氣腫疽梭菌免疫學(xué)檢測方法探析

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摘要:氣腫疽梭菌是一種具有組織毒性、有鞭毛的孢子化革蘭氏陽性菌，可引氣腫疽這種反芻動物高致死性急性疾病。常見的典型臨床癥狀為發(fā)病動物肌肉豐滿部位發(fā)炎、腫脹，觸壓可聽到類似捻發(fā)音，流行呈現(xiàn)一定的季節(jié)性，并有區(qū)域性流行的特征。牛氣腫疽在養(yǎng)殖場中一旦傳播流行，往往會伴隨巨大的經(jīng)濟損失，所以更加需要加強對該病的防控與診斷。本文整理了氣腫疽梭菌的3種免疫學(xué)檢測方法（間接ELISA、Dot-ELISA、免疫膠體金技術(shù)），以供參考。

關(guān)鍵詞:氣腫疽梭菌；免疫學(xué)；檢測方法

民間俗稱的黑腿病即氣腫疽的別名之一，該病由氣腫疽梭菌引起，常見的典型臨床癥狀為發(fā)病動物肌肉豐滿部位發(fā)炎、腫脹，觸壓可聽到類似捻發(fā)音[1]。發(fā)病急促，潛伏期短，病情發(fā)展迅速，許多動物無可見癥狀即死亡[2]。該病主要通過患病的牛進行傳播，其具體經(jīng)過是患病牛在草場采食放牧期間污染土壤或經(jīng)過集約化養(yǎng)殖的飼料與飲水進行傳播。健康的牛采食被污染的食物后，病菌可以進入消化道，繼而發(fā)生感染。另外，氣腫疽梭菌的芽孢能在土壤中存活相當(dāng)長的一段時間，成為持久的傳染源[3]。本病一年四季均有可能發(fā)生，在氣溫高且濕度低的夏季更為多見，在地方性流行方面也呈現(xiàn)一定的特點，如在地勢相對低洼的地區(qū)該病更易發(fā)生。作為梭狀芽胞桿菌屬的一員，氣腫疽屬于專性厭氧菌。其菌體的長度為1.5~8.5μm，菌體兩端圓滑，無莢膜，因其有周身鞭毛而能夠運動，芽胞通常位于菌體中央，也有可能偏向其中一端[4]。一般來說，37℃即接近動物的體溫，對于氣腫疽梭菌而言是最適宜生長的溫度。在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可見菌落呈現(xiàn)圓形、顏色一般為半透明，中心略微隆起，邊緣不整齊，有β溶血環(huán)，但一般情況下現(xiàn)象不明顯[5]。在對該病進行檢測時，較為常用的手段多是以其流行病學(xué)特點、臨床癥狀表現(xiàn)及呈現(xiàn)的病理特征來做出判斷。被感染的動物通常發(fā)病迅速，甚至有的病例無可見癥狀即死亡。臨床上患病動物體溫升高，可達42℃[6]。有伴發(fā)敗血癥的機率，呈現(xiàn)全身癥狀，肌肉豐厚的部位腫脹、發(fā)炎。若病變部位位于肩部或后肢，則常出現(xiàn)行動障礙。患病動物通常會在1~3d內(nèi)死亡，尸體腐敗速度快，天然孔可見暗紅發(fā)黑血液流出，通常呈現(xiàn)為泡沫樣[7]。取肌肉做切面，也呈黑紅色。該病主要危害牛羊等反芻動物[8]，但近幾年也有人被感染的病例，這使得該病又一次成為各國各地相關(guān)人員關(guān)心的研究熱點。在對該病進行診斷時，需注意該病與炭疽和惡性水腫的臨床癥狀均有一定的相似之處，應(yīng)鑒別診斷。

