磷蝦水解工藝探究
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本文作者：戴程程汪秋寬任丹丹何云海作者單位：大連海洋大學遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室
南極磷蝦是一種生活在南極洲水域的磷蝦。它作為當今世界資源量最大的單物種生物之一，為南極多數生物提供食物，是南極食物鏈體系中最重要的生產者[1]。南極磷蝦營養極其豐富，被譽為地球上最大的“海洋蛋白庫”，具有很高的開發利用價值[2]。研究發現南極磷蝦蛋白質含量適中，脂肪含量豐富，氨基酸種類齊全，必需氨基酸比例適宜，微量元素含量極高，并且綠色、安全，是人類理想的高級營養食物[3-5]。因磷蝦體內富含可迅速自溶的蛋白酶，故本研究利用快速自溶技術，探索影響磷蝦快速自溶因素，為研制富含游離氨基酸、蛋白肽的獨特風味磷蝦調味料奠定基礎。
1材料與方法
1.1原料
南極磷蝦由大連遼漁集團提供，采自南極海域。
1.2主要儀器與設備
組織搗碎機，磁力攪拌器，水浴鍋，高速離心分離機，pH計，微量凱氏定氮裝置。
1.3檢測方法
1.3.1基本成分測定
水分：常壓干燥法[6]；灰分：550℃干法灰化法[6]；粗蛋白：微量凱氏定氮法[6]；粗脂肪：索氏提取法[6]。
1.3.2水解液氨基酸態氮的質量濃度及水解度測定
氨基酸態氮的質量濃度：甲醛滴定法；水解液水解度：非蛋白氮，20%三氯乙酸處理自溶液，取上清液，用微量凱氏定氮法測定其含氮的質量分數，計算自溶液水解度，如下公式：（略）。以氨基酸態氮的質量濃度及自溶液的水解度為水解程度大小的指標。
2結果與討論
2.1磷蝦的基本營養成分
由表1可見，其粗蛋白質量分數比新對蝦(13.2%)高[7]；其非蛋白氮的質量分數為579mg/100g，而非蛋白氮成分中，一般多含有游離氨基酸、低肽、核苷酸關聯化合物質[8]，這對制作高級磷蝦營養海鮮調味料提供了優越的條件。
2.2磷蝦自溶水解的單因素確定
2.2.1自溶時間對磷蝦自溶酶解的影響
在50℃恒溫條件下將磷蝦肉自溶酶解一定時間后，加熱至沸滅活，測其氨基酸態氮的質量濃度，自溶時間分別為20、40、60、80、100、150、200、250、300min，自溶時間對磷蝦自溶酶解的影響見圖1。由圖1所示，氨基酸態氮的質量濃度在150min以內一直為上升趨勢，當自溶時間超過165min時，自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度出現逐漸下降趨勢。因此，165min確定為自溶酶解的最佳時間，其自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度為4.74g/L。165min以后，氨基酸態氮的質量濃度又緩慢降低，幾乎接近穩定。以上結論如圖1所示。自溶時間對自溶酶解水解度的影響見圖2。由圖2可見自溶時間對自溶酶解液水解度的影響很小，水解度一直在20%~30%之間浮動，在自溶時間為165min時自溶液水解程度達到最高，為29.6%。在165min后，水解液水解度出現下降，然后隨時間變化很小。因此，確定165min為最佳溶酶解時間。由圖1和圖2可見，自溶酶解時間為165min時，自溶酶解液中的氨基酸態氮的質量濃度最高，并且溶液的水解程度也最大，由此可見，165min為自溶酶解的最佳時間。孔美蘭等[9]曾對羅非魚下腳料自溶酶解條件進行研究，結果同樣發現自溶酶解時間對自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度影響較大。研究結果表明自溶酶解時間對水解度的影響較小，比較楊錫洪等[10]等對蝦頭自溶脫蛋白質法制備殼聚糖的研究結果，后者發現蝦頭中含有大量的蛋白水解酶，其中包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶A、羧肽酶B[11]等，種類豐富且比蝦肉中的酶含量要高。
