胚胎干細胞

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胚胎干細胞范文第1篇

【關鍵詞】胚胎干細胞;臨床醫學;應用

【中圖分類號】R817.4【文獻標識碼】A【文章編號】1044-5511（2011）10-0123-01

一、引言

胚胎干細胞是一種存在于囊胚內的原始細胞團或存在于早期胚胎中的原始生殖細胞，在適當的條件下，它能夠在體外進行無限次的擴增并保持未分化的狀態。可以說，這是一種未分化的全能行細胞，它具有無限增殖性、多向分化性和可塑性等多種優良品質。人體正常的胚胎干細胞含有23對染色體，呈現出胞核大、胞漿小的形態特點，在體外培養時，它們會緊聚在一起，呈一個集落且沒有明顯的界線，通過適當的引導它可分化成人體所需各種細胞類型。上個世紀末期，美國科學家從早期的胚胎中取出原始生殖細胞，建立了最早的人類胚胎干細胞體系，這成為了人類繼“人類基因組計劃”之后的又一個熱門話題，極大的轟動了國際學術界，目前，胚胎學已經成為了一門基礎的醫學課程。

從表面看去胚胎學與臨床醫學之間關系不大，但研究發展，許多疾病都發生在細胞層面、組織層面和分子層面，也就是說胚胎干細胞與臨床醫學息息相關。隨著科學技術的進步，人類的認知能力會越來越強，胚胎學也將發揮越來越重要的作用。那么胚胎干細胞是怎么發展起來的呢，它到底又有什么樣的發展前景呢，為此，本文在前人工作的基礎上總結了胚胎干細胞的發展過程和臨床應用研究。

二、胚胎干細胞的研究進展

人們對胚胎干細胞的研究開始于胚胎癌細胞或者說畸形胎瘤干細胞。1958年，有人把胚胎干細胞移植到小鼠精巢或腎臟的被膜下，能夠得到小鼠的相應細胞。1974年，科學家把胚胎干細胞注射到正在發育的胚泡腔后，胚胎干細胞能夠發育成胚胎嵌合體。到了70年代末期，人們已經形成了用正常的胚胎干細胞作為遺傳物質載體來研究基因對胚胎發育影響的思想。

1981年哺乳動物胚胎干細胞研究進入了它的新紀元時代，這年科學家利用小白鼠胚胎，在體外培養分離出了其干細胞并建立了類胚胎干細胞。在隨后的7~8年里，科學家相繼用延遲著床的辦法建立了倉鼠、兔、羊、豬、牛以及水貂的類胚胎干細胞。1994年，美國科學家分離得到了人類的傳2代胚胎干細胞。1998年，科學家用類似的方法分離并克隆出了可以傳32代的人類胚胎干細胞，在這研究過程中科學家成功完成了人類胚胎干細胞的冷凍和解凍實驗，該項研究成果被美國時代雜志評為上世紀九十年代“世界十大科技進展”之首。

本世紀初，美國科學家卡茨和赫德里克研究培養出了成體干細胞。這種細胞是由從人的大腿或臀部抽取少量脂肪和液體培養而來，它們能夠在適當的引導條件下發育成健康的肌肉、骨細胞和軟骨，保持了胚胎干細胞發育成各種組織和器官的全能性。這一成果有可能使脂肪組織成為干細胞的主要來源，解決了科學家必須從骨髓或胚胎組織中提取干細胞的難題。

三、胚胎干細胞的臨床應用

胚胎干細胞具有良好的自我更新功能，在給予合適的信號誘導或在適當的外界條件下，它可以分化成構建人體的不同細胞，用這類細胞分化成的特定器官進行移植時，排除了免疫排斥過程。所以說，胚胎干細胞作為一種“種子細胞”一定會在臨床應用中有重要的應用，目前，應用最多最成熟的還是自體干細胞移植。

有了自體干細胞移植，在病床上躺了三個月的35歲的李先生又重新站了起來。今年上半年，李先生因交通事故，造成第四、第五胸椎粉碎性骨折，神經中樞受損，導致雙側以下失去感覺，大小便失禁，肌肉萎縮，下肢癱瘓。檢查表明脊髓呈橫貫性損害，醫生決定為李先生進行自體骨髓干細胞移植。手術一月后患者的身體感覺平面已經恢復到了膝關節，三個月后下肢肢體觸覺全部恢復，在攙扶下可站立10多分鐘，并能借助輪椅自理生活。

3.1用于治療遺傳病、癌癥等疾病

癌癥、遺傳病是人類目前最嚴重的醫學難題，發生這些疾病是因為細胞在轉化和分化的過程中出現異常。胚胎干細胞技術的出現為弄清細胞分化、發育過程，更深刻的了解細胞分化的奧秘提供了方法，為治療上述疾病提供了嶄新的手段和可能性?？茖W家已利用胚胎干細胞制造出許多小鼠的疾病模型，并使人的致病基因在小鼠體內表達，為下一步治療人類疾病奠定了堅實的基礎。美國國家神經病研究所分子學實驗室用小鼠胚胎干細胞誘導神經上皮細胞，植入腦內得到大量的小突狀細胞和神經膠質細胞，設想可用來治療多發性硬化癥。

