苜蓿酯酶提取分離與性質測定

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本文作者：王亞飛1張金艷2作者單位：1.黑龍江八一農墾大學文理學院2.黑龍江八一農墾大學教務處

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽[1]，它是世界上栽培最早、分布面積最廣的一種優質豆科牧草。苜蓿中富含蛋白質、維生素、無機鹽及促生長因子，其鮮草中粗蛋白質含量為4.5%~5.9%，干草中蛋白質含量約為15%~25%，比玉米高1~1.5倍[2]。近年，由于食用農藥殘留超標的蔬菜而引起食物中毒的事件時有發生，為了阻止有毒蔬菜進入市場，在蔬菜上市前進行農藥殘留快速檢測是比較可行的辦法。目前，快速檢測農藥殘留用植物酯酶都是以糧食作物如小麥[3]、大豆[4]、蕎麥、豌豆、玉米[5]等為酶源，檢測成本雖然比動物酶源低，但畢竟需要消耗糧食。本文試驗從價格更加低廉的苜蓿中提取植物酯酶，進行分離、純化，并系統地對該酯酶的動力學特性及農藥檢測效果進行研究，為尋求植物酯酶新酶源提供依據。

1儀器與試劑

1.1儀器

UV-2802PCS型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；高速冷凍離心機：法國JOUAN；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-(S)6數顯恒溫水浴鍋：金壇市友聯儀器研究所。

1.2試劑

硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉等：國產分析純；2,6-二氯靛酚：德國。

2實驗材料與方法

2.1實驗材料

粗酶的提取：稱取100g苜蓿嫩葉，用研缽研成勻漿，按料液比(w/v)1:10加入pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，移入錐形瓶中震蕩10min，4層紗布過濾，濾液用4000~6000r/min的速度低溫離心15min，取上清液，將粗酶液保存在4℃冰箱中備用。分級純化：在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.3飽和度)，在1h內加完后置于4℃冰箱中過夜。次日將上清液用虹吸管吸出，下面渾濁液用4000r/min的速度低溫離心15min，棄沉淀合并上清液。在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.6飽和度)，在1h內加完后置于4℃冰箱中過夜。次日，將上清液用虹吸管吸出，沉淀用5000r/min的速度低溫離心15min，棄上清液，保留沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，裝于透析袋(分子量大于10000u)中，4℃下置于pH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中透析24h，中間換4次緩沖溶液，直至無SO42-析出為止(用氯化鋇檢驗)。將沉淀溶于1LpH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中。

2.2試驗方法

不同農藥最低檢測限(LDC)的確定：根據所用UV-2802PCS型紫外可見分光光度計的誤差范圍，以可以檢測到的最小吸光度對應的農藥濃度為初定檢測限，在此濃度下與空白液進行t檢驗(n=6)，用SPSS數據處理系統處理數據，從而確定LDC。結果見表1。

3結果與分析

3.1最大吸收波長的測定及反應進程曲線

取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，在40℃水浴中繼續恒溫20min，在550~640nm范圍內改變波長，測定不同波長下酶促反應產物的A值。從圖1可見，最大吸收峰在605nm，因此在比色分析中，測定波長選擇605nm。取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，40℃水浴中繼續恒溫。在605nm波長下，分別測定顯色10、20、30、40、50、60、70、80min時產物的A值。結果見圖2。圖2結果顯示，在0~20min內反應速率增大得很快，20min后，反應速率增加緩慢。本實驗選擇1~4min吸光度值的變化進行酶促反應計算。

3.2鹽的種類和濃度對酯酶活力的影響

改變提取劑的種類、濃度及pH值提取苜蓿酯酶，分別測定總酯酶活力和比活力，結果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4中可見，用pH值7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酶液活性和比活力均最高。

3.3溫度對酯酶活力的影響

當其他試驗條件不變時，分別測定顯色溫度為4、10、20、30、40、50、60、70、80℃時產物吸光度值。溫度對酯酶活力的影響如圖5所示。從圖5中可見，40℃時，酯酶活性最高。

3.4pH值對酯酶活力的影響

在40℃時，分別測定pH值為4.0~9.0的緩沖體系中的酯酶活力，結果如圖6所示。由圖6可見，苜蓿酯酶在pH值6.5~7.5范圍內活力較大，在pH7.0的緩沖體系中活力最大。

3.5料液比對酯酶活力的影響

4℃下用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，以不同料液比(1:1~1:40)提取苜蓿酯酶，并測定總酯酶活力和比活力，結果如圖7所示。從圖7中可以看出，當料液比在1:1~1:10范圍時，隨著料液比的增加，苜蓿總酯酶活力也隨之增大，這是因為料液比增大，酯酶溶出充分。而當料液比達到1:10后再增大時，總酯酶活力不再增加，可能是稀釋倍數過大造成的。

3.6提取時間對酯酶活力的影響

提取率隨著提取時間的延長而增高，但酶活性會隨著時間的延長而降低。為了確定合適的提取時間，固定其他提取條件和顯色條件，改變提取時間，以確定本試驗最佳提取時間，結果如圖8所示。從圖8中可以看出，提取前10min，酯酶活力隨提取時間的增加而增大，10min后隨著提取時間的延長而逐漸降低，在提取10min到30min時，酶活相差不大，過了30min后酯酶活性降低速度加快。這是因為延長提取時間，有利于酯酶的溶出，而時間過長，酶活力損失過大。

3.7幾種常見的有機磷農藥的最低檢測限(LDC)

從表1中的結果可看出，苜蓿酯酶對上述5種有機磷農藥的LDC除甲拌磷外均遠小于我國和歐盟對上述農藥最高允許殘留量(MRL)的要求，雖然甲拌磷的檢測限高于要求，但遠低于目前快速檢測用小麥酯酶對甲拌磷的檢測限0.166μg/mL[6]。

4結論

本實驗從來源廣、價格相對低廉的苜蓿中提取植物酯酶，實驗表明用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酯酶活性最高，40℃時酯酶反應活性最大。苜蓿酯酶對久效磷、氧樂果、甲基對硫磷、甲胺磷、甲拌磷的最低檢測限分別為0.024、0.050、0.009、0.003、0.002μg/mL。除甲拌磷外，對其余4種有機磷農藥放入檢測限均低于于我國和歐盟對上述農藥最高允許殘留量的要求。由于本實驗只是以5種有機磷農藥為例，所以該結論還需進一步選取更多種類的有機磷農藥加以驗證。