鑒定藏靈菇菌

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本文作者：孫婷、王芳、李梅花、孫春玲、劉文俊、于潔、張家超、張和平單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

藏靈菇又稱“西藏靈菇”,是一種乳白色、膠質(zhì)塊狀物,外形酷似米粒,上面棲息著多種微生物,能在乳中快速生長(zhǎng),并集結(jié)成塊,看起來(lái)很像雪蓮,也稱“西藏雪蓮”[1]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載,“西藏雪蓮”主要具有以下功效:(1)可以加速唾液、胃酶及胰酶的分泌,增強(qiáng)食欲和幫助消化。(2)乳酸菌分解糖所產(chǎn)生的乳酸和醋酸,具有使腸內(nèi)pH下降,抑制腐敗菌和病原菌繁殖,從而抑制小腸腐敗。微量的乙醇可以促進(jìn)新陳代謝,使循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)正常化,對(duì)于胃腸病、代謝異常病有較好的治療與預(yù)防作用。(3)能夠降低膽固醇,有效防止高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率。(4)其活性物質(zhì)成分以及微生物所形成的抑制致病菌的抗菌性物質(zhì)能抑制癌癥的發(fā)生及癌細(xì)胞增殖[24]。目前對(duì)藏靈菇的研究還屬于起步階段,相關(guān)的報(bào)告并不多,根據(jù)一些相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道藏靈菇中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌,其中乳酸菌包括開(kāi)菲爾乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌;酵母菌包括啤酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、單孢酵母等[5],同時(shí)也有部分文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)藏靈菇中含有醋酸菌[6],肖琳琳等人從藏靈菇中分離出多株乳球菌、乳桿菌和酵母菌,并從中篩選出一株能高效降解膽固醇的干酪乳桿菌[7],劉變芳等人也從藏靈菇中分離出乳桿菌、乳球菌及酵母菌[8]。然而,近年來(lái)對(duì)藏靈菇中乳酸球菌的研究比較少,特別是運(yùn)用多種方法研究其中乳酸球菌成分的更少,即使有些文獻(xiàn)報(bào)道,但其研究手段主要采用傳統(tǒng)的鑒定方法。本研究采用傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)與16SrRNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)、16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析等分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的多項(xiàng)分類手段對(duì)藏靈菇中的乳球菌進(jìn)行了鑒定和研究,期望更全面、準(zhǔn)確地對(duì)藏靈菇中乳酸球菌進(jìn)行分離、鑒定和優(yōu)勢(shì)菌群分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來(lái)源及模式菌株:2份藏靈菇樣品采集于西藏日喀則地區(qū)江孜縣東郊鄉(xiāng)和西藏那曲縣桑雄鄉(xiāng)。本試驗(yàn)以購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)模式菌種培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的EnterococcusduransATCC19432作為試驗(yàn)的參考菌株。

1.1.2各種培養(yǎng)基與試劑:改良MRS瓊脂培養(yǎng)基配方(g/L):大豆蛋白胨10,牛肉浸取物10,酵母提取物5,葡萄糖20,乙酸鈉5,檸檬酸三鈉2,吐溫1,磷酸氫二鉀2,七水硫酸鎂0.2,七水硫酸錳0.054,瓊脂15,放線菌酮1×103,蒸餾水1L。在原有配方中添加1g/L的放線菌酮從而達(dá)到抑制真菌生長(zhǎng)的目的。TPY液體培養(yǎng)基,BLB液體培養(yǎng)基,以及其它生理生化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)所用培養(yǎng)基和試劑,參照文獻(xiàn)[9]配制。

1.1.3試驗(yàn)主要儀器:試驗(yàn)主要儀器:變性梯度凝膠電泳儀、PTC-200型梯度基因擴(kuò)增儀,伯樂(lè)公司;電泳儀,Appliedbiosystem公司;TGL-16B高速離心機(jī)、TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī),安亭公司;ND-1000型微量紫外分光光度計(jì),Eppendorf公司;MLS-3780型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器,三洋公司;HHSI-NI恒溫水浴槽,北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司;DOC2000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng),北京六一儀器廠;本試驗(yàn)所用引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成,具體引物序列見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1菌株分離及保存:取經(jīng)過(guò)初步培養(yǎng)后的藏靈菇發(fā)酵乳1mL,用生理鹽水依次稀釋至105、106、107倍,每個(gè)稀釋度取0.1mL涂布于改良MRS瓊脂培養(yǎng)基,37°C厭氧培養(yǎng)48h,然后隨機(jī)選取典型菌落,進(jìn)行培養(yǎng)、涂片、革蘭氏染色、鏡檢、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。凡過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性的球菌初步定為乳酸菌球菌,繼續(xù)在相應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線純化,如此重復(fù)3次,直至鏡檢為純培養(yǎng)物。將純化后的菌株于真空冷凍進(jìn)行保存。