3.2用于器官組織移植

作為一種被稱之為種子細胞的胚胎干細胞，為臨床的組織，器官移植提供大量材料。胚胎干細胞經過免疫排斥基因剔除后，再定向誘導終末器官以避免不同個體間的移植排斥。這樣就可能解決一直困擾著免疫學界及醫學界的同種異型個體間的移植排斥難題。美國ACT公司將人皮膚細胞核移植到去除所有遺傳信息的牛卵母細胞中，培育出具全能性的胚胎干細胞。如果能將其成功地應用于臨床，將來許多疑難疾病都將得到根治，對其他若干疾病也有理想的治療效果。

3.3用于新藥研制和開發

應用胚胎干細胞研究可以大大改變研發藥品及其安全性檢驗。因為從理論上講胚胎干細胞可以在體外培養出人體的210種不同類型的細胞。故可以對不同藥物進行不同細胞類型的細胞水平的致畸形實驗和藥物篩選，使藥品研制過程更趨合理有效并避免消耗大量實驗動物。如應用胚胎干細胞培養成大量心肌細胞，將有助于心臟病藥物的開發等。此外，胚胎干細胞還將用于出生缺陷、不孕、流產的控制與檢測等方面。

四、結語

展望本世紀，生物醫學工程將是一個被高度發展的世紀，現在人們意識不到的許多事件都將會出現在人們的面前，如生物經濟將取代目前的網絡經濟。胚胎干細胞技術的應用價值不可估量，目前，其已成為了各國研究焦點之一。不過，從胚胎干細胞研究到實際臨床應用之間還會有很長的一段路要走。

胚胎干細胞研究不是一個潮頭，它將是一個巨大的推動力，推動著生物醫學深刻革命，給人類帶來更多的福音!到那時，如人們的某組織器官失靈了，完全可以像更換機器零件那樣，用自身的成體干細胞定向誘導分化形成的組織器官替代失靈器官，而不擔心供體不足的問題，更不用擔驚受怕移植排斥的問題。

參考文獻

胚胎干細胞范文第2篇

近日，英國倫敦帝國學院（Imperial College London）的科學家成功地利用人類胚胎干細胞培養出了軟骨細胞，這為在將來某一天進行軟骨移植提供了很好的契機。

研究結果發表在《組織工程》雜志中，文章詳細闡述了帝國學院研究小組將胚胎干細胞變成軟骨細胞的過程。這樣，醫生將可培養軟骨細胞并將其移植到許多受損或患病的組織中，即使因運動產生的損傷也可用新的軟骨取而代之，甚至是進行整容手術。

軟骨（Cartilage）是骨間非常密集的結締組織，允許關節之間進行平滑的移動。

文章的第一作者Archana Vats博士說：“利用干細胞培養軟骨的技術在臨床研究中具有巨大的應用價值。目前英國的老齡化問題越來越嚴重，長壽不可避免地成為備受關注的話題。在此之前，醫生也能進行關節移植，卻不能移植軟骨。而更換軟骨后就可以避免再對關節進行移植?！?/p>

研究人員在特定系統實驗室的有蓋培養皿中培養人類胚胎干細胞，進而促使其變成軟骨細胞。與生長中的胚胎干細胞相比，在干細胞與軟骨的混合物中存在較高含量的膠原質和軟骨蛋白。

科研人員將這些胚胎干細胞移植到老鼠體內的特定生物活性部位，之后進行了35的觀察。當干細胞脫離活性部位后，研究人員發現這些細胞形成了新的軟骨，研究結果顯示這些軟骨還可以被成功移植到活體組織中去。

胚胎干細胞范文第3篇

【摘要】

為了探討Ras信號通路對小鼠胚胎干細胞(Embryonic Stem cells， ES cells)造血分化的影響，將突變型基因RasN17轉染小鼠ES細胞，免疫印跡檢測RasN17的表達對Erk1/2及Akt磷酸化的作用，應用半定量RTPCR檢測ES細胞在分化過程中與造血相關的基因的表達。結果表明：Ras N17的表達能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，攜帶RasN17基因的ES細胞在分化過程中Runx1 、SCL 及betamajor珠蛋白等基因的表達被顯著抑制， 而FLK1的表達不受影響。結論：ES細胞體外造血分化需要Ras通路的活化。

【關鍵詞】 胚胎干細胞； 造血分化； Ras

Suppression of Ras Mediated Signaling Attenuates Hematopoietic Differentiation of Embryonic Stem Cells of Mice In Vitro

Abstract

To investigate the possible involvement of Ras signaling in the hematopoietic differentiation of embryonic stem cells (ES cells)， ES cells were transfected with RasN17， the dominantnegative mutant of Ras. Western blot was used to test the effect of RasN17 expression on Erk1/2 and Akt phosphorylation， semiquantitative RTPCR was used to detect expression of gene related to hemalopoiesis in differentiation of ES cells. The results showed that the expression of RasN17 in the ES cells remarkably downregulated the phosphorylation of Erk1/2 and Akt simultaneously. Moreover， the expression of several markers related with hematopoiesis including Runx1， SCL and betamajor globin， were significantly suppressed in the EB expressing RasN17， whereas the transcription of Flk1， a gene required earlier than SCL in development of hematopoietic and endothelial lineages， was not influenced. It is concluded that the activation of Ras is pivotal for in vitro hematopoietic differentiation of ES cells.

