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      病毒抗體論文:煙葉病毒抗體之制備

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      病毒抗體論文:煙葉病毒抗體之制備

      本文作者:呂琦1吳峰1,2林潔1譚仲夏3秦西云3夏振遠3莫笑晗3馬嵐2作者單位:1云南大學2清華大學3云南省煙草農業科學研究院

      抗原的制備

      經工程菌BL21誘導表達并純化所得的rTMV-CP-F蛋白經過SDS-PAGE電泳分析,rTMV-CP-F蛋白相對分子質量為31ku(圖3),符合目的蛋白的大小,最終所得的rTMV-CP-F蛋白純度為95%,滿足免疫實驗要求.

      免疫小鼠抗血清分析

      4只Balb/c免疫小鼠的血清抗體滴度都在10-5~10-6間,表明免疫效果比較好.

      單抗細胞株的制備

      4只免疫小鼠分2次進行細胞融合,融合細胞經篩選培養、有限稀釋法單克隆化篩選培養后,共獲得14株能穩定分泌抗體的細胞株.用質量濃度5mg/L的rTMV-CP和5mg/L的TMV病毒顆粒分別包被酶標檢測板,并用脫毒煙葉提取液包被作為陰性對照,間接ELISA法檢測14株細胞的培養上清液,結果表明這14株細胞所分泌抗體與rTMV-CP和TMV病毒顆粒均有特異性反應,與脫毒煙葉提取液無特異性反應(圖4).

      抗體的亞類及輕鏈型

      獲得的14株細胞所分泌的抗體都經間接法ELISA分析后,抗體亞類都為IgG1、輕鏈型都為κ型(表1).

      抗體制備和鑒定

      將14株細胞進行腹水制備和抗體純化,腹水的抗體滴度都在1∶106~1∶107范圍內,腹水經ProteinA一步法純化后,抗體純度在80%以上,其相對分子質量在150~160ku.

      抗體的特異性分析

      選取感染TMV煙葉的提取物作為陽性對照,表觀正常的土壤培育植株及其土壤樣本、實驗室脫毒的植株及其培養物樣本作為陰性對照,同樣用間接ELISA的方法來檢測抗體的特異性,包被濃度為1∶500.用質量濃度5mg/L的ToMV包板,檢測其與抗TMV抗體的交叉反應.14株抗體與染毒煙葉都有特異反應.在陰性對照中,田間土壤栽培煙葉提取物、實驗室栽培的脫毒煙葉提取物與12株TMV單克隆抗體無特異反應,只有2對抗體(3D7a、3D7b)有微弱的反應.14株抗體與ToMV無交叉反應(圖5).

      討論

      TMV-CP在引起煙草花葉中起決定性的作用,感染TMV的煙草葉綠體中存在大量的TMV-CP[16],因此將TMV-CP作為免疫原制備抗TMV抗體對于提高其準確性和特異性都具有重要意義.rTMV-CP和天然TMV病毒顆粒存在類似的表位[17],但是由于rTMV-CP的原核表達導致其構象多樣,在單獨免疫小鼠時會造成表位的混亂,導致抗體不能識別天然TMV病毒顆粒,因此本研究采用將2種抗原混合后共同免疫,再用2種抗原同時篩選所得抗體,這樣所得到的抗體即能同時識別TMV-CP和天然TMV病毒顆粒.通過將TMV-CP和天然TMV病毒顆粒混合免疫,最終得到14株可以穩定分泌抗TMV抗體的雜交瘤細胞.所制備腹水經ProteinA一步法親和層析純化所得抗體,抗體效價在1∶106~1∶107范圍,抗體純度在80%以上.14株抗體均與TMV-CP重組蛋白和TMV病毒有良好特異反應.同時,針對將來抗體的應用范圍選取了測試抗體特異性的實驗.所制備的抗體的特異性高與ToMV無交叉反應,為下一步研制免疫檢測試劑盒提供了重要材料.

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