1.2.2乳酸菌球菌的生理生化鑒定:重新活化初步鑒定為乳酸球菌的菌株,據(jù)參考文獻(xiàn)[911]對(duì)供試菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn),對(duì)照菌株為L(zhǎng)actobacilluscaseiATCC393、Lactococcuslactissubsp.cremonsATCC19257,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.3菌株基因組DNA的提取:將供試菌株采用改良的CTAB-凍融方法提取菌株基因組DNA[12],即用液氮反復(fù)凍融后進(jìn)行提取。

1.2.4變性梯度凝膠電泳:PCR擴(kuò)增選用引物V3F和V3R[13],對(duì)供試菌株和參考菌株的16SrRNA基因的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,選用引物V3FG+C和V3RG+C[14]。擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μL)含如下成分:基因組DNA模板約50ng;dNTP(2.5mmol/Leach,TaKaRa)2μL;兩條引物V3FG+C和V3RG+C的終濃度均為0.4mol/L;1.5UDNATaq聚合酶(TaKaRa)0.5μL;10×PCRBuffer5μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94°C5min;94°C40s,65°C50s,0.5°C循環(huán),72°C3min,共20個(gè)循環(huán);94°C40s,55°C50s,72°C3min,共10個(gè)循環(huán);72°C7min。將300ng擴(kuò)增產(chǎn)物于8%的聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行分離,變性劑梯度范圍為27%52%(100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。電泳在恒溫60°C下1×TAE緩沖液中進(jìn)行,電壓200V,時(shí)間4h。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染并對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。將銀染后的凝膠條帶小心切下,溶于100μLTE溶液中,過(guò)夜后取3μL該溶液作為再次擴(kuò)增的模板,使用不含GC夾子的V3區(qū)引物進(jìn)行擴(kuò)增,而后將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.2.516S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析:以供試菌株的DNA為模板,應(yīng)用16S-23SrRNA間區(qū)引物L(fēng)1和G17[15]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL)含如下成分:基因組DNA模板約50ng;dNTP濃度為200μmol/L;兩條引物L(fēng)1和G17的濃度均為10pmol/L;DNATaq聚合酶1.5U;1×PCRbuffer。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94°C2min;94°C30s,54°C30s,72°C1min,共30個(gè)循環(huán);72°C8min[16]。擴(kuò)增16株供試菌株和1株參考菌株的16S-23SrRNA間區(qū)序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠在電壓60V的條件下電泳3h,而后將電泳凝膠用溴化乙錠(EB)染色并分析電泳結(jié)果。

1.2.616SrRNA基因序列分析:使用實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)的引物A27F和A1495R對(duì)參考菌株的16SrRN段進(jìn)行擴(kuò)增,菌體擴(kuò)增條件如下:94°C5min;94°C1min,58°C1min,72°C2min,共30個(gè)循環(huán);72°C10min。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物寄往上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接、校準(zhǔn)、排齊。然后上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并BLAST比對(duì),最后應(yīng)用MEGA4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并完成同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸球菌的傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果將革蘭氏陽(yáng)性,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的球菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示,根據(jù)參考文獻(xiàn)[911]將16株菌株歸為3個(gè)菌群:片球菌群、乳球菌群和腸球菌群。其中14株菌株都能在10°C、45°C、pH4.5、pH9.0、6.5%NaCl環(huán)境下生長(zhǎng),部分菌株能從精氨酸中產(chǎn)生NH3,大多數(shù)菌株能利用乳糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、麥芽糖等,所以將14株菌株初步鑒定為腸球菌群(Enterococcus)。另外IMAU60189與片球菌屬的生理生化性質(zhì)相似,初步鑒定為片球菌群(Pediococcus),IMAU60193與乳酸球菌屬的生理生化性質(zhì)相類似,所以初步鑒定為乳球菌群(Lactococcus)。

2.216S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析為了進(jìn)一步將菌株鑒定到種的水平,對(duì)分離到的16株菌進(jìn)行了16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析。從圖2可以看出Lane1,Lane12與所選用耐久腸球菌的模式菌株處于不同的位置,而其它菌株的條帶與模式菌株處于相同的位置。

2.3變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果為了驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性,本試驗(yàn)又采用變性梯度凝膠電泳分析對(duì)16株菌株進(jìn)行了鑒定。從圖3可以看出IMAU60193(Lane1),IMAU60189(Lane12)的條帶與參考菌株的條帶不在同一位置,而其他菌株的條帶與參考菌株處于同一位置,與16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析結(jié)果是一致的,所以我們將銀染后的凝膠不同位置的條帶切割回收并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序可知Lane1的IMAU60193為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.lactis),Lane12的IMAU60189為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