Key words

embryonic stem cell; hematopoiesis differentiation; Ras

Ras是由1條多肽鏈組成的低分子量蛋白，由原癌基因ras編碼而命名，包括K，N，H 3種類型。Ras的活性取決于其與GTP及GDP的結合，與前者的結合是其活化形式。 它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信號通路上游的重要組成成分，并通過參與調控這些信號通路而影響細胞的增殖與分化。最近研究發現，Ras及其下游信號分子均參與調控小鼠的胚胎發育，并且不同類型的Ras對胚胎發育特別是造血發育發揮不同的調控作用［1］。胚胎干細胞(embryonic stem cell， ES cell)是一種具有全能分化特性的細胞，其體外造血分化可以模擬并重現體內胚胎造血過程。報道表明：Ras及其下游的信號通路對ES細胞體外培養過程中全能性的維持非常重要［2］。但Ras蛋白能否調控小鼠ES細胞體外造血分化并不明確。為此，本研究探討了Ras信號通路阻斷對ES細胞造血分化的影響。

材料和方法

材料

DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均為Hyclone公司產品。硫代甘油（MTG）為Sigma公司產品。丙酮酸鈉、無蛋白雜交瘤培養液Ⅱ（PFHM Ⅱ）購自GibcoBRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）購自Chemicon公司。小鼠干細胞因子（SCF）為PeprotTech公司產品。小鼠將CCE細胞接種于Co60照射后的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上，于5% CO2、飽和濕度、37℃條件下進行維持培養。維持培養體系組成為：DMEM 含15%胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μmol/L MTG 及mLIF 1 000 U/ml。在造血分化培養前48小時將細胞傳代于預分化培養體系，即將維持培養體系內DMEM更換為IMDM，其他成分不變。預分化培養48小時后按常規傳代收集細胞并計數，細胞按2×103接種于直徑35 mm的Petri dish，培養體系為：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纖維素、2 mmol/L L谷氨酰胺、150 μmol/L MTG、1 mmol/L的丙酮酸鈉、2 mmol/L PFHMⅡ、50 ng/ml的SCF，培養條件同維持培養。

ES細胞的pCMVRasN17及 pCMV質粒轉染

質粒pCMVRasN17購自Clontech公司，pCMV質粒空載體為本室構建并鑒定。傳代貼壁培養12小時的ES細胞應用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司產品)按說明書進行轉染。24小時后傳代于含neo基因的MEF（neoMEF）之上，并同時加800 μg/ml的G418篩選陽性克隆。 7 天后挑取不同細胞克隆擴增后鑒定外源基因的表達。

相關基因的RTPCR檢測

TRIzoL（Sigma公司產品）提取細胞總RNA，按AMV及Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)說明書進行半定量RTPCR以檢測相關基因的表達，即每份樣本分別取0.02 μg（0.01×），0.2 μg（0.1×），2 μg（1×）RNA進行逆轉錄反應，然后取1 μl的cDNA進行30循環的PCR。引物序列、退火溫度及所擴增基因片段長度見附表。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統掃描電泳條帶。

Western blot

ES細胞用0.25%胰蛋白酶消化后離心洗滌，應用維持培養體系貼壁再培養45分鐘后收集懸浮細胞并用PBS洗滌； EB按上述分化方法培養并收集。以上樣品加入細胞裂解液（BioRad）置冰上反復吹打裂解，煮沸5-10分鐘，10 000×g，4℃離心10分鐘，取上清，應用Pierce公司試劑盒(BCATM Protein Assay Kit)測蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶，0.1% tween20的TBS（TBST）封閉1小時， 用TBST洗膜，5分鐘，共3次。之后分別按說明書用一抗、二抗（Cell Signaling）孵育帶有目的蛋白的硝酸纖維素膜。按檢測試劑盒（Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate， Pierce）說明書檢測目的蛋白。

結

果

ES細胞分化過程中Ras下游的MAPK和PI3K通路發生活化

收取ES細胞及分化不同時間的EB進行Western blot的檢測，結果如圖1所示。ES細胞內MAPK通路的Erk1/2及PI3K下游的Akt處于高水平磷酸化狀態，可能是由于維持培養過程中加入的LIF可以激活這兩條通路所致［3］。而分化第6天的EB內Erk1/2及Akt的磷酸化水平同前一時間點相比有顯著升高。與此相對應，永久造血分化在第6天時發生。以上結果提示，作為上游信號的Ras可能通過活化這兩條通路參與調控ES細胞的造血分化。

Figure 1. Activation of Erk1/2 and Akt during EB differentiation. ES and EB cells harvested at the indicated time points were subjected to Western blot.

RasN17在ES細胞內的表達下調MAPK(Erk1/2)及Akt的磷酸化水平

RasN17屬于HRas，其第17位的Ser被突變成Asp，它的表達可使細胞內源性Ras失活，從而阻斷Ras參與的信號通路的活化，起到與基因敲除類似的效應。應用Lipofectamine2000將質粒pCMVRasN17及pCMV轉染CCE，經G418篩選后Neo基因的表達及Ras蛋白表達量的上調標志轉染成功(圖2A、 B)。Nanog和Oct4的表達是ES細胞處于未分化狀態的兩個重要標志，這兩個基因的表達說明RasN17不影響ES細胞的維持培養(圖2A)。ES細胞的克隆形態也不受RasN17的影響(圖3A，D，G)，ALP是ES細胞處于未分化狀態的另外一個標志，它的表達同樣說明RasN17不影響ES細胞的維持培養（圖3B，E，H）。如圖2B所示，轉染RasN17后ES細胞內Erk1/2 及Akt的磷酸化水平同時降低，說明其能夠同時抑制MAPK及PI3K兩條通路的活化。

