生物醫學親和層析應用分析

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1概述

親和層析屬于液相色譜，它是以共價偶聯了親和配體的介質為固定相來吸附或研究與其發生相互作用的分子。親和配體可以是蛋白分子、酶、抗體、抗原，也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制劑、小分子化合物(如藥物或激素)等。很多親和配體具有很高的選擇性，將偶聯了配體的介質裝在柱子中，可以很好的用于分離、檢測或研究復雜樣品中的目標分子。親和層析介質主要由三部分組成：配體、間隔壁、基質。配體是決定親和層析成功與否的一個重要因素。根據配體的類型，可以將親和層析進行分類，如凝集素親和層析、硼酸鹽親和層析、免疫親和層析、金屬螯合親和層析等。在設計和使用親和層析柱時，偶聯配體所使用的基質的類型也很重要。以瓊脂糖或纖維素等多糖類物質為基質的親和層析介質常用于樣品預處理或者靶分子的分離純化。這種基質易于修飾和活化，有利于基質和配體的偶聯，并且具有較好的物理化學穩定性，非特異性吸附少。但是這種基質的機械性能較差，在使用時柱壓不能太高，分辨率和效率相對于高壓系統也較低。對于高壓液相親和層析，可以使用二氧化硅顆粒或者整體柱材料為基質[1]。采用這種基質的親和層析柱可以用于HPLC或與其他分析方法(如質譜)聯合運用。

2親和層析應用的常見方式

首先，要選擇合適的樣品處理緩沖液以利于目標分子與配體的結合。將處理好的樣品上到親和層析柱上，與配體無相互作用或作用弱的分子從柱子上穿出；然后通過更改流動相的pH或添加競爭劑，使目標分子與配體解離從而被洗脫下來。根據目標分子的性質，可以通過紫外吸收、熒光、質譜等方法對其進行檢測。親和層析的分離過程簡單、快速，具有較高的選擇性，廣泛用于生物醫學和藥物分析中樣品的分離和預處理。另外，除了可以利用親和層析的吸附作用來富集目標分子外，同樣也可以利用親和層析來去除樣品中影響分析的分子。如在蛋白組學的研究中，可以用親和層析柱先去除白蛋白、IgG等高豐度蛋白，再研究低豐度蛋白[2]。

3凝集素親和層析

凝集素是一種非免疫來源的蛋白質，能識別并結合特定類型的糖基，廣泛分布于植物、動物和微生物中[3]。凝集素親和層析以偶聯了凝集素的基質為固定相，常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麥胚凝集素(WGA)、榴蓮凝素等，它們能識別不同的糖基，廣泛用于分離和鑒定糖蛋白、糖肽、糖脂、寡糖[4]。

4硼酸鹽親和層析

硼酸鹽親和層析以硼酸鹽為配體。在堿性條件下，大多數硼酸鹽衍生物能與含順式二醇基團的糖或糖蛋白結合。在過去的幾十年中，臨床實驗室一直將其用于糖化血紅蛋白的定量。糖化白蛋白以及一些載脂蛋白也可以用類似的方法來分析研究[5]。T.Suksrichavalita等利用“點擊化學”(clickchemistry)的方法合成了新的硼酸鹽，可以用于分離糖蛋白如卵清蛋白和RNaseB[6]。將硼酸鹽和凝集素共同偶聯到基質上，可以更好的用于分離糖蛋白[7]。

5免疫親和層析

免疫親和層析是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。以抗體為配體，免疫親和層析可以用于分離純化激素、酶、多肽、病毒等[8]。在臨床實驗室，該方法已經被用于分析乙酰膽堿酯酶、聯苯胺、IgG、胰島素、轉鐵蛋白等[9]。以抗原或蛋白A/G為配體，可以對抗體進行純化。

6金屬螯合親和層析

金屬螯合親和層析是利用蛋白質表面暴露的一些氨基酸殘基和基質上的金屬離子之間的相互作用而進行的親和純化。金屬離子通過螯合劑固定在基質上，常用的離子有Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等，它們與氨基酸殘基的結合能力有強有弱。金屬螯合親和層析可以用于藥物檢測前的樣品預處理，還可以結合質譜用于疾病診斷標志物的檢測[10]。

7生物分子相互作用研究

親和層析除了可以用于分離和測定靶分子，還可以用于研究生物分子的相互作用，如酶/抑制劑、蛋白/蛋白、蛋白/DNA等[11]。GSTpulldown就是一種研究蛋白相互作用的技術，其基本流程是：將“誘餌”蛋白與GST融合表達，當融合蛋白通過偶聯了GSH的柱子時，可以通過GSH和GST的親和作用而吸附在柱子上，把待測樣品上到柱子上，與誘餌蛋白相互作用的蛋白就會被吸附到柱子上，再對其分析鑒定即可[12]。在生物醫學和藥物分析研究中，親和層析已經成為一項常規的分離工具。通過使用不同的配體和基質，并結合其他技術和方法，來達到所需的應用目的。另外，親和層析還可以用于研究生物分子的相互作用等，相信未來親和層析的應用會越來越廣泛。