豬鏈球菌分離和鑒定
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2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關(guān)節(jié)炎和敗血癥。無菌采取患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學(xué)鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細(xì)菌回收試驗、藥敏試驗。結(jié)果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關(guān)節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。
論文完成日期：2000年6月15日
目錄
摘要………………………………………………1
前言………………………………………………2
1.試驗材料……………………………………….2
2.方法…………………………………………….2
2.1病原分離……………………………………..2
2.2分離菌株的鑒定……………………………..2
2.3致病力及保護力試驗………………………..3
2.4藥敏試驗……………………………………..3
3.結(jié)果…………………………………………….4
3.1分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征….………….4
3.2生化試驗結(jié)果………………………………..5
3.3血清學(xué)鑒定結(jié)果……………………………..5
3.4致病力試驗及保護力試驗結(jié)果……………..5
3.5細(xì)菌回收試驗結(jié)果…………………………..5
3.6藥敏試驗結(jié)果………………………………..5
4分析與討論…………………………………….6
參考文獻…………………………………………7
豬鏈球菌的分離與鑒定
摘要
2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關(guān)節(jié)炎和敗血癥。無菌采取患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學(xué)鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細(xì)菌回收試驗、藥敏試驗。結(jié)果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關(guān)節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。
關(guān)鍵詞：豬鏈球菌分離鑒定
前言
豬鏈球菌（Streptococcosissuis）是豬的一種重要疾病，養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家如美、英、荷及愛爾蘭等常有本病發(fā)生。我國于1958年就有豬鏈球菌病的報道，1976年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大危害。
豬鏈球菌截止到目前已發(fā)現(xiàn)的莢膜型已超過30種[1]。我國于1995年首例鑒定證實2型豬鏈球菌在我國的存在[2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)內(nèi)均可檢出病原體。未經(jīng)無害處理的病死豬肉、內(nèi)臟及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發(fā)生，但以4—10月份發(fā)生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進行防治，則發(fā)病率、病死率很高，慢性常為地方性散發(fā)性傳染。
2000年4月，岐山縣種豬繁育場仔豬流行關(guān)節(jié)炎及敗血癥，多為2—6周齡仔豬。無菌采取關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)實驗室分離鑒定，證實為2型豬鏈球菌。現(xiàn)將分離鑒定結(jié)果報告如下。
1．實驗材料
1．1病料無菌采取岐山縣種豬繁育場患關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液8份，編號為1—8號，無菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)8份，編號為9—16號。
1．2試劑試驗所用的各種糖均購自上海化學(xué)試劑二廠，批號自95—98年不等。
1．3培養(yǎng)基綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備[8]。
1．4血清學(xué)試驗豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為990705。
1．5藥敏紙片購自浙江省軍區(qū)后勤部，批號20000312。
1．6試驗動物健康小白鼠（30—35g）50只，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。
2．方法
2．1病原分離
將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4℃，冷藏備用。
2．2分離菌株的鑒定
2．2．1生化試驗
隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉實糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其對糖的利用情況。2．2．2血清學(xué)鑒定
將3#、8#、13#、15#菌經(jīng)緩沖肉湯培養(yǎng)8h，通過3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2的0.01mol/LPBS制成1*1010~2*1010細(xì)菌懸液。取1滴上述細(xì)菌懸液與適當(dāng)?shù)目寡逶跐崈舨Ｆ匣靹颍⒓从^察凝集現(xiàn)象。同時，設(shè)立細(xì)菌懸液對照及血清對照。
2．3致病力及保護力試驗
2．3．1菌落形成單位的測定按常規(guī)方法進行[9]
2．3．2致病力試驗
無菌吸取上述血清肉湯培養(yǎng)物（含菌量5.0*108CFU/ml）以0.1ml/只、0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只分別腹腔注射小白鼠2只，觀察其死亡時間和數(shù)量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7組。第一組，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每只注射8#菌0.2ml，第三組每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每只注射13#菌0.2ml，第五組每只注射15#菌0.2ml，第六組每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每只注射無菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養(yǎng)觀察其死亡時間及數(shù)量。
2．3．3保護力試驗
將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于18cm鮮血平板。37℃培養(yǎng)24h后，收菌，用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔m當(dāng)稀釋，然后用0.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無菌檢驗。然后分別腹部皮下接種小白鼠2只，0.4ml/只。10天后，再分別人工感染，0.2ml/只。
