大青葉中靛玉紅含量測(cè)定

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【關(guān)鍵詞】大青葉

SFEtechnologyofindirubinfromDaqingyeandcontentdeterminationofindirubin

【Abstract】AIM:TouseHPLCforthecontentdeterminationofindirubininsupercriticalfluidextraction(SFE)materialfromDaqingyeandtooptimizetheprocessofSFE.METHODS:Contentofindirubinwasusedasindextoevaluatethetechnologiesbasedonorthogonaldesign,inwhich4factorsconsideredwereextractiontemperatureandpressure,separationtemperatureandpressure.AHPLCsystemwasusedtodeterminethecontentofindirubin.RESULTS:Optimalprogramwasasfollows:extractiontemperature50℃andpressure40MPa,separationtemperature40℃andpressure8MPa.Theaveragerecoveryofindirubinwas102.8%andRSDwas1.48%.CONCLUSION:Theextractiontemperature,extractionpressureandseparationpressureallhavesignificanteffectsontheextractionrateofindirubin.TheHPLCmethodissimple,preciseandsuitableforthecontentdeterminationofindirubininSFEmaterialofDaqingye.

【Keywords】Daqingye;SFECO2;indirubin;chromatography,highpressureliquid

【摘要】目的：建立用HPLC測(cè)定大青葉的超臨界萃取物中靛玉紅含量的方法，對(duì)萃取工藝進(jìn)行優(yōu)選.方法：采用超臨界萃取法進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn).以靛玉紅含量考察萃取溫度、萃取壓力、分離溫度及分離壓力四個(gè)因素的影響.采用HPLC法測(cè)定萃取物中靛玉紅含量.結(jié)果：最佳萃取工藝為萃取溫度50℃,萃取壓力40MPa,分離溫度40℃及分離壓力8MPa.靛玉紅平均回收率為102.8%，RSD為1.48%.結(jié)論：萃取溫度、萃取壓力及分離壓力對(duì)大青葉中靛玉紅的萃取都有顯著影響.HPLC法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為超臨界萃取大青葉中靛玉紅的質(zhì)量控制方法.

【關(guān)鍵詞】大青葉；CO2超臨界萃取；靛玉紅；色譜法，高壓液相

0引言

靛玉紅主要來(lái)源于植物馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia)、蓼藍(lán)(Polygonumtinctorium)及菘藍(lán)(Isatisindigotica)的中藥材如大青葉、板藍(lán)根、青黛等，靛玉紅是其主要有效成分.靛玉紅有治療慢性髓性白血病作用，是一種應(yīng)用前景廣闊的抗腫瘤成分［1］.

靛玉紅在中藥材中含量很低，為減少藥物使用量，提高生物利用度，我們用超臨界流體萃取（SFE）法對(duì)大青葉中的靛玉紅進(jìn)行分離提純，同時(shí)建立萃取物中靛玉紅含量的HPLC測(cè)定方法，優(yōu)化靛玉紅SFE工藝.

1材料和方法

1.1材料GoldenSystem高效液相色譜儀（美國(guó)Beckman公司），配125型高壓雙泵，168型二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱:SynersiFusionRP柱（4.6mm×250mm，4μm，美國(guó)Phenomenex公司）；FY2215006超臨界萃取儀（南通市飛宇石油科技開(kāi)發(fā)有限公司）；R200D電子分析天平（德國(guó)Satorius公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAASPIRATORA3SRIKAKIKATCO.LTD）.大青葉購(gòu)自西安藥材市場(chǎng)，按照中國(guó)藥典（2005年版）有關(guān)大青葉項(xiàng)下鑒定本品為合格藥材；靛玉紅對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)717200204；甲醇為HPLC級(jí)（美國(guó)FISHER公司），水為超純水，其余試劑均為AR級(jí).

1.2方法

1.2.1SFE正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9(34)設(shè)計(jì)，選擇萃取溫度、萃取壓力、分離溫度及分離壓力四個(gè)因素，每個(gè)因素取3水平.分別為萃取溫度40,50及60℃；萃取壓力20,30及40MPa；分離溫度30,40及50℃；分離壓力8,10及12MPa.

1.2.2供試品溶液的制備打開(kāi)超臨界萃取儀，按1.2.1的設(shè)計(jì)設(shè)置萃取儀溫度參數(shù)，預(yù)熱完畢后將精密稱(chēng)取的大青葉50g放入萃取缸Ⅱ，按1.2.1的設(shè)計(jì)將壓力值調(diào)整到需要的參數(shù)，同時(shí)向副泵系統(tǒng)下的夾帶劑缸中加入氯仿100mL，開(kāi)動(dòng)副泵，開(kāi)始萃取.每半小時(shí)收集一次分離液，至2h內(nèi)連續(xù)收集不到液體時(shí)停止該次實(shí)驗(yàn).將收集到的分離液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用甲醇定容于10mL容量瓶中，作為供試品溶液.

1.2.3色譜條件以甲醇0.015mol/L醋酸銨（72∶28）（用醋酸以1∶150的比例調(diào)節(jié)pH值）為流動(dòng)相；流速為1.0mL/min；檢測(cè)器靈敏度：1.0AUFS；柱溫20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)289nm.理論板數(shù)按靛玉紅峰計(jì)算不低于4000.對(duì)照品及樣品色譜圖不同(圖1,2).

