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本研究以栽培青稞品種(系)為材料,采用IT-ISJ標記技術分析了該標記在大麥中應用的可行性,并評價了這些材料間的遺傳關系,可為大麥育種、品種鑒定、新品種保護與利用提供依據。1材料與方法1.1實驗材料供試材料共34份,包括西藏材料9份(XZ1-XZ9)、甘肅材料5份(GS1-GS5)、四川材料5份(SC1-SC5)及9份青海材料(QH1-QH9)和6份國外材料(AB1-AB6)。其名稱及來源見表1。這些材料現保存于四川農業大學大麥研究中心。1.2方法1.2.1gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法[6]。
每份材料取新鮮健康的幼葉約300mg,置于液氮中迅速研磨至粉末,隨后將粉末轉移到2ml離心管中,加入800μL65℃預熱的2×CTAB提取液[0.2mmol/LTris-HCL(PH約8.0),0.02mmol/LEDTA,55mmol/LCTAB,2%β-巰基乙醇)]于65℃水浴至少50min,期間輕輕顛倒混勻幾次,取出離心管冷卻至室溫,然后加入800μL氯仿:異戊醇(24:1)輕搖10min后靜置30min,11000r/min離心15min,取上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA,用70%乙醇沖洗2次,90%乙醇再沖洗1次,干燥后加入50μl滅菌的ddH2O,用紫外分光光度計檢測其濃度與質量。將DNA稀釋至20ng/μL于-20℃保存備用。1.2.2IT-ISJ反應體系。PCR引物(表2)采用鄭靚等[2]已發表的引物,由上海英捷貿易有限公司合成。引物組合以正反向引物名稱的最后兩個字母組合表示。PCR擴增通過正交試驗設計選出最佳體系,總體積20μL,包括20ng/μL模板DNA2μL,1.5mmol/L的MgCl2,0.2mmol/L的dNTPs,0.5μmol/L引物,1UTaq聚合酶,2μL10×PCRbuffer。在PTC-200擴增儀上完成。反應程序為:94℃預變性5min,94℃變性45s,53℃退火45s,72℃延伸lmin,40個循環,72℃延伸10min,4℃保存。1.2.3擴增產物的檢測。擴增產物加3×Loading-Buffer10μL,95℃變性5min后,用預熱30min的8%變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率75w電泳,至指示劑離膠板底部三分之一處(約45min),取下膠板。采用銀染法檢測[5]。用數碼相機拍照,統計帶型。1.2.4數據的處理。對IT-ISJ擴增產物的電泳結果采用0、1、-9統計建立數據庫,在相同遷移位置有帶記為1,無帶記為0,模糊不清或其他原因記為-9。
遺傳多樣性指數(H)按H=1-∑Pi2(Nei等,1979)[7]計算,其中Pi為某座位第i個等位變異的頻率。利用NTSYS-pc統計分析軟件計算遺傳相似系數(GS)。計算公式為:GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Nij為材料i和j共有的擴增片段數,Ni為材料i中出現的擴增片段數,Nj為材料j中出現的擴增片段數。2結果與分析2.1引物組合篩選用10個正向引物和12個反向引物組成的120對引物組合,對選取的兩個品種(北青2號、北青3號)進行多態性篩選,其中74對引物能擴增出條帶,占引物組合總數的61.67%。有55對引物組合能擴增出多態性,多態性比例占45.83%。并用相同引物對和模板進行多次擴增和電泳,其帶型沒有變化,表明IT-ISJ標記在大麥上具有較好的重現性。從這55對引物中選取擴增性較好、重復性較高的20對引物對所有材料進行多態性分析,統計在100~2000bp之間能夠清晰可辨的電泳條帶。其中,引物組合IT-ISJ02F47R可區分11個品種,而引物組合IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R和IT-ISJ11F54R各自能區分10個品種。特別是可用5個引物組合(IT-ISJ02F08R、IT-ISJ02F42R、IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R)就能將本試驗中的34份材料區分開,占引物組合總數的25.00%。2.2多態性分析圖1為引物組合IT-ISJ05F18R擴增產物部分電泳圖。發現不同的引物對擴增的條帶數、擴增帶型都不同(表3)。從表3看出,在總樣本中,20對引物組合共產生清晰可辨的條帶數為1~8條,大部分在4條以上,總計87條,平均每個引物對4.35條,其中81條具有多態性,平均多態性條帶為4.05條,多態性條帶為93.10%。