白蛾HcNPV室內增殖研究

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本文作者：鄭桂玲1周洪旭1耿以龍2杜方嶺3王未名3李長友1作者單位：1.青島農業大學農學與植物保護學院2.青島市森林病蟲害防治工作站3.山東省農業科學院原子能農業應用研究所

美國白蛾屬鱗翅目燈蛾科，是一種世界性的檢疫害蟲，原產于北美，1979年傳入我國，其寄主范圍廣泛，喜食的植物主要有桑、白蠟、法桐、臭椿、榆、楊、柳等，其成蟲產卵量大，幼蟲具有暴食性，對我國林業和園林綠化造成嚴重損失。對美國白蛾采取安全有效并與環境友好的生物防治措施非常重要［1］，美國白蛾核型多角體病毒(hcnpv)對防治美國白蛾幼蟲具有高效、專一和安全等優點，可有效降低化學藥劑對環境的污染，可以大面積應用［2－4］。但病毒作為殺蟲劑在應用之前，首先要解決大量增殖問題。目前，采用活蟲體進行增殖依然是獲得大量病毒的主要途徑［5］，蟲齡和接種濃度(劑量)是影響病毒大量增殖的主要因素［6－7］。2008年作者從青島市郊區美國白蛾病死幼蟲體內分離了1株美國白蛾核型多角體病毒，作者對幼蟲齡期、接種劑量及其組合對該HcNPV產量的影響進行了研究，篩選出適合大量增殖的最佳條件，以期為該病毒的大量增殖和病毒殺蟲劑的生產提供理論依據。

1材料與方法

1．1材料

美國白蛾采集于青島市城陽區，在室內用人工飼料連續飼養，選取大小一致的健康幼蟲，供試驗用。美國白蛾人工飼料參照隋賀等的配方［8］。美國白蛾核型多角體病毒為本室2008年從青島市城陽區病死的美國白蛾幼蟲體內分離的毒株。

1.2方法

1.2.1病毒的提取和病毒懸液的制備

用4齡美國白蛾幼蟲增殖HcNPV青島分離株，收集病毒致死幼蟲。用0.2%次氯酸鈉消毒幼蟲5min，滅菌水沖洗2遍，加入滅菌水，將死蟲用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過濾。病毒提取采用差數離心法，濾液經500r/min離心15min，棄沉淀，上清液采用5000r/min離心20min，如此重復3次，獲得病毒多角體懸液，血球計數板計數測得病毒濃度，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.2飼毒和飼養方法

設飼毒蟲齡分別為4，5，6齡;飼毒劑量分別為1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭，共15個處理。將人工飼料切割成5mm2的小片，放入24孔培養板內，每孔1塊，取HcNPV分別稀釋成1.48×108，1.48×107，1.48×106，1.48×105，1.48×104OBs/mL，每塊飼料滴加以上各濃度病毒液10μL，以滴加滅菌水作為對照，分別飼喂4，5，6齡美國白蛾幼蟲，24h后選取吃光飼料的幼蟲放入養蟲盒內，每盒15頭，每處理30頭幼蟲，3次重復，每天檢查并更換新鮮人工飼料，待幼蟲發病后鏡檢，每天觀察2次，將不同處理的病死蟲分別收集，并記錄死蟲數量，直到幼蟲化蛹為止。

1.2.3病毒產量測定

將每一處理的病死蟲分別用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過濾，濾液采用5000r/min離心20min沉淀病毒，用無菌水懸浮后定容稀釋，用血球計數板計數測得病毒濃度，根據稀釋倍數、定容體積和死蟲數計算平均單頭幼蟲的病毒產量，同時根據幼蟲死亡率計算百頭幼蟲的病毒總產量，病毒總產量的計算方法為單頭幼蟲病毒產量×死亡率(%)×100。

1.2.4數據分析

試驗數據應用DPS軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1蟲齡、病毒劑量及其組合對單頭幼蟲病毒產量的影響

