胃癌增殖論文：PKGⅡ對胃癌增殖的抑制作用

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本文作者：桑建榮陳永昌李月英陶燕邵根寶作者單位：江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院生理學系

pkgⅡ對EGF引起的SGC-7901細胞增殖有抑制作用

MTT檢測結果顯示，Ad-PKGⅡ＋8-pCPT-cGMP＋EGF組細胞的D值明顯低于Ad-PKGⅡ＋EGF組和Ad-LacZ＋EGF組（P＜0.01），與Ad-LacZ組比較差異也有統計學意義（P＜0.01）。這說明EGF處理后，明顯增強了SGC-7901細胞的增殖能力，用8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的細胞后，細胞的增殖活性明顯降低，結果表明PKGⅡ顯著抑制了胃癌細胞的增殖（圖1）。

PKGⅡ對EGF誘導的p-RSK1的核轉錄有抑制作用

蛋白質免疫印跡法檢測結果顯示，8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的SGC-7901細胞后，PKGⅡ顯著抑制了EGF引起的RSK1磷酸化水平的升高。同時檢測細胞核內p-RSK1（Ser380）的結果表明，PKGⅡ顯著抑制了p-RSK1向細胞核內移位（圖2A）。免疫熒光檢測結果（圖2B）顯示，EGF處理后，SGC-7901細胞核內有大量p-RSK1（Ser380）的累積；經8-pCPT-cGMP預處理后，EGF誘導的細胞核內p-RSK1（Ser380）的累積大幅度減少，與蛋白質印跡法檢測結果一致。

PKGⅡ抑制EGF誘導的SGC-7901細胞中c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表達

RT-PCR檢測結果顯示，EGF作用SGC-7901細胞后c-Fos和c-JunmRNA的表達水平較Ad-LacZ組明顯增加；在Ad-PKGⅡ感染的細胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-JunmRNA的表達水平低于Ad-LacZ＋EGF組（圖3A）。蛋白質印跡法檢測結果顯示，EGF可明顯上調SGC-7901細胞中c-Fos和c-Jun蛋白的表達；在Ad-PKGⅡ感染的細胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-Jun蛋白的表達水平下調（圖3B）。

EGF通過與細胞表皮生長因子受體特異性結合，引起靶細胞內一系列生物效應，控制著細胞的增殖、分化和癌變。研究表明，胃癌細胞中EGF及EGFR過度表達，對胃癌的發生和發展有一定作用，而且二者還可刺激某些癌基因的擴增[9,10]。本研究結果顯示，Ad-PKGⅡ組對EGF刺激引起的胃癌細胞增殖無明顯的影響，但經8-pCPT-cGMP激活PKGⅡ后，即可明顯抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖活性。

MAPK介導的信號通路具有調控基因轉錄、調控細胞周期以及維持細胞生存等生物活性，在腫瘤的發生中有重要的調控作用。EGF及EGFR是MAPK信號轉導通路的主要啟動者，EGFR磷酸化，活化小G蛋白，進而使絲/蘇氨酸激酶Raf和MEK激活，再特異性地激活MAPK中的ERK，最終通過調節多種轉錄因子[如Elk-1和激活蛋白等]的活性而調控基因表達[11]。本研究結果表明，PKGⅡ對EGF誘導的ERK下游的信號分子RSK和原癌基因的表達均有抑制作用。

哺乳動物中RSK家族已得到證實的有4個成員（RSK1、RSK2、RSK3和RSK4），它們的典型特征是含有2個不同的功能性激酶結構域和羧基端ERKs結合結構域[12,13]。RSK1～3可以被MAPKs磷酸化所激活，也可以通過自身磷酸化激活。RSK在被MAPK磷酸化激活時，由Ras、Raf、MEK和MAPK/ERK信號通路所介導。SK激酶結構域內外的幾個位點（包括Ser380、Thr359、Ser363和Thr573）的磷酸化都對RSK激酶活性的激活非常重要。ERK磷酸化RSK1的C-末端激酶結構域Thr573，進而使Ser363和Ser380位點磷酸化，最終完成整個RSK1分子的活化[14,15]。本研究選取受ERK激活通路調節的磷酸化位點Ser380，觀察在EGF刺激下，PKGⅡ對胃癌SGC-7901細胞中RSK1活性調節的作用。結果發現，在EGF刺激下，RSK1Ser380位點的磷酸化水平升高，明顯高于Ad-LacZ對照組；激活后的PKGⅡ則抑制了p-RSK1（Ser380）和核轉錄。因此，筆者推測，PKGⅡ是通過ERK依賴的蛋白激酶通路來抑制RSK1的活性，從而抑制胃癌細胞的增殖。當然，為了明確RSK1激活的分子機制，還需要應用ERK通路的抑制劑或激動劑進行進一步的研究。

在腫瘤發生、發展的基因調控中，原癌基因c-Jun和c-Fos尤為重要，易受外界刺激，二者結合組成Ap-1復合體[6]。c-Jun和c-Fos的表達增強并且共同表達，有可能是細胞不斷增殖的觸發點，它們相互作用并影響其他基因的表達，使細胞最終增殖失控發生癌變[16]。為了進一步研究PKGⅡ對ERK下游信號分子的作用，本研究應用蛋白質印跡法和RT-PCR法對Ap-1的主要組成因子c-Fos和c-Jun進行了蛋白表達及mRNA表達水平的檢測，結果表明在感染并激活的PKGⅡ細胞中，c-Jun和c-Fos的表達無論在蛋白水平還是mRNA水平均明顯低于Ad-LacZ＋EGF組，提示PKGⅡ可能通過抑制c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表達，進而抑制Ap-1形成。Jun及Fos基因的蛋白表達產物定位于細胞核，目前已知有3種Jun蛋白（c-Jun、JunB和JunD）及4種Fos蛋白（c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2）[17,18]。本研究只檢測了PKGⅡ對c-Jun和c-Fos的作用，PKGⅡ對Jun和Fos家族其他成員的蛋白和mRNA的表達是否也有影響，尚有待進一步研究。

研究顯示，用編碼PKGⅡ的腺病毒感染胃癌細胞，導致PKGⅡ高表達，經8-pCPT-cGMP作用使其激活，可明顯抑制EGF誘導的MAPK/ERK激活，使細胞增殖受到明顯抑制[7]。結合本研究結果，筆者推測在胃癌發生過程中，PKGⅡ通過抑制ERK，抑制依賴ERK下游的重要激酶RSK1Ser380位點的活化，進而作用于c-Jun和c-Fos，減弱其蛋白的合成以及降低其mRNA的表達，使胃癌細胞的增殖信號轉導受到抑制，從而抑制胃癌細胞的增殖。