2.2.2自溶酶解溫度對磷蝦自溶的影響
將自溶酶解時間確定為165min，研究了溫度對磷蝦自溶酶解效果的影響，結果見圖3和圖4。由圖3可見，不同自溶溫度的自溶酶解液中游離氨基酸態氮的質量濃度不同，在55℃時，自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度達到最大，約為4.26g/L。溫度大于55℃后，氨基酸態氮的質量濃度隨溫度增加而降低，可見55℃為磷蝦自溶酶的最適溫度。由圖4可見，在溫度為55℃時，自溶酶解液水解度最大，達到32.91%。由此可以確定最適自溶酶解溫度為55℃。不同自溶酶解溫度對自溶酶解液游離氨基酸態氮的質量濃度影響明顯，在低溫階段，隨著溫度的增加，氨基酸態氮的質量濃度逐漸增加，在溫度為55℃時上升為4.26g/L，隨后就呈下降趨勢，可見55℃為磷蝦自溶酶的最適溫度。說明在低溫階段，隨著溫度的升高自溶酶的反應速度加快，因加熱能使蛋白質變性，原本卷曲的蛋白質肽鏈因變性而伸展，其結構內部的肽鍵充分暴露，從而活性位點增多，這就更易于蛋白酶的作用。但溫度過高時，部分自溶酶的結構開始松散無序，活性中心也隨之逐漸喪失，酶活性降低，導致自溶水解效果減弱。這與司偉蘭[12]等對魷魚內臟的自溶分析結果和王靜[13]等人對海參多肽自溶工藝的研究趨勢一致，在低溫階段，隨著溫度的增加，游離氨基酸態氮的質量濃度逐漸增加，并在55℃附近含量最高，之后隨著溫度的增加，氨基酸態氮的質量濃度下降。
2.2.3pH對磷蝦自溶酶解的影響
將自溶溫度定為55℃、自溶時間定為165min，設定自溶酶解液的pH值，研究pH值對磷蝦自溶酶解的影響。其影響結果見圖5和圖6。由圖5中可知，pH對磷蝦自溶酶解的影響較大。當pH為7.0時，自溶液中的氨基酸態氮的質量濃度最高。說明中性條件利于磷蝦自溶酶解，其氨基酸態氮的質量濃度為4.55g/L。由圖6可見，pH對自溶液水解度的影響較大，當pH=7.0時，自溶酶解液水解度高達23.84%，說明pH為7.0時自溶酶解效果最佳。pH對磷蝦自溶酶解的影響關系密切。說明在特定pH條件下磷蝦肌肉中自溶酶被激活并與相應的機體組織生物大分子底物作用，使機體組織被溶解，生成各種較低分子質量的產物——肽和氨基酸[9]。而水解體系中pH值對自溶酶和底物的結構、解離狀態及結合狀態都會產生影響。這種結果與鄭麗等[14]研究的pH值對扇貝加工廢棄物自溶影響的結果類似。
2.2.4紫外線照射時間對磷蝦自溶酶解的影響
用紫外線(光源功率30W，距樣液高度設計為0.40m)分別照射磷蝦自溶酶解液10、20、30、40、50min后，分別測定自溶酶解液中的游離氨基酸態氮的質量濃度，結果見圖7和圖8。圖7表明，紫外線的照射時間對磷蝦自溶酶解液中的氨基酸態氮的質量濃度的影響較小，隨著紫外線照射時間的延長，自溶液中的氨基酸態氮的質量濃度逐漸增大。由圖8可見，紫外線的照射時間對自溶酶解液的水解程度影響較大，它使整體自溶水解速度成大幅上升趨勢，在照射50min內，隨著照射時間的延長，自溶酶解液的水解度逐漸增加。本實驗選擇紫外線的照射時間為50min以內。紫外線的照射時間對磷蝦自溶水解液中的氨基酸態氮的質量濃度的影響不大，隨著紫外線照射時間的延長，自溶酶解水解中氨基酸態氮的質量濃度緩慢上升。考慮到紫外線照射時間過長，可能超過激活酶所需的計量，會導致酶結構的改變，使磷蝦的蛋白質變性，并產生一些不良氣味。因此，紫外線照射時間確定為50min。這一結果與亨氏仿對蝦的情況類似[15]，紫外線照射時間限制為50min為最佳紫外線照射時間。但章超華等對斑節對蝦快速自溶的影響結果卻不同[15]，后者發現斑節對蝦在紫外線照射超過30min時，自溶受到了抑制。這表明，紫外線對不同海洋生物的自溶效果影響是不同的。
2.2.5無機離子濃度對磷蝦自溶效果的影響