RasN17表達下調ES細胞分化過程中造血相關基因的表達水平

提取分化7天的EB細胞總RNA進行半定量RTPCR，結果顯示：轉染RasN17的ES細胞在形成的EB的分化過程中，Runx1、scl基因、betamajor珠蛋白的表達下調(圖4)， 而Flk1的表達沒有明顯變化?？梢?，RasN17可以下調ES細胞造血分化過程中某些相關轉錄因子及分化標記的表達，提示Ras通路的活化為ES細胞正常造血分化所必需。

討

論

Ras下游信號通路包括MAPK（Erk1/2）及PI3K通路等。Ras活化后可以通過激活其下游不同的信號通路來調節ES細胞自我更新與分化［2］。Erk1/2的活化促進小鼠ES細胞的分化并且是ES細胞分化所必需的［2］，當Erk1/2的活化被阻斷后，小鼠ES細胞在體外分化過程中不能形成中胚層及胚外內胚層，則ES細胞不能形成正常的EB［4，5］。PI3K通路的活化不僅為ES細胞體外培養過程中全能性的維持所必需［3］，同時也是ES細胞正常分化所必需的。例如， bFGF激活的PI3K通路參與ES細胞向EB分化過程中中胚層的形成［6］。此外，PI3K通路的活化參與調控小鼠胚胎發育過程中的永久造血分化，當將該通路上游的p85α基因敲除后，小鼠胎肝紅系造血發生缺陷［7］。由此可見，Ras可通過調控多條信號通路來影響ES細胞體外正常分化及小鼠胚胎的正常發育。

ES細胞體外可以分化產生各系造血細胞，其造血分化過程可以模擬并重現小鼠胚胎造血發育。ES細胞造血分化過程伴隨諸多造血相關轉錄因子及蛋白的表達，這些因子的表達既可作為造血分化的標志同時又是正常造血分化所必需的。其中，Runx1是一種與DNA結合的轉錄因子，其表達是小鼠胚胎造血發育過程中永久造血開始的標志之一。runx1-/-小鼠胚胎的永久造血缺失［8］；runx1基因的丟失同樣可以阻斷ES細胞體外分化過程中永久造血細胞的產生［8，9］。scl（stem cell leukemia）基因在小鼠胚胎發育過程中為中胚層向造血細胞分化所必需。該基因缺失可導致胚胎由于造血分化異常而死亡，scl 基因缺失后ES細胞不能進行造血分化［10］。betamajor 珠蛋白是永久紅細胞的標志。Flk1是VEGF的受體之一，在小鼠胚胎發育早期的中胚層細胞開始表達，其缺失導致胚胎發育過程中卵黃囊血島不能形成，同時血管系統的發育出現異常［11］。我們的結果顯示，RasN17可以下調ES細胞造血分化過程中Runx1、 scl及betamajor珠蛋白的表達，這表明Ras通路的活化是ES細胞造血分化所必需的。

與以往報道RasN17只阻斷Erk1/2通路［5］不同，本研究中轉染RasN17的ES細胞內Erk1/2及Akt磷酸化水平同時降低的結果表明：RasN17可能通過同時阻斷MAPK(Erk1/2)和PI3K兩條通路的活化影響ES細胞的造血分化。

本研究中，RasN17可能通過以下機制下調EB細胞內造血標志的表達：第一，使ES細胞不能形成正常的EB，則造血分化缺乏合適的微環境而發生缺陷；第二，MAPK(Erk1/2)和Akt信號通路的抑制直接影響造血細胞的產生；第三，以上兩種機制同時存在。然而，RasN17抑制ES細胞造血分化的具體機制有待進一步明確。

【參考文獻】

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胚胎干細胞范文第4篇

【關鍵詞】  人參皂苷rg1;胚胎神經干細胞;增殖

effects of ginsenoside rg1 on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro zhou zhi-huan, wang xiu-yun, zhong pei-ru, et al (tianjin university of tcm, tianjin 300193, china)

abstract：objective to explore the effect of ginsenoside rg1 on proliferation of neural stem cells (nscs) in vitro. methods the nscs cultures were generated from the brain of embryonic day 16 sd rat. primitive nscs were cultured, proliferated and passaged. the nscs were identified by the immunocytochemical (icc) staining of nestin. the icc staining of brdu was adopted to characterize the proliferation of nscs. according to limited dilution method, the effect of ginsenoside rg1 on the proliferation of nscs was observed. results the nscs were successfully cultured and proliferated in vitro. different dosages (100, 4, 8 μmol/l) of ginsenoside rg1 could promote the proliferation of nscs in vitro. compared with the control group, the numbers of nerurospheres of the three dosage ginsenoside rg1 groups (40, 4, 0.4 μmol/l) were increased obviously. conclusions ginsenoside rg1 significantly promote the proliferation of nscs in vitro.

key words：ginsenoside rg1;embryonic neural stem cells;proliferation

神經干細胞(neural stem cell,nscs)具有自我更新能力和多向分化潛能[1],在神經系統疾病或損傷的修復中起著重要的作用。研究調節nscs增殖分化的影響因素,誘導其增殖和定向分化為中樞神經系統損傷修復和退行性變的治療帶來了希望。因此,nscs的體外培養、增殖、誘導定向分化的研究已成為神經科學的一個研究熱點。本研究對體外培養胎鼠nscs進行增殖鑒定,觀察了人參皂苷rg1對nscs增殖能力的影響,為開發對nscs具有保護效能的治療藥物、探索神經系統疾病新的治療方法打下基礎。

