VITEK2Compact微生物環(huán)境監(jiān)測論文

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1材料與方法

1．1材料

1．1．1質(zhì)控菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽胞桿菌［CMCC(B)63501］、大腸埃希菌［CMCC(B)44104］，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1．1．2培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)皿、麥康凱(MaC)瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)皿、沙氏(SDA)培養(yǎng)皿，均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司培養(yǎng)基室提供。

1．1．3主要試劑和儀器

革蘭染色液購自美國BD公司;威泰科GP(革蘭陽性)鑒定卡、GN(革蘭陰性)鑒定卡、BCL(芽胞桿菌)鑒定卡、YST(酵母)鑒定卡、0．45%氯化鈉注射液，均購自法國生物梅里埃公司;vitek2compact微生物檢測系統(tǒng)，購自法國生物梅里埃公司;迅數(shù)菌落分析—顯微成像一體機(jī)，購自杭州迅數(shù)科技公司;HPY-300微生物限度過濾系統(tǒng)，購自杭州泰林醫(yī)療器械有限公司;麥?zhǔn)蠞岫缺葷醿x，購自法國生物梅里埃公司。

1．2方法

1．2．1質(zhì)控菌株傳代

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的凍干菌粉安瓿掰開，用無菌吸管吸取0．5～0．8mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴加到安瓿中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓿并吹打，使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。然后將其新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18～24h傳代(不超過5代);將傳代適應(yīng)的(不超過5代)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌及大腸埃希菌的新鮮菌落(放置時(shí)間不超過24h)，用VITEK2compact進(jìn)行鑒定分析。

1．2．2純菌鑒定

將用于生產(chǎn)和科研的鼠疫耶爾森菌、布魯菌、肺炎鏈球菌、沙門菌等的傳代菌株培養(yǎng)物新鮮樣本291個(gè)進(jìn)行菌型鑒定，根據(jù)可信度結(jié)果作為考察其穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。

1．2．3樣品的采集與制備

主要采集2010—2013年的人員及設(shè)備表面微生物、沉降菌、浮游菌及微生物限度樣品共313個(gè)。①人員:壓指試驗(yàn)、表面接觸(頭、胸、手腕、肘、膝蓋)平皿;②設(shè)備:表面擦拭;③環(huán)境:沉降菌(A級、B級、C級、D級)、浮游菌(A級、B級)。將所有陽性平皿送菌型鑒定;④微生物限度:將生產(chǎn)科室的注射用水和純化水系統(tǒng)水點(diǎn)每周取樣一次，按照中國藥典規(guī)定的微生物限度檢測標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則進(jìn)行。

1．2．4環(huán)境微生物菌型檢測

將所培養(yǎng)的單顆菌落或純分的菌落進(jìn)行菌落特征觀察，經(jīng)革蘭染色，鑒別其是革蘭陽性桿菌或是球菌、革蘭陰性桿菌或球菌，選用適宜的鑒定卡。然后按照VITEK2Com-pact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀說明書中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行測定，一般2～10h給出鑒定結(jié)果。

1．2．5菌型結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

VITEK2Compact微生物檢測系統(tǒng)的生化鑒定是根據(jù)不同微生物的理化性質(zhì)，采用光電比色法，測定微生物分解底物導(dǎo)致pH改變而產(chǎn)生的不同顏色，來判斷反應(yīng)的結(jié)果，一旦鑒定卡內(nèi)的終點(diǎn)指示孔到達(dá)臨界值，則表明此卡已完成鑒定。系統(tǒng)最后一次讀數(shù)后，將所得的生物數(shù)碼與菌種數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌的生物模型相比較，得到相似系統(tǒng)鑒定值(%)，按此值的大小對檢測可信度作出評價(jià)。可信度96%～99%為極好，95%～92%為較好，91%～89%為好，88%～85%為可以接受，85%以下的可信度為低分辨率的鑒別。對于只鑒定到屬的菌株，還需根據(jù)報(bào)告提示信息進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，進(jìn)一步鑒別到種。

2結(jié)果

2．1質(zhì)控菌株檢測分析

用VITEK2Compact微生物檢測系統(tǒng)對已知的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌共4株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果與已知完全相符，可信度在97%以上。

2．2純菌鑒定2010—2013年純菌鑒定樣本291個(gè)，

2．3環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的建立

通過對所收集的環(huán)境及制品染菌共313個(gè)樣品(其中人員及設(shè)備表面微生物25個(gè);沉降菌228個(gè);微生物限度66個(gè))的檢測結(jié)果進(jìn)行整理和分析。共檢出微生物268株，其中人員及設(shè)備表面微生物18株;沉降菌188株;微生物限度62株。