Na+和Ca2+對自溶酶解效果的影響由圖9和圖10所示。由圖9和圖10可見，Na+和Ca2+對快速自溶水解的影響相類似，Ca2+作用后的自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度高于Na+作用后自溶酶解中氨基酸態氮的質量濃度，并在Ca2+達到0.28mol/L時，水解液中的氨基酸態氮的質量濃度最大，為3.38g/L。圖10是Na+和Ca2+對溶液水解度的影響，2種離子對自溶酶解液影響趨勢類似，表明了Ca2+對自溶液水解度的影響較Na+的影響顯著。在Ca2+為0.28mol/L時，水解液的水解度最大，為13.87%。綜上所述結果表明，自溶時間與磷蝦自溶水解反應密切相關，在自溶165min時，自溶酶解液達到最佳；磷蝦的自溶酶解受溫度影響較小，55℃為南極磷蝦快速自溶酶最佳作用溫度；pH對磷蝦自溶酶解影響顯著，pH為7.0時，可顯著加速磷蝦的自溶水解；在紫外線照射時間為50min時，對自溶反應起到促進作用；Ca2+對南極磷蝦自溶酶具有激活作用，加速自溶酶解，當其濃度為0.28mol/L時達到較佳的自溶酶解效果。Ca2+對自溶酶的激活促進作用較Na+強，可能是因為Ca2+可以控制細胞的滲透性，調節細胞的酸堿平衡，同時對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種水解酶的活性起著十分重要的穩定、活化作用。當Ca2+達到0.28mol/L時，水解液中的氨基酸態氮的質量濃度可達到最大值3.38g/L。這些鈣會以溶解態的形式存于液體中，對人體吸收有利。因此，磷蝦自溶液中的鈣可以被人體吸收。
2.3磷蝦自溶條件的正交優化
在單因素實驗的基礎上，以時間、溫度、pH、紫外線照射時間、無機離子濃度5因素為影響因子設計了正交試驗L16(54)，綜合優化磷蝦的自溶酶解工藝，自溶優化條件。其結果如表2、表3與表4所示。由表2可見，正交實驗的最佳自溶酶解工藝A4B2C3D1E4，即反應時間180min，溫度50℃，pH為7.0，紫外線照射時間20min，Ca2+濃度為0.28mol/L，此時自溶酶解液中的氨基酸態氮含量為0.788g/L，水解度為35.07%。由表3可見，以水解度為指標的極差分析結果表明，自溶酶解時間是影響水解度得率第一影響因素，pH值是次要因素，反應溫度和無機離子濃度對水解影響較小，紫外線的照射時間對自溶酶解液的影響最小。以水解度為指標的極差分析結果的最佳正交組合為A4B2C3D1E4。即最佳工藝條件為反應時間180min，溫度50℃，pH為7.0，紫外線照射時間20min，Ca2+濃度為0.28mol/L。由表4可見，以氨基酸態氮的質量濃度為指標的極差分析結果表明，自溶酶解時間也是影響氨基酸態氮的質量濃度的第一影響因素，pH值同樣為次要因素，Ca2+濃度為第三影響因素，反應溫度與紫外線的照射時間對自溶酶解液的影響最小。最佳正交組合同樣為A4B2C3D1E4，與以水解度為指標的極差分析結果一致。為此研究對最佳組合進行了自溶酶解實驗，研究結果表明在該最佳實驗組合條件下自溶酶解液中氨基酸態氮的質量濃度為0.875g/L，水解度為36.18%。
本文對南極磷蝦自溶酶解工藝研究結果表明，在單因素試驗中，自溶酶解時間為165min時，溶液中氨基酸態氮的質量濃度達到最高，即4.74g/L，此時自溶酶解液中的水解度為29.60%；當最適溫度為55℃時，氨基酸態氮的質量濃度最高，為4.26g/L，水解度為32.91%；當pH為7.0時，自溶酶解液中的氨基酸態氮的質量濃度達到最高值4.55g/L，水解度為23.83%；Na+和Ca2+對快速自溶水解的影響相類似，但Ca2+對自溶酶解液的激活促進作用較Na+作用大。單因素試驗后，正交實驗L16(54)確定了南極磷蝦的最佳自溶酶解條件。正交實驗結果表明，當自溶時間為180min，溫度為50℃，pH為7.0，紫外線照射時間為20min，Ca2+離子濃度為0.28mol/L時，水解液中氨基酸態氮的質量濃度最大，為0.875g/L，其自溶酶解液的水解度為36.18%。