1 材料與方法

1.1 培養基、試劑及藥物

dmem/f12(1∶1)培養基(lot.no atb31223,hyclone,u.s.a);hbss液(無鈣離子和鎂離子,lot.no 01118197,lonza,u.s.a);b27添加物(lot.no 311624,gibco/invitrogen);青霉素-鏈霉素溶液(雙抗,100×)(每毫升含有10 000 u青霉素以及10 mg鏈霉素,cat.no p4333,sigma);重組人堿性成纖維細胞生長因子(bfgf,cat.no cyt-218,prospec-tany,israel);人表皮生長因子(egf)(lot.no 3860501000,strathmann biotec,germany);人參皂苷rg1、丹酚酸b(天津中一制藥)。

1.2 大鼠胎鼠神經干細胞原代培養及傳代

取孕齡16天孕鼠,脫臼處死,75%乙醇浸泡消毒3～5 min,無菌條件下打開腹腔,取出串珠狀子宮,浸泡于冷hbss液中。取出胎鼠,置于另一含有冷hbss液的培養皿內,小心剝離外層骨膜,取出大腦皮質并去除軟腦膜,冷hbss液漂洗2次后,轉移至離心管。加入一定量冷hbss液后吹打至肉眼看不到明顯組織塊,使液體呈均勻懸濁狀。過200目(70 μm)篩網,1 000 r/min離心8 min,棄上清,全培基(含2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/legf的dmem/f12,1%雙抗)重懸,約3～4個胎鼠/75 cm2的密度種入培養瓶中,37 ℃、5%co2培養箱中培養。每2～3 d半量換液,收集培養液到50 ml離心管中,靜置3～5 min,然后收集上清(管底約留1～2 ml)轉入另一離心管,500 r/min離心3 min。棄約一半上清液,補充入相同量的新鮮的全培基(含1%雙抗, 2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/l egf的dmem/f12),重懸種置。

約5～9 d傳代1次。500 r/min 離心3 min,收集培養的神經球,沉淀細胞用1 ml全培基重懸,用23號(內徑0.65 mm)注射器輕輕吹打5次,避免產生氣泡,靜置3～5 min使未吹散的細胞沉底。收集上清,管底的細胞再加1 ml繼續吹打5～8次,收集細胞補加全培基,以1×105個/ml的密度全培基重懸種入培養瓶或培養板。

1.3 神經干細胞及增殖鑒定

采用abc法進行nestin免疫組化染色鑒定nscs。染色步驟：蓋玻片放入6孔板內,每孔加多聚賴氨酸處理60 min;將細胞懸液接種于多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的6孔板內,貼壁生長2 h;4%多聚甲醛固定20 min;3%h2o2 37 ℃,30 min;加入封閉血清,37 ℃孵育30 min;甩去余液;滴加anti-nestin抗體(陰性對照不滴加一抗),4 ℃過夜;滴加生物素標記的二抗,37 ℃孵育30 min;滴加abc復合物,室溫孵育30 min;滴加dab顯色2 min;50%甘油封片,顯微鏡下觀察照相。

用brdu標記nscs進行增殖能力的鑒定。染色步驟：蓋玻片放入6孔板內,每孔加多聚賴氨酸處理60 min;將細胞懸液接種于含多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的6孔板內,貼壁生長2 h;4%多聚甲醛固定20 min;0.3%h2o2 37 ℃,30 min;2 mol/l hcl,37 ℃變性30 min;0.1 mol/l硼酸中和2次,每次10 min;加入封閉血清,37 ℃孵育15 min,甩去余液;滴加單克隆anti-brdu抗體(陰性對照不滴加一抗),4 ℃過夜;滴加生物素標記的二抗,37 ℃孵育1 h;滴加abc復合物,室溫孵育30 min;滴加dab顯色2 min;50%甘油封片,顯微鏡下觀察照相。

1.4 稀釋法篩選人參皂苷rg1對體外培養胚胎神經干細胞增殖作用

將nscs克隆球制成1×105個/ml的細胞懸液,將該細胞懸液稀釋240倍,加入不同劑量的中藥(人參皂苷rg1)種入2個24孔板,每組4孔。第一板實驗分組為：對照組、丹酚酸b組(0.035 μmol/l)、人參皂苷rg1組(濃度分別為100、20、4、0.8 μmol/l);第二板的實驗分組為對照組、丹酚酸b組(0.035 μmol/l)、人參皂苷rg1組(濃度分別為10、2、0.4、0.08 μmol/l)。常規培養4 d后對神經球進行計數(包含細胞≥5)。

1.5 稀釋法檢測人參皂苷rg1對體外培養胚胎神經干細胞增殖作用

將nscs克隆球制成1×105個/ml的細胞懸液,將該細胞懸液稀釋240倍,加入不同劑量的中藥(人參皂苷rg1)種入24孔板,共5組,每組4孔。實驗分組為對照組、丹酚酸b組(0.035 μmol/l)、人參皂苷rg1組(濃度分別為40、4、0.4 μmol/l)。常規培養4 d后對神經球進行計數(包含細胞≥5)。

