腦得生丸葛根異黃酮提取

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【摘要】目的優(yōu)選腦得生丸中有效成分葛根異黃酮的提取工藝。方法以正交設(shè)計安排試驗，采用高效液相色譜法測定葛根素和大豆苷的含量，并以此為指標(biāo)考察溶劑濃度、溶劑用量、提取時間3個因素對異黃酮提取率的影響。結(jié)果用12倍量的體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇回流提取2次，每次1h的條件為最佳提取工藝。結(jié)論本提取工藝設(shè)計合理，穩(wěn)定，可為腦得生丸的進一步開發(fā)提供可靠的實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】腦得生丸；異黃酮；葛根；大豆苷；提取工藝

腦得生丸收載于《中國藥典》2005年版一部，由三七、川芎、紅花、山楂和葛根等加工而成的蜜丸［1］。具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、醒腦開竅之功效，是治療腦動脈硬化、腦中風(fēng)及腦出血后遺癥的常用藥。葛根為豆科植物野葛［Puerarialobata(Willd.)Ohwi］的干燥根，主要含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分，能改善冠脈、腦和外周血循環(huán)，抑制血小板聚集，降低血壓，降低心肌耗氧量［2，3］。由于腦得生丸處方所含有效成分的極性差別較大，為進一步純化的需要，本課題組將其處方分為葛根、紅花和三七、川芎、山楂兩個部分，分別進行提取工藝研究。本文對葛根和紅花這部分進行報道，以葛根素、大豆苷作為異黃酮類成分的定量指標(biāo)，探討了腦得生丸中葛根異黃酮的最佳提取工藝條件。

1儀器與試藥

1．1儀器

Waters2695型高效液相色譜儀；Waters2996二級管陣列檢測器；WatersEmpower色譜工作站；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和B220型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；十萬分之一電子分析天平（SHIMADZU）；純水制備系統(tǒng)（重慶艾科浦）；SHBIV22B循環(huán)水多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1．2試藥

色譜甲醇，自制純凈水，其它試劑均為分析純；葛根和紅花藥材購于河南省藥材總公司，由我院生藥教研室李書淵教授分別鑒定為豆科植物野葛［Puerarialobata(Willd.)Ohwi］的干燥根和菊科植物紅花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花；葛根素和大豆苷對照品（批號：7522200108，中國藥品生物制品檢定所）。

2方法與結(jié)果

2．1色譜條件

以十八烷基鍵合硅膠柱為色譜柱；以甲醇水(體積比20∶80)為流動相；檢測波長為250nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃。

2．2對照品溶液的配制

精密稱取葛根素和大豆苷對照品，分別置10mL容量瓶中，加入甲醇5mL，超聲溶解后，用甲醇定容至刻度，制得葛根素質(zhì)量濃度為0.512mg·mL-1，大豆苷質(zhì)量濃度為0.925mg·mL-1，密封保存，備用。

2．3藥材溶液的制備

取葛根藥材粉末(過3號篩)，精密稱定，置錐形瓶中，精密加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇50mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密移取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0mL置10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。進樣體積10μL,按色譜條件測得進樣量與峰面積,計算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1兩種異黃酮的回歸方程和線性范圍（略）

Tab.1RegressionequationsandlinearrangesoftwokindsofIsoflavone

2．5提取工藝條件優(yōu)選［5］

按復(fù)方腦得生丸處方量的1/5，稱取紅花18.2g與葛根52.2g，等量9份藥材。按正交設(shè)計安排試驗(見表2)，回流提取2次，合并濾液，回收溶劑至500mL，定量移取25mL，置1000mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為正交試驗的供試樣品溶液。進樣10μL,照“2.1”項下色譜條件測定。由外標(biāo)法分別計算葛根素和大豆苷含量，兩者之和為異黃酮的含量。結(jié)果見表3。

表2因素和水平表（略）

Tab.2Factorsandlevels

2．6陰性干擾試驗

稱取紅花藥材18.2g，加體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇12倍量，回流提取2次，1h/次。以下操作同“2.5”項操作。色譜圖見圖1。

A.對照品;B.供試樣品;C.陰性樣品

1.葛根素;2.大豆苷

圖1高效液相色譜圖（略）

Fig.1HPLCchromatograms

表3正交實驗L9(3)4結(jié)果分析表（略）

Tab.3AnalysisoftheorthogonalexperimentL9(34）

*相當(dāng)于每克葛根藥材中的含量

表4方差分析表（略）

Tab.4Analysisofvariance

3討論

3．1由表3中的R值可看出,影響異黃酮含量提取的主次因素依次為溶劑濃度>提取時間>溶劑用量。表4的方差分析表明，溶劑濃度對試驗有顯著性意義，提取時間次之，溶劑用量影響相對較小。但采用低濃度乙醇回流提取時雜質(zhì)較多，結(jié)合生產(chǎn)需要，確定腦得生丸中異黃酮類成分的優(yōu)選提取工藝為A1B2C2,即：選用12倍量的體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇，回流提取2次，每次1h。按此工藝進行，以葛根素和大豆苷為指標(biāo)，相對于葛根藥材，其異黃酮的轉(zhuǎn)移率可達(dá)到90%以上。

3．2本研究首次以葛根素和大豆苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜法考察腦得生丸中異黃酮的提取工藝。該方法與文獻［6,7］所采用的UV法相比，結(jié)果更準(zhǔn)確，所優(yōu)選的提取工藝切實可行。

【參考文獻】

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2005年版一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：572.

［2］禹志領(lǐng)，張廣欽，趙紅旗.葛根總黃酮對腦缺血的保護作用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報,1997,28(11):310～312.

［3］曹鐘靈，李建北，張東明.葛屬植物中異黃酮類化合物的研究進展［J］.中藥材，2005,28(1):67～71.

［4］祝世發(fā)，陳文，江發(fā)壽，等.葛根中葛根素的提取工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2004,15(3):114.

［5］周永治，馬志慶.醫(yī)藥數(shù)理統(tǒng)計［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，2005.

［6］楊世軍，張會香，周怡靜.葛根中異黃酮的提取與純化工藝研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(8):124～127.

［7］李青坡，王永圣，游劍，等.葛根總異黃酮提取工藝的研究［J］.中國藥業(yè)，2004，13(5):46～47.