測定了4，5，6齡幼蟲分別接種1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭劑量時單頭美國白蛾幼蟲病毒多角體的產量。方差分析(數據略)結果表明，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對單頭幼蟲病毒產量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是蟲齡，其次是劑量以及蟲齡和劑量的組合。單頭幼蟲病毒的產量隨著蟲齡的增大而明顯增加，接種6齡幼蟲的平均單頭幼蟲病毒產量最高，其次為5齡幼蟲的產量，而4齡幼蟲的產量最低，6齡、5齡與4齡幼蟲之間差異極顯著，結果見表1。6齡幼蟲病毒產量為4齡幼蟲病毒產量的2.99倍，5齡幼蟲病毒產量為4齡幼蟲的2.67倍，接種病毒時蟲齡越高，蟲體越大，單頭幼蟲的病毒產量越高。

2.2蟲齡、病毒劑量及其組合對幼蟲死亡率的影響

對蟲齡、劑量以及蟲齡和劑量的組合影響幼蟲死亡率的數據進行方差分析，結果表明，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對幼蟲死亡率的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲齡，最后是蟲齡和劑量的組合。各齡幼蟲的死亡率與劑量呈正相關，死亡率隨著劑量的增大而增加;在相同劑量下，死亡率與蟲齡呈負相關，幼蟲死亡率隨著蟲齡的增大而減小(數據見表2)。

2.3蟲齡、病毒劑量及其組合對病毒總產量的影響

對蟲齡、劑量以及蟲齡和飼毒劑量的組合影響病毒總產量的情況進行的統計和方差分析顯示，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對病毒總產量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲齡，最后為蟲齡和劑量的組合。蟲齡和劑量的不同組合對單頭幼蟲的病毒產量以及幼蟲死亡率等2個決定病毒總產量的因素均有影響，進而對病毒總產量產生影響。由表2可見，在室內大量增殖HcNPV時，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲均可以獲得最高的病毒產量，百頭幼蟲的病毒總產量可分別達到1.55×1011OBs和1.50×1011OBs。

3結論與討論

病毒的大量增殖是其作為殺蟲劑生產和應用的前提，本文對美國白蛾核型多角體病毒增殖時蟲齡、接種劑量及其組合的影響進行的測定和分析結果表明，蟲齡、劑量及其組合對單頭幼蟲病毒產量、幼蟲死亡率和病毒總產量均具有顯著影響。病毒總產量取決于單頭幼蟲病毒產量和死亡率的大小，而單頭幼蟲病毒產量和死亡率會受到蟲齡、劑量以及二者的相互作用等影響。單頭幼蟲的病毒產量隨著蟲齡的增大而增加，而隨著劑量的增加呈降低趨勢;幼蟲死亡率則隨劑量的增大而增加，隨蟲齡的增大而降低。因此，為獲得最高的病毒總產量，需要綜合分析，篩選用于增殖病毒的最佳蟲齡和劑量組合。

本研究表明，在室內大量增殖HcNPV時，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲均可以獲得最高的病毒產量，百頭幼蟲的病毒總產量可達到1．55×1011OBs和1．50×1011OBs，而單頭幼蟲的病毒產量最高可達2．319×109OBs，與艾德洪等［2］報道的用5．5×107PIB/mL的病毒感染4齡美國白蛾幼蟲可獲得最高的多角體收獲量的結果有所不同，這可能是不同的毒株在殺蟲毒力和殺蟲速度上的差異引起的。影響病毒增殖產量的最主要因子是飼毒時的蟲齡和劑量(或濃度)［6－7］，此外還有報道，持續飼毒時間、溫度和光照周期等因子也會不同程度的影響病毒的產量［9］。本文主要對影響病毒產量的2個關鍵因子進行了分析，其它因子對其產量是否產生影響以及影響的大小，有待進一步測定和分析。