1.6 統計學方法

實驗數據用x±s表示,采用spss11.5統計軟件作方差分析,進行組間比較。

2 結果

2.1 神經干細胞培養鑒定及增殖鑒定

對傳代nscs進行nestin染色,細胞胞漿呈棕黃色,為陽性(細胞陰性對照則不被黃染),表明本實驗所培養細胞為nscs。對傳代nscs進行brdu標記后染色,與brdu陰性對照比較, nscs細胞核被黃染,表明經傳代后nscs依然具有體外分裂增殖能力。nscs鑒定結果見圖1。

nestin普通染色(陽性) nestin普通染色(陰性對照)

brdu普通染色(陽性) brdu普通染色(陰性對照)

圖1 nscs增殖鑒定

2.2 人參皂苷rg1對體外培養胚胎神經干細胞增殖作用的劑量篩選(見表1、表2)

與對照組相比,人參皂苷rg1 4 μmol/l以及0.8 μmol/l組神經球數明顯增加,差異有統計學意義(p<0.01);人參皂苷rg1 100 μmol/l組神經球數明顯增加,差異有統計學意義(p<0.05);其他劑量組神經球生成數目沒有明顯改變。通過實驗結果分析,擬選定人參皂苷rg1 40、4、0.4 μmol/l作為高、中、低劑量進行進一步實驗研究,重復3次。表1 人參皂苷rg1對神經球生成數目影響的劑量篩選(第一板)表2 人參皂苷rg1對神經球生成數目影響的劑量篩選(第二板)

2.3 不同劑量人參皂苷rg1對體外培養胚胎神經干細胞增殖作用的影響(見表3)表3 不同劑量人參皂苷rg1對神經球生成數目的影響(x±s)

第1次實驗結果顯示,與對照組相比,人參皂苷rg1中、低劑量組神經球數生成數目明顯增加,差異有統計學意義(p<0.01)。第2次實驗結果顯示,與對照組相比,人參皂苷rg1高、中劑量組神經球生成數目明顯增加,經統計學分析,差異有統計學意義(p<0.05),人參皂苷rg1低劑量組神經球生成數目明顯增加,差異有統計學意義(p<0.01)。第3次實驗結果顯示,與對照組相比,人參皂苷rg1高、中、低劑量組神經球生成數目明顯增加,差異有統計學意義(p<0.01)。

3次實驗結果綜合分析表明,人參皂苷rg1可以明顯增加神經球生成數目,具有促進胚胎神經干細胞體外增殖的作用,其中以低劑量(0.4 μmol/l)作用更為顯著(均p<0.01)。

3 討論

nscs具有在成體中樞神經系統中可分化為神經元的能力,改變了以往神經科學的固有觀念,在臨床和神經醫學領域受到了普遍關注。nsc培養體系的建立和完善,使nsc增殖、分化以及遷移得以迅速發展。目前,對nscs的增殖研究國內外大部分集中于細胞因子對nscs的影響,利用傳統中藥內源性誘導nscs研究較少。中藥的神經保護作用廣泛且具有機制的多樣性,因此,應用中藥誘導nscs的增殖,促進神經再生和神經功能的修復與重建,可望為中藥治療缺血性腦損傷開辟全新的治療途徑。

人參是傳統的補氣中藥,人參在許多神經系統疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、周圍神經損傷的治療中,發揮著積極的作用[2]。人參皂苷rg1是人參活性成分中已提純的單體成分,是人參中主要活性成分之一。人參皂苷rg1主要藥理作用為改善微循環、提高組織抗缺氧能力,具有ca2+拮抗作用、抗疲勞作用,改善學習記憶技能,促進dna、rna和蛋白質合成作用,對中樞神經有興奮作用。rg1因亦存在于三七當中,故其活血消瘀、改善循環、抑制血小板聚集的作用也很明顯[3]。

本研究選取補氣健腦生藥提取成分人參皂苷rg1,考察其對nscs增殖的誘導作用機制。通過體外培養大鼠胚胎nscs,免疫組化法進行nscs的鑒定及增殖鑒定,表明本試驗所培養細胞為nscs,對傳代nscs進行brdu標記后染色,與brdu陰性對照比較,nscs細胞核被黃染,表明經傳代后nscs依然具有體外分裂增殖能力。本研究證實了具有補氣健腦作用的中藥有效成分人參皂苷rg1可以作用于nscs,對nscs的增殖有明顯的誘導促進作用。人參皂苷rg1高、中、低劑量均明顯增加神經球的生成數目,以低劑量作用更為顯著。表明臨床可預期應用以補氣為主的人參皂苷rg1誘導nscs的增殖和定向分化,為許多疑難腦病的治療提供新的選擇。

【參考文獻】

  　[1] gage fh. mammalian neural stem cells[j]. science,2000,287：1433.