1間接ELISA

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測定，是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應(yīng)的定性和定量的檢測方法。該方法自建立以來，就以其操作簡單、反應(yīng)迅速、敏感性高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于各項實驗室檢測。間接ELISA原理為利用酶標(biāo)記的抗體以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體[9]。該方法是對多成分進行分析，尤其需要注意對其組成成分進行嚴格控制，否則將會對結(jié)果造成相當(dāng)大的影響。車達等[10]于2011年首次成功構(gòu)建了氣腫疽間接ELISA檢測方法，通過超聲波對菌體進行破碎，將裂解后的氣腫疽梭菌菌體作為抗原，設(shè)立梯度稀釋度，并最終確定在質(zhì)量濃度為50μg/mL、酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶2000的條件下效果最佳，成功建立了病原菌的酶聯(lián)免疫吸附試驗。該方法簡便快捷，不但針對性強，而且在重復(fù)試驗中也有較好的表現(xiàn)。

2Dot-ELISA

斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種用纖維素膜代替酶固體載體法的反應(yīng)板的免疫分析方法，該方法彌補了涂層薄弱、易失效、樣品少、節(jié)省材料等缺點[11]，原理和ELISA很相似。抗原吸附在纖維素膜上，與抗原-抗體酶標(biāo)反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，同時保持其免疫活性。該配合物能夠在酶的參與下顯示染色結(jié)果，檢測結(jié)果可以通過染色的色深來判斷。姜永越[12]成功從氣腫疽梭菌C54-1標(biāo)準(zhǔn)株中提取有效抗原，純化后用特異性最強的抗原免疫豚鼠。免疫4次后，血清稀釋1000倍，用ELISA檢測其OD150nm值達1.6以上。Dot-ELISA的重復(fù)性試驗表明，血清具有特異性和穩(wěn)定性，可作為氣腫疽梭菌的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測方法。當(dāng)以1∶1024稀釋抗體時，抗原最小含量為3.15μg，分泌抗原最小含量為1.89μg，酶標(biāo)二抗的最佳濃度為1∶4000，可以檢測到微量氣腫疽梭菌毒素。

3免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[13]。該技術(shù)具有制備簡便、標(biāo)記簡單、特異性強、敏感性高、定位準(zhǔn)確、適應(yīng)性廣等特點，且膠體金試紙保存方便，無需任何復(fù)雜的儀器設(shè)備，可憑肉眼判斷結(jié)果。該技術(shù)的進步能夠極大地方便各種疾病在現(xiàn)場的快速檢測，因此在近些年得到了飛速的發(fā)展。任春宇等[14]參考了免疫層析法的技術(shù)，選取氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株，制備氣腫疽梭菌單克隆抗體，并根據(jù)抗原-抗體的特性將單克隆抗體與膠體金標(biāo)記結(jié)合，建立了不需要再加入任何檢測試劑且快速簡便的檢測方法，成功研制出了膠體金免疫層析試紙條，可在短時間內(nèi)對氣腫疽做出準(zhǔn)確診斷。該方法與ELISA檢測相比，反應(yīng)更為快捷，也呈現(xiàn)出了更強的特異性，當(dāng)抗原量≥1×105CFU/mL時，即可檢測成功，且有較好的穩(wěn)定性。

4小結(jié)

自20世紀以來，氣腫疽在國內(nèi)20多個地區(qū)的暴發(fā)給我國畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[15]。對于氣腫疽這種病程短、發(fā)病急、危害嚴重的傳染性疾病而言，及時鑒別和快速診斷是極為重要的控制手段。因此，需要加強對該病的研究，采用分子生物學(xué)和免疫學(xué)的手段，一方面加快對新型疫苗的研制，另一方面要建立更加簡便有效的檢測方法。只有這樣才能更好地控制氣腫疽的傳播和蔓延，將該病帶來的損失降到最小。以上列出的3種免疫學(xué)檢測方法各有優(yōu)勢與局限性，需要針對實際需求、臨床操作條件以及試驗環(huán)境[16]選擇符合條件的病原體檢測方法進行疾病診斷。另外，也有相當(dāng)多的分子生物學(xué)檢測手段可以加以利用，因此，必要時也可以同時采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法進行判斷，以確保診斷無誤。

作者:張文璇 曲庭偉 方程 金鑫 嚴昌國 單位:延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系 東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系