腸道環境論文:果膠對腸道環境的影響

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作者：呂嬌蘇昕峰方國珊劉雄單位：西南大學食品科學學院

大量的研究表明，果膠作為腸道益生因子，有利于腸道中乳酸菌、雙歧桿菌的生長，產生豐富的SCFAs（short-chainfattyacids）改善腸道pH，促進腸細胞生長，抑制結腸癌等[5-8]。前人研究結果暗示果膠可能具有改善辣椒素引起的腸道環境的不適癥狀。薛荔做為一種野生常綠攀援植物常見于我國各省，適應力強，易于種植。并且瘦果籽中含有豐富的果膠，研究表明薛荔籽果膠酯化度為38.57%，屬于酸性低酯果膠[9]。因此，本實驗選擇薛荔籽果膠作為添加物，考察果膠添加是否會改善辣椒素引起的腸道不適。由于體外發酵作為動物實驗的補充有很多優點：它可以跟蹤發酵過程中物質的變化及研究發酵產物的形成過程，彌補了體內發酵不能實現動力學檢測的缺點；它還可以實現標準化操作，實驗的重復性強。因此，本文擬采用體外發酵試驗觀察果膠與辣椒素對腸道發酵環境的影響，以期為辣椒的科學消費提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料與試劑薛荔果膠由實驗室研究自制。天然辣椒素(辣椒堿含量為95.7%)由河南倍特生物科技有限公司提供。氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、硫酸（優級純）、亞硝基鐵氰化鈉（分析純）、苯酚（分析純）、次氯酸鈉（分析純）、冰乙酸（分析純）、吐溫80（分析純）、氯化銨（分析純）、咔唑（分析純）成都市科龍化工試劑廠；乙酸(色譜級)AJohnsonMattheyCompany；巴豆酸（色譜級）、丙酸(色譜級)、丁酸(色譜級)、異丁酸(色譜級)梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；EMB培養基（生化試劑）北京奧博星生物技術有限公司；BS培養基（生化試劑）、LBS培養基（生化試劑）青島海博生物技術有限公司；D-半乳糖醛酸（分析純）北京索萊寶科技有限公司；高純二氧化碳氣體（99.999%）重慶朝陽氣體有限公司。

1.2儀器與設備Sepctrumlab22可見分光光度計上海棱光技術有限公司；WH-1微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠；JA2003A電子天平上海精天電子儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計上海大普儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；5810型臺式離心機德國Eppendorf公司；SIGMA低溫離心機德國SIGMA公司；ARI14紫外分光光度計上海愛朗儀器有限公司；GC-2010氣相色譜日本島津公司；KQ-100超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；HH-B11電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠；BC-J160S二氧化碳細胞培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋KAGOSHIMASEISAKUSYOINC；ZHWY-100C恒溫培養振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；Stabilwax-DA毛細色譜柱美國RESTEK公司。1.3試驗方法

1.3.1果膠提取與測定

1.3.1.1果膠提取[10]稱量薛荔籽，在水浴鍋中提取（料液比：1:10（m:V）、60℃攪拌2h）。方法一：真空濃縮濾液——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽膠。方法二：AB-8型大孔樹脂脫色過濾——真空旋轉濃縮至1/3——用95%乙醇沉析，靜置一夜——用65%乙醇洗滌兩次——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽果膠。

1.3.1.2果膠純度測定[11]標準曲線繪制：精確稱取D-半乳糖醛酸標準品10mg，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，制成100μg/mL的標準溶液。移取上述標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL具塞刻度試管中，再加入蒸餾水稀釋至1mL，即得一組濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的半乳糖醛酸標準液。然后小心沿管壁分別加入6.0mL濃硫酸，在沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，再分別加入0.2mL，1.5g/L咔唑-乙醇溶液，搖均。在暗處放置30min，取出測定反應液在波長526nm處的吸光度，用蒸餾水做空白實驗，制作標準曲線：y=0.0116x–0.002，R2=0.9981。稱取10mg實驗室自制薛荔籽果膠，溶解后定容至100mL容量瓶中，吸取1mL果膠溶液至25mL比色管做上述處理，根據標準曲線計算D-半乳糖含量。

