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1IgY的提取與純化
卵黃作為特異抗體IgY的來源有許多優點。如:母雞易于飼養,費用不高;收集雞蛋方便,無需抽動物血,無損傷,符合現代動物保護規則;產生有效免疫反應所需抗原量小,尤其是高度保守的哺乳動物蛋白質對種系發生學上距離較遠的禽類通常有較強的免疫原性。Carroll和Stollar(1983)[7]僅用總量30~475μg的增殖細胞核抗原,成功地產生雞抗弱免疫原性RNA多聚酶II的抗體。而Stuart等[8]分別用人胎盤膜及肝臟膜免疫,均獲得大量抗人胰島素受體和抗人胰島素樣生長因子1(IGF-1)受體。眾所周知,人肝膜僅含微乎其微的IGF-1,進一步說明了免疫所需抗原量少。此前他們曾多次用相同的抗原免疫家兔均告失敗。完全福氏佐劑的使用使抗體持續時間長且產量高。
Gottstein和Hemmeler(1985)[9]的實驗表明,在一個月內收集的提純IgY產量比兔血清高18倍。Gassmann等[10]用20~30μg增殖細胞核抗原初次免疫20天后出現特異IgY抗體,30天達高峰,并持續81天以上;卵黃中無其它Ig類,使得IgY易于提純等。此外,某些病原微生物如輪狀病毒,衣原體等可在雞胚中增殖。用這些感染的雞胚組織為抗原免疫雞獲取相應抗體時,可省去抗原提純的復雜過程。但首先要找出有效、經濟、簡便的提取方法,才能使IgY的應用成為可能。近十幾年來,已建立了許多較為高效而經濟的方法。這些方法大多以PEG[5]、硫酸葡聚糖[6]、自然膠,如藻酸鈉、角叉菜膠(Hatta等,1990)[11]或乙醇沉淀等方法初步純化工蛋白質。產量約為每ml卵黃提取IgY5~7•5mg,純度87%~89%。Akita等在此基礎上建立了水稀釋法[12]。即以9份水稀釋1份卵黃,離心去除顆粒,再用硫酸鹽沉淀法濃縮,并經超濾或乙醇沉淀或鹽沉淀進一步純化、濃縮,再經凝膠過濾提純,產量達9•8mgIgY/ml卵黃,純度94%。
此實驗中以PEG代替硫酸鹽沉淀,可進一步提高產量。Bade和Stegemann(1984)用[13]預冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白質并去除脂質,經DEAE柱層析進一步純化,方法簡便、省時。其IgY抗體活性與用Polson法提純的IgY之間無明顯差別。且穩定性好,經3次以上凍融,抗體活性未見改變。Hassl和Aspock用疏水交換層析和凝膠過濾二步法分離提純IgY[14],雖然產量不及PEG或乙醇沉淀法,但活性相似,且純度較高。IgY的進一步提純可用提純其它蛋白質的方法。常見的有凝膠過濾、DEAE纖維素陰離子交換柱層析和親和層析等方法。必須指出,許多動物IgG均可用蛋白A親和分離。但IgY不能與蛋白A結合。McCannel和Nakai(1990)[15]用DEAE離子交換層析分離IgY亞群。在提高磷酸鹽離子濃度的同時,始終維持一定的pH值。固相金屬離子親和層析是一種蛋白質純化技術。最常用的金屬離子有Cu2+、Ni2+,Co2-、Zn2+。研究表明Fe3+離子與磷酸化氨基酸有很強的親和力[16]。
結合于離子柱上的蛋白質常通過降低pH值或提高鹽濃度或二者合并進行洗脫。Greene和Holt[17]用固相金屬離子(Fe3+)親和層析,通過改變pH梯度,根據4個洗脫峰將IgY分為4個亞群。Marti等(1997)[18]將重組蛋白抗原結合于Ni-NTA柱上,用免疫親和層析純化特異IgY,效果良好。Kim等[19]用特異性IgY制成抗生物素蛋白質-酰化生物素系統的親和層析柱,用于IgG的分離和提純。用不同的提取方法所得的IgY分子量也各異。Bizhanov比較了氯仿、萄聚糖藍(dextranblue,DB)和PEG三種提取IgY的方法,前者IgY產量比后二種方法高2~4倍;用SDS-PAGE分析其相應產物,發現DB法提純獲得三種主要的蛋白成份:34•7KDa、41KDa和66Kda,并含少量45Kda成份:氯仿法提取主要含兩種蛋白成份:45•7KDa或75•2KDa;而用PEG提取獲得以66KDa為主的蛋白成份,氯仿及PEG法提取的蛋白質中也包含少量41~80KDa的IgY[20]。