2．3．4細(xì)菌回收試驗
對致病力試驗出現(xiàn)癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進行分離。
2．4藥敏試驗
采用紙片擴散法，用無菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，4℃2h使藥物擴散，然后置37℃培養(yǎng)20—24h，觀察結(jié)果。結(jié)果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標(biāo)準(zhǔn)，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結(jié)果評定參照表1。
表1各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標(biāo)準(zhǔn)
抗菌藥物名稱
抑菌圈直徑（mm）
耐藥
中度敏感
高度敏感
青霉素
土霉素
潔霉素
鏈霉素
慶大霉素
卡那霉素
頭孢菌素
<10
<10
<10
<10
<12
<12
<10
10~12
10~14
10~14
10~14
13~14
13~14
10~15
>13
>15
>15
>15
>15
>15
>15
3．結(jié)果
3．1分離細(xì)菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征
3．1．1培養(yǎng)特性
37℃培養(yǎng)24h后，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環(huán)。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。
3．1．2染色特性
關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性，在關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂培養(yǎng)物中多呈單個、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物中多呈長鏈狀。
3．2生化試驗結(jié)果（見表2）
表2分離菌生化試驗結(jié)果
鑒定蔗糖山梨棉實葡萄甘露蕈糖乳糖菊糖水楊馬尿
項目醇糖糖糖苷酸鈉
3#+--++++++-
8#+--++++++-
13#+--++++++-
15#+--++++++-
判定標(biāo)準(zhǔn)：“+”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陽性；“-”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陰性。
表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。
3．3血清學(xué)鑒定結(jié)果
將3#、8#、13#、15#細(xì)菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現(xiàn)象，但不與1型及其他型抗血清出現(xiàn)凝集。直接挑取細(xì)菌菌落與血清混勻，也能得到一致結(jié)果。陰性對照均未見凝集現(xiàn)象。
3．4致病力試驗結(jié)果及保護力試驗結(jié)果
3．4．1致病力試驗結(jié)果
第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養(yǎng)物48h內(nèi)均未見死亡，第三組48h內(nèi)有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養(yǎng)物18h內(nèi)全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發(fā)紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組死亡數(shù)量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2只，48h后處死，剖檢發(fā)現(xiàn)注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。3．4．2保護力試驗結(jié)果免疫的小白鼠再經(jīng)攻毒后均未發(fā)病。
3．5細(xì)菌回收試驗結(jié)果
將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進行細(xì)菌分離、生化試驗及血清學(xué)鑒定，能得到原分離菌。
3．6藥敏試驗結(jié)果（見表3）
表3藥敏試驗結(jié)果
菌號
抑菌環(huán)直徑（mm）
頭孢菌素青霉素潔霉素卡那霉素土霉素鏈霉素慶大霉素
3#19151413877
8#18161313867
13#19161413778
15#19151314888
平均值18.7515.513.513.257.757.07.5
表3表明，結(jié)果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：潔霉素和卡那霉素；而對土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有抗藥性。
4．分析與討論
4．1豬鏈球菌（Streptoccussuts）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開始增加。那時僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見的。
4．2豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關(guān)節(jié)炎型支氣管炎型等。過去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關(guān)于集約化養(yǎng)豬場關(guān)節(jié)炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場，約有60%的仔豬流行關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者可發(fā)生敗血癥而死亡，給種豬場造成巨大的經(jīng)濟損失。所以，研究本病可為生產(chǎn)中防制本病提供理論依據(jù)。
4．3病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)內(nèi)均帶有病原體，所以，我們建議，首先應(yīng)加強對健康豬的免疫。另一方面，在發(fā)病后，加強病豬和健康豬的隔離，根據(jù)實驗室所做的藥敏試驗結(jié)果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場采納我們的建議后，首先對所有的未發(fā)病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發(fā)病的豬用青霉素等藥物配合治療。另外，注意衛(wèi)生管理。目前該病已得到有效的控制。
4．4從致病力試驗結(jié)果可以看出，引起豬關(guān)節(jié)炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強。但通過生化試驗和血清學(xué)鑒定，它們又是同種細(xì)菌且血清型也相同。為什么同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個問題還有待于進一步研究。
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