圖1靛玉紅對(duì)照品的色譜圖（略）

圖2樣品色譜圖（略）

1.2.4線性考察精密稱(chēng)取靛玉紅對(duì)照品10mg，用甲醇定容于50mL容量瓶中，超聲5min，制成0.2g/L的對(duì)照品溶液，分別精密吸取該對(duì)照品溶液3,2,1,0.5及0.2mL于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度.各取以上5個(gè)對(duì)照品溶液20μL進(jìn)樣于HPLC系統(tǒng)中，以色譜峰面積對(duì)靛玉紅進(jìn)樣濃度作線性回歸，得回歸方程Y=10.83427+0.68547X,r=0.9994.靛玉紅在8~120mg/L內(nèi)，線性關(guān)系良好.

1.2.5精密度測(cè)定取線性關(guān)系中同一對(duì)照品液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，靛玉紅峰面積RSD為1.74%.

1.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將同一供試品液在0,1,2,4,12h各進(jìn)樣一次測(cè)試峰面積，結(jié)果RSD為2.65%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一供試品液5份，依法測(cè)定，結(jié)果靛玉紅平均含量為17.33μg/g，RSD為2.07%.

1.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取已知含量的同一供試品液3份，每份1mL，分別精密加入0.4mL濃度為0.04g/L的對(duì)照品溶液，按樣品含量測(cè)定方法操作，平均回收率為102.8%,RSD為1.48%.

1.2.9樣品測(cè)定精密吸取上述正交實(shí)驗(yàn)提取的供試品溶液各20μL進(jìn)樣,按1.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定.

2結(jié)果

外標(biāo)法計(jì)算靛玉紅含量（表1），并計(jì)算每個(gè)因素每水平的靛玉紅含量（表2）.

表1不同工藝的靛玉紅含量（略）

表2每個(gè)因素每水平的靛玉紅含量（略）

K值為每因素每水平的三個(gè)值之和，如K1為每因素水平為1時(shí)的三個(gè)值的和，余同.R為級(jí)差，即K1,K2和K3三個(gè)值中最大值與最小值之差.

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果萃取溫度、萃取壓力及分離壓力對(duì)靛玉紅的回收率均有顯著影響（P<0.05）.將級(jí)差R值依大小排列，則影響靛玉紅含量的四因素主次順序?yàn)檩腿囟?gt;萃取壓力>分離壓力>分離溫度.以每個(gè)因素每水平的K值中的最大值得知：最佳工藝為萃取溫度50℃、萃取壓力40MPa、分離溫度40℃及分離壓力8MPa.按最佳工藝條件萃取了三份大青葉（50g）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果靛玉紅平均含量為21.87μg/g，表明該工藝穩(wěn)定，測(cè)定值在較高范圍.

3討論

3.1萃取實(shí)驗(yàn)條件的選擇在設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)時(shí)，為更準(zhǔn)確地定位萃取溫度的水平范圍，在SFE的預(yù)實(shí)驗(yàn)中做過(guò)萃取溫度最高60℃和最低30℃（其他條件固定不變）的靛玉紅回收率比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫萃取回收率較高，故在正交設(shè)計(jì)中舍去萃取溫度30℃這個(gè)水平.另三個(gè)因素的水平設(shè)定是依據(jù)儀器的工作參數(shù)而定的.在選擇夾帶劑時(shí)曾做過(guò)氯仿和甲醇的比較，因?yàn)榈逵窦t在冷甲醇中易析出，故本實(shí)驗(yàn)選擇氯仿為萃取夾帶劑.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中考慮了萃取時(shí)間和CO2流量的影響，結(jié)果不同的實(shí)驗(yàn)條件下，分離液的流出沒(méi)有固定的時(shí)間規(guī)律，萃取儀CO2流量在2L/h左右,不可調(diào)節(jié),故未將萃取時(shí)間和CO2流量?jī)梢蛩丶{入正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中.

3.2HPLC條件的選擇靛玉紅在242,292,362,544nm處有吸收［2］，而本實(shí)驗(yàn)中靛玉紅的紫外最大吸收波長(zhǎng)為289nm.實(shí)驗(yàn)曾用乙腈與水配比作流動(dòng)相，在反相色譜中用有機(jī)堿三乙胺調(diào)節(jié)峰形，結(jié)果效果不理想.最后用甲醇比水加入醋酸銨，用酸適當(dāng)調(diào)整pH值，所得結(jié)果峰形理想，分離效果好.曾直接以氯仿作溶劑進(jìn)樣，結(jié)果氯仿有較強(qiáng)的吸收峰，改為甲醇作溶劑后得以改善.

查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)類(lèi)似有關(guān)大青葉中靛玉紅SFE工藝的報(bào)道.而大青葉中含有的其他活性成分［3］是否被萃取出來(lái)，其含量如何，則有待進(jìn)一步研究.

【參考文獻(xiàn)】

［1］唐俐，段積華.靛玉紅及其衍生物的研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,25(2):219-221.

［2］李彬,鄭國(guó)平.高效液相色譜法測(cè)定錫類(lèi)散中靛玉紅的含量［J］.藥物鑒定,2004,13(5):39-40.

［3］陳海紅，孫建宇.大青葉的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2004,13(8):79-80