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1方法
1.1亞甲藍標準品的制備
精密稱取亞甲藍粉末38mg,置100mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,混勻,此為亞甲藍儲存液。精密量取亞甲藍儲存液50μL置50mL容量瓶中,用血漿稀釋至刻度,混勻,配成最終濃度為1.0μmol/L的亞甲藍對照血漿。
1.2血漿中亞甲藍的固相萃取
將3mL固相萃取小柱數支裝入萃取裝置,連接真空泵并檢查抽真空效果。柱的預處理:用6mL甲醇活化。加樣:在其中一個小柱中加入6mL亞甲藍對照血漿,其他小柱中加入6mL供試血漿。清洗:待血漿完全吸入小柱后,用30%的甲醇6mL清洗。洗脫:用含1%乙酸的甲醇溶液4mL洗脫。離心:將洗脫液離心(3500r/min,10min),取上清液作為樣品溶液。
1.3亞甲藍含量測定
用含1%乙酸的甲醇溶液作試劑空白,在(654±2)nm波長處測定各管吸光度。亞甲藍含量計算公式:供試血漿吸光度÷對照血漿吸光度×對照血漿亞甲藍濃度(1.0μmol/L)。
1.4重復性試驗
取不同規格的病毒滅活血漿標本各1份,重復測定10次,考察試驗的穩定性。
1.5統計學處理
實驗結果用spss14.0統計學軟件進行統計學處理,資料用x±s表示,數據比較用t檢驗及方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1不同規格的病毒滅活血漿亞甲藍殘留量測定結果
5種規格的病毒滅活血漿亞甲藍殘留量測定結果均小于0.3μmol/L,各組間兩兩比較,P均大于0.05。
2.2重復性試驗結果
5份樣品檢測結果的CV值均小于7%,具有較好的穩定性。
3討論
亞甲藍又名美藍,是一種酚噻嗪類化合物,也是一種表面攜帶正電荷的光敏劑,在臨床作為解毒藥物用于治療氰化物和亞硝酸鹽引起的高鐵血紅蛋白癥和抑郁癥。在MBP法中,亞甲藍可與帶負電荷的病毒核酸的G-C堿基對以及病毒的脂質包膜相結合,在可見光氧化損傷的作用下,使病毒的核酸斷裂,包膜破損,從而使病毒完全失去穿透、復制及感染能力,達到滅活病毒的目的。亞甲藍作為一種外來物質進入人體后,對人體的潛在影響尚不可知,因而控制病毒滅活血漿中亞甲藍的殘留量很有必要。
本實驗采用的檢測波長為(654±2)nm,考慮到在此波長下,血漿蛋白的吸收度遠大于殘存的微量亞甲藍的吸收度,因此不能直接采用分光光度法檢測血漿中殘存的微量亞甲藍,而采用固相萃取方法。固相萃取是一種試樣預處理技術,是利用固體吸附劑將樣品中的目標化合物吸附,將樣品的基體和干擾化合物分離,然后再用洗脫液洗脫,達到分離和富集目標化合物的目的。試驗需要注意的是,配制亞甲藍儲存液時,亞甲藍不需要烘干,因為亞甲藍帶有3個結晶水,易溶于水或乙醇,烘干后反而極難溶于水,溶解不充分,導致所配溶液的濃度低于預期濃度,造成檢測結果偏差。從表1中可以看出,血漿病毒滅活后再使用一次性病毒滅活過濾器濾除亞甲藍,可大幅降低血漿中亞甲藍的殘留量,不同規格的血漿檢測結果均小于0.3μmol/L,與2012年剛下發的《全血及成分血質量要求》(GB18469-2012)規定的標準相吻合。從表2中可以看出,采用本研究方法檢測血漿中的亞甲藍,穩定性好,不同規格的血漿檢測CV值均小于7%,平均為5.42%。本試驗所建立的方法工作流程嚴謹、操作性強、方法簡便、適用于采供血機構質量管理部門的日常血液質量檢查。
作者:梁啟忠葛健民程玉根柏則蓉掌友湖單位:鹽城市中心血站質量管理部