2在醫學方面的應用
IgY的應用與其生物學特性密切相關。在免疫診斷方面,由于IgY不激活補體、不結合類風濕因子、不與蛋白A、蛋白G、哺乳動物Fc受體和補體結合,與IgG幾無交叉反應,故可作為免疫學實驗檢測工具,用于測定循環復合物、類風濕因子和補體等,減少假陽性。
VanRegenmortel等[21]將雞補體C1和豚鼠補體C1混合,進行定量微量補體結合試驗,解決了禽類補體難以固定的問題。該方法適用于檢測微量病毒抗原,測定病毒蛋白肽片段上的抗原活性或禽類血清抗體,可用于各種特異性病毒學檢測。Terzdo等以雙毛細管透析濃縮法提取特異性抗沙門氏菌腸出血型腸炎株IgY,用玻片菌體凝聚及試管鞭毛凝聚法測試了367株腸道菌和2株弧菌。結果該IgY只與沙門氏菌腸出血型腸炎株及其它抗原基因型相關的菌株起反應,表明可用此IgY檢測沙門氏菌腸出血型腸炎株[21]。αl-低氧誘導因子(HIF-1,一種蛋白質)結合于一種含有HIF-1DNA結合位點的寡核苷酸。在基因核測方面,Camenisch等用HIF-1免疫并經親和層析純化提取特異性IgY,根據電泳遷移率分析,用WesternBlot法測定人及哺乳動物細胞核提取液中的HIF-1,并用IgY抗體沉淀低氧細胞抽提液中的HIF-1,還在免疫熒光法中用此IgY測出定位于細胞核的HIF-1[23]。
由于如前所述卵黃作為特異抗體IgY的來源的許多優點,IgY在免疫學檢測方面正在受到愈來愈廣泛的應用。在免疫治療方面,因雞抗體耐酸、耐熱且性能穩定,可經口服用于預防或治療年幼動物或人類的腸道傳染病,如嬰兒防病食品,齲齒預防,新生乳豬致死性大腸桿菌感染的預防,以及魚病治療等。特別是抗生素或其它藥物的使用存在問題時,IgY成為首選。Farrely等用產毒性大腸桿菌免疫制備特異IgY抗體經口給藥預防兔腹瀉病[24]。其中陰性對照組在用產毒性大腸桿菌攻擊后,72h內全部發生嚴重腹瀉;實驗組在攻擊前4天開始喂飼卵黃,攻擊后未見明顯不良反應。實驗還表明正常卵黃有部分保護作用:4只家兔喂以正常卵黃,其中3只發展為中度腹瀉,1只完全正常,不發病。該研究小組還進行了體外實驗,表明1,IgY干擾E•coli與提純的小腸粘膜蛋白結合;2,IgY的此項干擾作用優于雞血清IgG抗體。Yokoya-ma等[24]進行了IgY經口服抗感染的保護性試驗。
4日齡新生小牛經口接種致死性傷寒沙門氏菌,并在同一天開始給予IgY口服,每日3次連服7~10天。結果對照組小牛全部死亡,低劑量IgY組死亡率60%~100%,高劑量組無一死亡,僅出現發熱或腹瀉,成功地用IgY抗小牛致死性傷寒沙門氏菌感染。Robert[26]用卵黃及其提取物成功地抑制組織細胞培養的輪狀病毒生長。在感染動物實驗模型中,特異IgY可防止動物發展為輪狀病毒性胃腸炎,表明卵黃提取物可作為抗病毒抗體來源,防治嬰幼兒輪狀病毒腹瀉。IgY耐熱,經巴氏消毒后活性依舊[27],這使卵黃制品的消毒及經口服防病治病成為可能。在腫瘤研究方面,IgY也顯示出了可喜的應用前景。甘露糖-6-磷酸酯/胰島素樣生長因子II受體(M6P/IGFII-R)與新合成的溶酶體酶的運輸、IGFII的降解和TGFbaI的活性有關,是哺乳動物中一種高度保守的蛋白質,由腫瘤抑制基因編碼,目前尚未有特異抗體可用于臨床研究。Lemamy等[28]由免疫的雞卵黃中提取特異性抗M6P/IGFII-R抗體,用于免疫過氧化物酶染色,見M6P/IGFII-R存在于乳腺癌和卵巢癌細胞株(T47D,MDA-MB231,MCF7和BG1)的高爾基體中。另外還用于免疫組化法染色,分析了40份浸潤性乳腺癌冷凍切片中M6P/IGFII-R水平及其與腫瘤大小、惡化程度以及雌激素及孕激素的關系,提示M6P/IGFII-R水平在腫瘤細胞中明顯低究和效率不斷提高,IgY在醫學方面越來越顯示出不可估量的應用前景。