胚胎干細胞范文第5篇

轉變的信號

全能分化的干細胞無疑對于人類是一件很大的幸事，因為干細胞在治療白血病、癌癥、白癜風、心臟病、帕金森氏綜合征、糖尿病、皮膚燒傷、老年性癡呆等人類許多頑癥方面都有不可替代的重大作用。在上個世紀末的1999年，美國《科學》雜志甚至把干細胞研究評為21世紀10項重要的研究領域之首，而且位居人類基因組計劃之上。

但是，干細胞研究一直被倫理困擾。因為，要獲得全能分化的干細胞似乎非胚胎干細胞莫屬。而從胚胎中提取干細胞又為世界多數國家的倫理和文化所不容。美國雖然引領著世界科技的潮流，但在干細胞研究上被倫理卡得最死。這體現在總統布什兩次否決議會的推進和批準干細胞的議案。

布什于2006年7月19日首次否決了支持胚胎干細胞研究的法案，理由是這項法案支持利用無辜的人類生命為其他人牟取醫學利益，謀殺(胚胎)是錯誤的。為了科研目的，給予生命，又讓它死去，這是讓人無法接受的。2007年6月20日，布什再次否決了國會提交的放寬聯邦政府資助胚胎干細胞研究的法案，理由始終如一：這樣的法案一旦通過并變成法律，美國納稅人的錢就會“被迫用于故意摧毀人類胚胎”，而這是他本人“不能跨越的道德底線”。

與其說這是布什的底線，倒不如說是人類倫理底線的一種反映，因為相當多的人認同布什的這一觀點。于是，研究人員開始尋找其他途徑。最先尋求突破的是在世界上首先創造出克隆羊多利的科學家威爾穆特。

2007年11月17日威爾穆特公開宣布不再進行細胞核轉移研究。他認為，利用日本科學家的新技術可以在5年內提供一種更好的、倫理上更能被接受的醫用克隆胚胎。所謂新技術指的就是日本京都大學山中伸彌教授等人研究的一種將體細胞進行基因改造而成為類似干細胞的技術，這種技術已在實驗鼠身上做過試驗。

威爾穆特認為，將體細胞轉成千細胞的新技術是今后治療疑難病癥的關鍵技術，比使用胚胎干細胞更具潛在優勢。

條條道路通羅馬

威爾穆特的決定并非只是因為年底得知日本研究人員的研究結果才改弦易轍的，早在2007年1月和6月，干細胞研究的轉身動作就基本成形，效果不錯。

2007年1月7日，美國的德?科皮等人就宣布，從羊水中可以分離出多能干細胞(能分化為多種類型的干細胞)。這一發現似乎是繼胚胎干細胞和成體干細胞之外的另一種獲取干細胞的途徑。羊水干細胞能激活人體內已知的220種專有干細胞中的絕大多數干細胞，讓這些干細胞發揮作用。而且，羊水干細胞比較容易取得，可以通過產前例行的羊水診斷取得足量的羊水；另外還可在產婦生完孩子后取得。例如，現在美國每年就會有400萬嬰兒降生，中國每年有更多的嬰兒誕生。同時，羊水干細胞不僅容易獲取，還能避開倫理的爭議，也就有了比較廣泛的研究和醫療應用前景。

而在2007年6月美日三個研究小組就成功地把老鼠皮膚細胞改造成類似胚胎干細胞的細胞。這實際上已經為把人的皮膚細胞轉成干細胞奠定了基礎。因此，將人體皮膚細胞改造成幾乎與胚胎干細胞具有同樣功能的干細胞便是順理成章的事。

2007年11月20日，美國和日本的兩個科學小組同時宣布，他們成功地將人體皮膚細胞改造成了幾乎可以和胚胎干細胞媲美的干細胞。美國威斯康星大學詹姆斯?湯姆森等人的研究發表在《科學》雜志，而日本京都大學教授山中伸彌領導的研究小組把報告發表在《細胞》雜志。兩個研究小組都借助逆轉錄病毒為載體向皮膚細胞中植入一組4個基因，通過基因重新編碼，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。而被改造過的細胞被稱作“誘導性多能干細胞”(iPS細胞)

湯姆森領導的小組，從自己獨自確定的14種新的候選重組基因中，最終選擇出4個基因，實現了在人體細胞內的基因重組，其中前兩個基因與山中伸彌小組是相同的，即0CT3和SOX2，而另兩個基因是NANOG和LIN28。不過，湯姆森等人利用的是胎兒皮膚細胞以及一個新生兒的包皮細胞。與日本研究人員相比，湯姆森等人這項研究需要1萬個細胞才能分離出1個iPS細胞系。湯姆森認為，雖然這一個iPS細胞系比日本研究人員的少，但從一個單獨的實驗足以創造出幾個iPS細胞系。值得一提的是，湯姆森實驗室iPS研究組的主要成員中有華裔女科學家俞君英。

而日本京都太學的山中伸彌小組使用逆轉錄病毒把4種基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和K1f4轉移到人的成體細胞中，而這些基因在以前對小鼠實驗就獲得成功，把小鼠的成體細胞轉化為了iPS細胞。這一次他們實現了在人體細胞內的基因重組并把成體細胞轉變為iPS細胞。成體細胞分別來自一位36歲婦女的表皮和一位69歲男性的結締組織。相比之下，日本研究人員的成體細胞轉化為iPS細胞的效率更高一些。因為，利用他們的技術，大約每5000個細胞就能制造1個iPS細胞系，這種高效能保證他們在每項實驗中都能得到數個iPS細胞系。

iPS細胞成果擴大

干細胞研究的漂亮轉身并不僅限于把人的成體細胞轉變為iPS細胞，在此之后和之前，還有一些干細胞研究的出色成果。

緊接著皮膚細胞轉為干細胞后，美國馬薩諸塞州懷德海特生物醫學研究所的雅各布?漢納等人用皮膚干細胞對小鼠實驗治療鐮狀細胞貧血，獲得初步成功。研究人員首先從患有鐮狀細胞貧血癥的老鼠尾部提取細胞。隨后在提取的患病細胞中植入4個基因，使細胞基因重新編排，變成具備胚胎干細胞功能的皮膚干細胞。通過在實驗室中進一步誘導分化，研究人員把這些皮膚干細胞培養為成血細胞，以彌補引發鐮狀細胞貧血癥的基因缺陷，并把成血細胞注入病鼠體內。結果顯示，這些病鼠血液和腎功能都開始恢復正常。接受干細胞治療的患病老鼠，在一個星期內就幾乎完全痊愈。