1.3.2發酵液制備

1.3.2.1發酵液配比通過查閱大量相關文獻及本研究室前期的實驗表明，對采用不同劑量灌喂一月后的大鼠進行詳細的檢測后，發現添加5%果膠就能明顯增加大鼠盲腸內容物中SCFA總量，而添加0.1%辣椒素組的大鼠其血脂變化及對腸道的傷害作用最為明顯。發酵液各物質添加量見表1。其中果膠根據接種盲腸內容物重量的5%添加，辣椒素根據發酵液總體積添加（m:V），添加量為0.1%。

1.3.2.2體外發酵步驟1)無菌條件下取出6只雄性大鼠的盲腸內容物，裝入預先滅菌的50mL帶蓋離心管中，稱重，鼓入高純CO2氣體5min，蓋上蓋子待用。2)用9倍(V:m)無菌生理鹽水稀釋盲腸內容物，渦旋震蕩5min混勻，4層紗布過濾。3)取12支100mL高溫滅菌后的高溫瓶，每支高溫瓶中加入5mL盲腸內容物濾液和45mL滅菌基礎培養液（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g，pH7.0~7.2，定容至1000mL），將高溫瓶分為4組（每組3支），按實驗要求分別加入果膠或辣椒素（見表1），鼓入高純CO2氣體20min，蓋好橡膠塞后蠟封。在60~80r/min轉速的恒溫培養振蕩器上37℃搖床培養10h，終止發酵，檢測發酵液中pH、游離氨、SCFA及微生物。

1.3.3生化指標檢測

1.3.3.1pH測定發酵液樣品5mL于4000r/min下離心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度計測上清液pH。

1.3.3.2發酵液游離氨測定無氨水制備[12]：在1000mL蒸餾水中，加入0.10mL硫酸（ρ=1.84g/mL）。并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL餾出液，然后將餾出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。發酵液樣品于4000r/min下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液，60℃保溫5min，625nm波長下測吸光度[13]。配制5mmol/L氯化銨溶液，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL溶液于4mL比色皿中，無氨水稀釋至1.0mL，按上述步驟測吸光值，繪制標準曲線：y=0.108x+0.008，R2=0.9991。

1.3.3.3發酵液SCFA測定盲腸內容物發酵液樣品在4000r/min轉速下離心15min，吸取上清液轉移至超純水預處理過的10mL離心管中，10000r/min轉速下繼續離心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm濾膜過濾至2mL進樣小瓶中待測[14]。氣相色譜條件：進樣量1μL；進樣口溫度220℃；柱流量0.95mL/min，柱溫90℃、平衡時間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時間7min；檢測器溫度230℃；氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[15]。

1.3.3.4發酵液微生物測定取發酵液1mL，加入9mL無菌生理鹽水，依次10倍稀釋至10-7。選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋度，用于大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養計數，接種量為100μL。大腸桿菌培養選用EMB培養基，37℃下恒溫培養箱中培養48小時計數。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用BS培養基和LBS培養基，將培養皿蠟封后，在37℃下二氧化碳細胞培養箱中厭氧培養72小時計數。結果以logcfu/mL表示。

1.4統計分析實驗結果以mean±SD表示，各組間顯著性差異采用SPSS分析，P<0.05被認為有顯著差異。

2結果與分析

2.1薛荔籽果膠純度稱取10mg薛荔籽果膠溶于100mL蒸餾水中，取1mL果膠溶液，按照3.2.1.2方法測得吸光度為0.11，對應D-半乳糖醛酸含量為9.655μg/mL。果膠純度為96.55%。