2．4不同樣品菌型鑒定結(jié)果

對環(huán)境檢測樣品(人員及設(shè)備表面微生物和沉降菌)及微生物限度樣品檢出微生物的趨勢。結(jié)果分析:①人員及設(shè)備表面微生物主要以沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌和玫瑰庫克菌等革蘭陽性菌為主，占72．2%以上，其次是魯氏不動(dòng)桿菌和少量巨大芽胞桿菌等;②沉降菌樣本以革蘭陽性球菌居多，主要為葡萄球菌屬，藤黃/里拉微球菌，玫瑰庫克菌等，占檢出菌的69．7%，而以少動(dòng)鞘氨醇單胞菌為主的革蘭陰性桿菌次之，占23．9%。短小芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等，革蘭陽性芽胞桿菌出現(xiàn)頻率較高為4．8%;③微生物限度檢測樣本以少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、代爾夫特食酸菌及魯氏不動(dòng)桿菌為主的革蘭陰性桿菌，占檢出菌的40．3%。其次為解甘露醇羅爾斯頓菌、皮氏羅爾斯頓菌均為革蘭陰性短桿菌，占14．5%，霉菌檢出率為9．7%。

3討論

從菌型分析結(jié)果可知，生物制劑生產(chǎn)企業(yè)潔凈區(qū)人員及設(shè)備表面微生物及沉降菌樣品檢出率最高的是革蘭陽性菌，而居其首位的藤黃/里拉微球菌和葡萄菌屬，此類菌種為潔凈區(qū)環(huán)境及人員監(jiān)測的主要菌群，環(huán)境中無處不在，主要存在于人體皮膚表面及呼吸道和口腔的分泌物，均為人員帶入，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，樹立無菌觀念，從根本上降低污染的發(fā)生。沉降菌樣品檢出的短小芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等，主要存在于土壤中，芽胞對熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，一般常用的消毒劑很難去除，應(yīng)選用特殊的強(qiáng)消毒劑。微生物限度所檢出的解甘露醇羅爾斯頓菌、皮氏羅爾斯頓菌為革蘭陰性短桿菌，有芽胞，好氧菌。因封閉的注射用水(80℃保溫循環(huán))和純化水(20℃保溫循環(huán))經(jīng)多重處理后微生物滋長的營養(yǎng)成分減少，在科室用水的定期微生物限度檢查所出現(xiàn)的超標(biāo)平皿，應(yīng)做菌型鑒定并與環(huán)境檢測結(jié)果作對比，尋找微生物的來源。另外，對于霉菌，從檢出時(shí)間和企業(yè)所處地域分析，主要出現(xiàn)在濕度較大的南方地區(qū)，而對于空氣相對干燥的西北地區(qū)霉菌的檢出率更低，但也不容忽視。應(yīng)對注射用水管道進(jìn)行滅菌、純化水管道消毒，并在春夏季節(jié)加強(qiáng)對各出水口的消毒處理。實(shí)驗(yàn)中是對生物制劑生產(chǎn)過程中微生物污染狀況的初步探索，以法國生物梅里埃全自動(dòng)微生物分析儀應(yīng)用于生物制劑生產(chǎn)企業(yè)中日常環(huán)境微生物監(jiān)控是十分必要的。該系統(tǒng)具有鑒定快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、操作簡便、功能廣泛等優(yōu)點(diǎn)，尤其是GP卡和GN卡研究較為成熟，鑒定準(zhǔn)確性最高，可進(jìn)行快速鑒定。VITEK2Compact微生物檢測系統(tǒng)鑒別含多種細(xì)菌的樣本中的不同細(xì)菌時(shí)，需進(jìn)行純菌分離直至單顆菌落。革蘭陰性菌，與革蘭陽性菌在難于區(qū)分的情況下，可選擇MaC瓊脂作為純化培養(yǎng)基;對于較難培養(yǎng)的菌株，也采用血平板進(jìn)行純培養(yǎng)。采集的環(huán)境微生物由于物理、化學(xué)的消殺或暴露了較長時(shí)間，菌株可能存在一定的損傷和變異，因此有必要對送檢菌株進(jìn)行復(fù)壯和再次純化。通過菌型分析結(jié)果，能夠發(fā)現(xiàn)生物制劑生產(chǎn)企業(yè)環(huán)境中微生物污染的一般規(guī)律，在現(xiàn)有環(huán)境檢測微生物數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上建立基因分型的數(shù)據(jù)庫，可更好地應(yīng)用于生產(chǎn)過程中的監(jiān)控。

作者：房世娣趙小潔劉曉凡宣俊文錢秋娟馬軍蘭魏然單位：蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心