鐮型貧血癥是由基因突變導致的遺傳性血液疾病。異常的血紅蛋白聚合，使紅細胞呈現鐮刀狀，降低紅細胞攜帶氧氣的能力。由于血紅蛋白不正常，從而產生供血供氧不足，導致患者貧弱，呼吸困難，也可能出現周期性的劇烈疼痛感，甚至腎臟也會受損，提早死亡。骨髓移植能夠治療這種疾病，但也可能引發

致命的排斥反應。

而醫學界首次采用源自患病體自身細胞組織的千細胞來治療這種遺傳疾病，成功回避了利用外來血液或細胞組織可能產生的移植排斥反應。同時，把老鼠尾部細胞轉變成干細胞，也避免了采用胚胎干細胞進行治療的倫理爭議。這意味著，人類鐮型貧血病的治療指日可待。

但是，如果要在人身上試用這種干細胞技術必須解決載體的安全問題。對小鼠的實驗是用逆轉錄病毒作載體，把特殊的基因導入小鼠的皮膚細胞中，然后讓皮膚細胞轉變成iPS細胞，而這種細胞與胚胎干細胞幾乎完全相同，能生成200多種細胞。在實驗中是用化學物質使這些iPS細胞長成健康的血液干細胞，并把血液干細胞移植到老鼠的骨髓中，使老鼠體內健康的紅細胞不斷增加，最后治愈鐮型貧血。

但是，如果進行人體實驗治療，現在還不能保證逆轉錄病毒這種載體對人是安全的，經過誘導的iPS細胞也有可能轉變成癌細胞。如何解決載體物質是下一步要解決的問題。但已經有研究人員提出，可以用脂肪分子來代替逆轉錄病毒，把特殊基因帶進需要改造的細胞中，誘導它們成為iPS細胞。

干細胞轉身之后的兵分兩路

目前，可以把干細胞研究分為兩大類，一類是利用胚胎提取和創造干細胞，無論是人胚胎，還是人畜、混合的胚胎，以及靈長類的胚胎：另一種就是對成體細胞加以轉基因誘導，使其轉變為干細胞，即iPS細胞。

與胚胎干細胞相比，iPS細胞當然在效率上占了優勢。例如，2007年11月22日，美國俄勒岡國家靈長類研究中心舒克拉特?米塔利波夫及同事在英國《自然》雜志上報道他們成功地克隆出恒河猴胚胎，并提取出胚胎干細胞。這個成果表明人類在克隆人類胚胎的道路上邁出了更為重要一步。但是，這種途徑與iPS細胞相比可以說效率十分低下，而且遭遇倫理困境。米塔利波夫從14只母猴那里搜集了304個卵細胞。最終才獲得了兩個胚胎干細胞系。這意味著，其成功率只有可憐的0.7％。

因此，克隆先驅威爾穆特表示，“考慮到這么低的效率，你會懷疑，需要多長時間，細胞核轉移技術才能培育出有用的生命?！毕啾戎?，日本京都太學教授山中伸彌采用的體細胞克隆技術要“有意思100倍”。對胚胎干細胞持否定態度的美國政府也由衷地對iPS細胞的成功表示了贊美。2007年11月20日，美國白宮就此項研究發表聲明，稱“這是一項在符合倫理的研究中取得的重大進展。這次人體皮膚細胞‘直接改造’技術跨越倫理障礙，令在實驗室中培育出人造人體器官的夢想更近了一步。布什總統也為此感到高興”所以，美國政府認為這才是干細胞研究的“正道”。

但是，這是否意味著iPS細胞就會從此成為主流并一花獨秀呢?當然，情況并非如此。就連成功地用iPS細胞治療小鼠鐮型貧血的漢納也表示，在繼續深化iPS細胞研究的同時，應繼續胚胎干細胞研究，兵分兩路或多點開花也許能更早出成果。因為iPS細胞尚不能完全取代胚胎細胞克隆技術。而且，很多研究人員認為，iPS細胞實際上還只是干細胞研究的一個分支。

對這個問題的解讀是，盡管iPS細胞是一個漂亮的轉身，但其自身仍存在不少問題，需要數年時間才可能把這項技術安全應用于臨床。其一，iPS細胞現階段的實驗方式存在潛在副作用。研究所使用的逆轉錄病毒載體可能使基因產生變異，引發腫瘤。因此，需要評估其安全性，并采用新的方法。

其二，盡管iPS細胞沒有胚胎干細胞那樣的倫理爭論和阻力，但它也可能產生新的倫理問題。例如，應用這項技術，或許能通過皮膚細胞制造和卵子，可以幫助那些有生育問題的患者。但也會出現濫用問題，因此有必要在制造和利用人體干細胞方面做出適當規范。

胚胎干細胞也不示弱

盡管胚胎干細胞存在很大的倫理困境，但這一領域的研究成果同樣精彩。有一些已經進入臨床治療實驗。