2.2發酵液pH變化趨勢pH以盲腸內容物量計算，各發酵液pH變化見圖1。從圖1可以看出：在各發酵液的初始pH值為5.9的條件下，實驗結果顯示，相比空白組而言，添加5%果膠的發酵液（P組）pH顯著降低，而添加0.1%辣椒素的發酵液（C組）pH則顯著升高（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發酵液（P+C組）pH相比0.1%辣椒素組（P組）顯著降低。發酵液中pH值的變化主要是由發酵產生的有機酸和游離氨所影響，pH的降低或升高表明有機酸含量或游離氨濃度可能發生了顯著的變化。

2.3發酵液游離氨變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內容物發酵液中游離氨濃度的影響結果見圖2。從圖2可以看出：相對于空白組，添加5%果膠（P組）能顯著降低的發酵液中游離氨濃度，而添加0.1%辣椒素（C組）則明顯增加了的發酵液游離氨濃度（P<0.05）。相對于辣椒素組（P組），添加5%果膠+0.1%辣椒素（P+C組）則明顯降低了辣椒素引起的游離氨濃度的升高（P<0.05）。這與發酵液中pH值的升高和降低相對應。

2.4發酵液短鏈脂肪酸變化趨勢果膠對辣椒素引起的盲腸有機酸發酵產物減少的改善效果見圖3、圖4、圖5及圖6。從圖中可以看出：與對照組相比，添加5%果膠（P組）的盲腸內容物發酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度均顯著升高（P<0.05），而添加0.1%辣椒素組（P組）則顯著降低了盲腸內容物發酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發酵液（P+C組）的短鏈脂肪酸含量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高（P<0.05）。此結果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌對碳水化合物的發酵，減少有機酸的產生，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道益生菌發酵所產生的不利影響。2.5發酵液微生物數量變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內容物發酵液中微生物組成的影響見圖7、圖8及圖9。從圖中可以看出：相對于對照組，添加5%果膠組（C組）能顯著增加發酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量，減少大腸桿菌的數量，而辣椒素組(P組)則減少了發酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量，增加大腸桿菌的數量（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素發酵液（P+C組）的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高，而大腸桿菌數量則顯著降低（P<0.05）。此結果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌的生長，同時使得有害菌的數量增加，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道微生物菌群所產生的有害作用。

3結論與討論

隨著人們健康意識的增強，以及營養科學和醫藥科學的發展，有關食用辣椒對人體健康的利與弊的話題，成為人們關注的一個焦點。國內外研究表明：辣椒素藥理作用廣泛，在鎮痛方面有重要作用，同時具有防治心血管疾病、呼吸道疾病的作用，還能用于減肥[16]、治療風濕性關節炎、銀屑病等[17]。然而，許多食用辣椒的消費者會出現腸道不適，尤其是初次食用或過量食用的消費者，會出現腹痛、拉肚、肛部灼燒感等癥狀。多數研究表明灌喂辣椒素對人體腸道有不良影響，且與食用劑量有正相關關系，辣椒素主要通過對腸道的化學刺激起作用[18-19]。也有研究發現辣椒素可以刺激腸絨毛增生，促進小腸對營養物質的吸收，從而對腸道健康也起到積極的改善作用[20-21]。然而，腸道菌群對腸道健康至關重要。本研究結果表明，辣椒素可以使盲腸內容物發酵液中有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌）數量減少，有害菌（大腸桿菌）數量增加，導致腸道短鏈脂肪酸濃度降低，游離氨濃度升高，pH值升高。這可能是辣椒素會引起消費者出現腸道不適癥狀的原因。而相同劑量辣椒素的盲腸內容物發酵液中，添加果膠可以使發酵液pH值和游離氨濃度降低、短鏈脂肪酸濃度升高，說明果膠體外發酵對辣椒素引起的盲腸內容物發酵環境惡化有一定的改善作用。其原因可能是果膠體外發酵產生大量短鏈脂肪酸，使發酵液中pH值降低，有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌）數量增加、有害菌（大腸桿菌）數量減少，游離氨濃度升高。因此，添加果膠可以緩解由辣椒素引起的腸道環境惡化。