2.416SrRNA基因序列分析將試驗(yàn)中分離到的16株菌進(jìn)行了16SrRNA基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST),并采用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),比較已測(cè)序菌株與模式菌株的親緣關(guān)系,如圖3所示,從圖中可以看到14株分離菌株與耐久腸球菌的模式菌株親源性較近,IMAU60193與Lactococcuslactissubsp.lactis的模式株親緣性較近,IMAU60189與Pediococcusacidilactici的模式株親緣關(guān)系較近。試驗(yàn)結(jié)果與DGGE測(cè)序結(jié)果相一致。

3討論

藏靈菇的多種保健作用,如藏靈菇具有抗炎癥作用[17],藏靈菇奶對(duì)慢性腸道疾病功能調(diào)節(jié)作用[18],所以目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其微生物組成進(jìn)行了一定的研究,藏靈菇中菌系十分復(fù)雜,但主要菌種為乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌和酵母菌,這些菌株相互依存在藏靈菇中形成了共生體系。而對(duì)藏靈菇中微生物的分離鑒定還是主要采用了傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn),但是由于藏靈菇中微生物菌群的復(fù)雜性,僅用傳統(tǒng)的方法還是無(wú)法準(zhǔn)確地分析藏靈菇中微生物的結(jié)構(gòu),因此在本次試驗(yàn)中我們采用了多項(xiàng)分類方法對(duì)藏靈菇中的乳酸球菌進(jìn)行了鑒定,從而有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的缺陷,更準(zhǔn)確的對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本試驗(yàn)主要對(duì)西藏雪蓮中的乳酸球菌進(jìn)行了分離,從2份樣品中分離得到了14株耐久腸球菌、1株乳酸片球菌、1株乳酸乳球菌乳酸亞種,從試驗(yàn)結(jié)果可以看出耐久腸球菌是藏靈菇中的優(yōu)勢(shì)菌株,在相關(guān)的文獻(xiàn)中還未發(fā)現(xiàn)類似的報(bào)道,其他2菌株與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本相同,表明不同來(lái)源的藏靈菇中優(yōu)勢(shì)菌群種類可能存在差異。腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌,是一種條件致病菌,可引起心內(nèi)膜炎、菌血癥、尿道感染等疾病,且具有抗生素抗性。但是一些能產(chǎn)生細(xì)菌素的腸球菌卻可以作為益生菌應(yīng)用于人們的日常生活中[19],作為一種食品中常見(jiàn)的乳酸菌,在肉制品和其他發(fā)酵食品中也可能起著重要作用。安全性是腸球菌應(yīng)用中的首要問(wèn)題,因此采用不同的方法準(zhǔn)確鑒定耐久腸球菌在日常生活中有著重要的意義。由于耐久腸球菌的鑒定具有實(shí)際意義,所以選用準(zhǔn)確的方法就尤為重要,目前還是主要應(yīng)用傳統(tǒng)的分離純化鑒定方法,需要進(jìn)行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn),卻不能對(duì)分離物進(jìn)行精確的鑒定,不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[2022],所以本試驗(yàn)主要采用了傳統(tǒng)的鑒定方法和不同的分子生物方法相結(jié)合的多項(xiàng)分離鑒定方法對(duì)藏靈菇中的乳酸球菌進(jìn)行了鑒定。從本次試驗(yàn)結(jié)果中可知傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)可以將分離到的菌株鑒定到菌群的水平,由于一個(gè)菌群中包含了多個(gè)種和亞種,其中有些種和種之間,種和亞種之間的一些生理生化性質(zhì)也很相似,所以僅根據(jù)一些生理生化性質(zhì)我們無(wú)法準(zhǔn)確的鑒定到種的水平,甚至是亞種的水平,而rRNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo),它含量大(約占細(xì)菌RNA總量的80%),并存在于所有細(xì)菌中,而且16SrRNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法,大約2500個(gè)種的16SrRNA全序列已經(jīng)被報(bào)。而且rRNA基因序列既具有保守性,又具有高變性,是目前細(xì)菌分類和鑒定中經(jīng)常測(cè)定的序列。

其中16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、DGGE、16SrRNA序列分析作為近幾年主要的分子生物方法,這些分子生物方法可以很好地解決傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種的水平的缺陷。從16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、DGGE電泳條帶中可以看到這兩種方法能有效快速的將16株菌株區(qū)分成3個(gè)不同的種,并通過(guò)16SrRNA基因測(cè)序最終將16株菌株全部準(zhǔn)確的鑒定到種的水平。因此傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)并不能作為菌種分離鑒定的主要方法,而16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和16SrRNA基因測(cè)序可適用于藏靈菇中乳酸球菌菌種之間的鑒定。藏靈菇可以作為天然發(fā)酵劑使牛奶變成酸奶,這種發(fā)酵劑含有多種乳酸菌和酵母菌,本文應(yīng)用傳統(tǒng)生理生化和多種分子生物學(xué)方法相結(jié)合的惰性分類手段對(duì)藏靈菇中的乳酸球菌進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定和全面、可靠的研究,為研究和開(kāi)發(fā)天然菌種發(fā)酵劑的乳酸菌資源奠定了良好的基礎(chǔ)。