJorgensen和同事將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強啟動子后，導(dǎo)入矮牽牛中，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié)果沒看到期待的深紫色花朵，多數(shù)花成了花斑的甚至白的。因為導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制，Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為協(xié)同抑制（cosuppression）。在真菌中也有類似的現(xiàn)象，1996年就在脈孢菌屬(Neurospora)發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。當(dāng)時將這種現(xiàn)象命名為基因表答的阻抑作用(quelling)［1］。

通過對轉(zhuǎn)基因植物的研究，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄并不受，將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）。轉(zhuǎn)錄后的基因沉默可能是進化過程中一種抵御轉(zhuǎn)座子和RNA病毒的防御機制，可能在植物和動物分化之前就已經(jīng)出現(xiàn)。1998年華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次將雙鏈dsRNA（double-strandedRNA）注入線蟲，結(jié)果誘發(fā)了比正義鏈和反義鏈的單獨注射都要強的基因沉默。將這種由dsRNA（double-strandedRNA）引發(fā)的特定基因表達受抑制現(xiàn)象稱為RNA干擾作用（RNAinterferenceRNAi）［2］。

2RNAi的分子機制

dsRNA（double-strandedRNA）可以介導(dǎo)基因沉默作用，以dsRNA為基點研究基因沉默的分子機制成為熱點。dsRNA指的是大于30個堿基對的RNA分子。哺乳動物細胞有至少2條路徑競爭雙鏈RNA(dsRNA)，其一是特異性路徑：特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始階段dsRNA被切成siRNA（smallinterferingRNA或shortinterferingRNAs）。siRNA是RNA干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子，能提供一定的信息，允許一個特定的mRNA被降解。siRNA正義鏈與反義鏈各有21個堿基，其中19個堿基配對，再每條鏈的3’端都有2個不配對的堿基（圖1）。

圖1siRNA

另一條是非特異性路徑：只要有長的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白質(zhì)的合成。長的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通過一系列的磷酸化關(guān)閉翻譯起始因子，導(dǎo)致翻譯抑制。也可以通過激活2’－5’AS合成一個分子激活RNaseL，導(dǎo)致非特異的RNA降解［3］。

關(guān)于特異性的RNA作用機制模型，包括起始階段和效應(yīng)階段［4］。起始階段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，屬內(nèi)切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸長的小分子干擾RN斷（siRNA）［5］。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)。

在RNAi的效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白/RNA復(fù)合物（RNA－inducedsilencingcomplexorRISC），在siRNA解雙鏈即RISC激活過程需一個ATP［5］。由RISC中siRNA反義鏈與mRNA互補區(qū)域結(jié)合，隨后切割mRNA從而達到在RNA水平干擾基因表達。RISC由多種蛋白成分組成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等。

最新研究表明，Argonaute蛋白為RISC的特有成分，被比喻成“切薄片的機器”。Argonaute有一個月牙型的底座由三部分組成，分別為N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI區(qū)域（PIWIdomain）。在月牙底座上面有一個PAZ部分，由莖桿結(jié)構(gòu)支撐。Argonature蛋白有一個明顯的凹槽貫穿整個蛋白，凹槽內(nèi)壁帶正電有利于與RNA帶負電的磷酸骨架結(jié)合。siRNA解旋后，siRNA單鏈的3’端伸入PAZ的裂縫中，整個單鏈沿著PAZ伸展開，同時目的片段mRNA結(jié)合于新月型底座。mRNA與siRNA互相配對形成雙鏈后，在離單鏈siRNA5’端9個堿基處（即離siRNA3’端11－12個堿基處）切割mRNA（圖2）［6］。

圖2siRNA引導(dǎo)mRNA被切割的模型

3siRNA的表達

最便利的siRNA表達載體用三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種（Sui2002，Lee2002，Paul2002），操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)在哺乳動物細胞中的表達（圖3）［7］。

圖3hairpinsiRNA

這類啟動子有大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子［8］。采用RNApolIII啟動子是因為它結(jié)構(gòu)簡單，而且可在哺乳動物細胞中表達小分子RNA，并且它可通過一串（3－6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的，這剛好符合原始設(shè)計的siRNA的3’端含有2個突出堿基U(Elbashir2002)。使用這類載體，首先要設(shè)計2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，然后訂購這2段DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。克隆可能要幾周甚至數(shù)月的時間，為保證克隆的序列的正確性，還要進行測序。

病毒載體用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞并維持較長時間的基因沉默［9］。

siRNA目標位點的篩選是實現(xiàn)RNAi作用的關(guān)鍵，一般有以下幾個原則［10，11］：(1)在預(yù)定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA；(2)找2～4個小片段的RNA，通過SECs（siRNAexpressioncassettes，SECs）篩選最有效的siRNA；(3)在19nt的RN斷中不能含有連續(xù)4個T或A的區(qū)域；(4)通過BLAST確定片斷的特異性；(5)片斷GC%應(yīng)該在30%～50%。4RNAi的前景

4.1信號傳導(dǎo)通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動物中降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間，控制基因表達的部位。

4.2開展基因的新途徑一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因表達同時降低的表現(xiàn)，也可同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。為治療多基因調(diào)控的腫瘤疾病，帶來新的治療策略。

【】

1Isolationofquelling-defective(qde)mutantsimpairedinposttranscriptionaltransgene-inducedgenesilencinginNeurosporacrassaProc.NatlAcadSciUSA，1997，94：10233-10238.

2FireA，XuS，MontgomeryMK，etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandRNAincoenorhabditiselegans.Nature，1998，391(6669)：744-745.

3Nature，2001，411，428-429.

4Matzke.M，MatzkeAJ，KooterJM.RNA：guidinggenesilencing.Science，2001，293(5532)：1080-1083.

5NykanenA，HaleyB，ZamorePD.ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway.Cell，2001，107(3)：309-3021.

6Ji-JoonSong，StephanieK.SmithGregoryJ.Hannon，1LeemorJoshua-Tor1，2*3CrystalStructureofArgonauteandItsImplicationsforRISCSlicerActivitySCIENCE，2004，305.

7YuJ.-Y.，DeRuiterS.L.，Turner，D.L.RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(9)：6047-6052.

8MiyagishiM，TairaK.U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3’overhangseffectivelysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatureBiotechnology，2002，20：497-500.

9GustavoTiscornia，OdedSinger，MasahitoIkawa，etal.AgeneralmethodforgeneknockdowninmicebyusinglentiviralvectorsexpressingsmallinterferingRNAProcNatlAcadSciUSA，2003，100(4)：1844-1848.

10BrownD，JarvisR，PallottaV，etal.RNAinterferenceinmammaliancellculture：design，execution，andanalysisofthesiRNAeffect.AmbionTechNotes9(1)：3-5.

11SuiG，SoohooC，AffarEB，etal.ADNAvector-basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.ProcNatlAcadSci.USA，2002，99(8)：5515-5520.