在這20對引物中,3個引物對IT-ISJ02F18R、IT-ISJ11F46R、IT-ISJ05F18R的多態性條帶比率分別為50.00%、60.00%、71.42%,其余17對引物的多態性條帶比率為100%。這表明IT-ISJ標記適合于對大麥進行DNA多態性分析。2.3等位變異與遺傳相似性從表3可知,20對引物共擴增出134個等位變異(帶型),變幅在2~11個,平均每個引物對檢測到6.70個。34份材料間的遺傳相似系數(GS)變幅在0.437~0.931之間,平均為0.743±0.094。其中,l來自墨西哥的CI-424(AB4)和北青3號系選的SC5間相似系數最小(0.436),而北青1號(QH2)和北青2號(QH3)間相似系數最大,達0.931。
供試材料中,相似系數<0.75的材料組合有238個,占組合總數的42.42%,相似系數>0.75的材料組合有323個,占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離較低,僅為0.257,遺傳多樣性在0.2509~0.8460之間,平均為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小。3討論與小結IT-ISJ(introntargeredintron-exonsplicejunction,內含子-外顯子拼接位點)DNA分子標記技術是近年來由鄭靚等(2008)[2]開發出的,具有多態性高、穩定性好、引物設計簡便、操作簡單、成本低等優點,已在陸地棉[2]、花生[3]、蘋果[4]上有報道。但該標記應用于大麥上還未見報道。
在本研究中,我們首次用IT-ISJ的10個正向引物和12個反向引物組成120對引物,對選取的2個青稞品種(北青2號、北青3號)進行了引物對的篩選。篩選出多態性較高、帶型豐富、條帶清晰的引物組合55個,占引物組合總數的45.83%,遠高于紀君超等(2010)[4]在加工蘋果品種中報道的結果。從55對引物組合中選取20對引物組合對34份青稞品種(系)進行了多態性分析,共擴增出87條帶,其中多態性帶81條,平均每對引物組合擴增出4.05條帶,多態性百分率為93.10%。而多態性高達100%的引物組合數達17個,占85.00%,明顯高于鄭靚等(2008)[2]在陸地棉、于樹濤等(2009)[3]在花生上及紀君超等(2010)[4]在蘋果中所得結果。在這20對引物中,3個引物對IT-ISJ02F18R、IT-ISJ11F46R、IT-ISJ05F18R的多態性條帶比率分別為50.00%、60%、71.42%。從圖1和表3看出,不同的引物對擴增的條帶數、擴增帶型都不同。引物組合IT-ISJ02F47R可區分11個品種,而引物組合IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R和IT-ISJ11F54R各自能區分10個品種。特別是僅用5個引物組合(IT-ISJ02F08R、IT-ISJ02F42R、IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R)就能將本試驗中的34份材料區分開,占引物組合總數的25.00%。
上述結果表明,采用IT-ISJ引物組合對青稞品種(系)能擴增得到條帶清晰、穩定性較好、多態性較高的條帶、且操作簡單、成本較低,這表明IT-ISJ標記應用在大麥上是可行的,將在大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定,遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇育種中得到廣泛的應用。34份材料間的遺傳相似系數(GS)變幅在8大麥與谷類科學BARLEYANDCEREALSCIENCESNO.4.20120.437~0.931之間,平均為0.743±0.094。供試材料中,相似系數<0.75的材料組合有238個,占組合總數的42.42%,相似系數>0.75的材料組合有323個,占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離僅為0.257,平均遺傳多樣性為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小,遺傳基礎較窄,遺傳關系較近。因此,大麥育種者在雜交育種中應廣泛發現和挖掘優異青稞資源,擴大青稞種質的遺傳基礎,提高青稞育種效率。
作者:余春磊劉家嫻齊國昌羅小嬌劉新春馮宗云單位:四川農業大學農學院植物遺傳育種學系大麥研究中心四川甘孜藏族自治州農業科學研究所