核酸檢測方法

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核酸檢測方法范文第1篇

關鍵詞 λ核酸外切酶；G-四鏈體/血紅素DNA酶；化學發光；DNA

1 引 言

DNA是生物體遺傳信息的載體[1]，構建快速、靈敏、高選擇性的生物分析新方法用于低豐度的DNA序列的檢測在臨床診斷、基因篩選、食品和環境監測、國土安全等方面起著至關重要的作用[2，3]。近年來，信號放大已經成為提高DNA檢測靈敏度的重要手段，如采用納米材料作為信號放大的標記物、采用聚合酶鏈反應（PCR）或者滾環擴增（RCA）等核酸擴增技術等。雖然這些方法大大提高了檢測的靈敏度，但是也存在操作繁瑣、費時、價格昂貴、易出現假陽性信號等缺陷[4，5]。使用限制性內切酶進行信號放大的方法，較以往的信號放大方法更為簡單、快速，但是由于限制性內切酶只能針對特定的DNA序列，在實際應用中存在一定的局限性[6，7]。因此，發展快速、靈敏的DNA測定新方法具有重要的理論和實際意義[8]。

λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）是一種高持續性核酸外切酶，能夠催化雙鏈DNA分子自5′磷酸末端3′方向逐步水解，并釋放出5′-單核苷酸，進而將雙鏈DNA變成單鏈DNA[9，10]。λexo在核酸重組、復制、分型、基因修復以及分子克隆等方面起著至關重要的作用，已成為研究基因組成、功能及表達的重要工具之一。此外，許多研究者將λexo的獨特性質應用于核酸探針的信號放大技術，以實現核酸、蛋白質等生物分子的超靈敏檢測[11～14]。但是這些方法大多需要對核酸探針進行熒光標記，過程復雜且成本較高。

G-四鏈體/血紅素 DNA酶（G-Quadruplexes/hemin DNAzyme）是一種具有催化性能的人工模擬酶，由富含鳥嘌呤堿基的核酸分子與血紅素結合，形成穩定的G-四鏈體結構，表現出類似于辣根過氧化物酶的活性，能夠催化H2O2氧化2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）產生顏色變化或者催化H2O2氧化魯米諾（Luminol）產生化學發光[15～17]，在生化分析領域已經引起研究者的廣泛關注[18]。

化學發光（Chemiluminescence， CL）分析由于不需要激發光源，避免了背景光和雜散光的干擾，大大提高了信噪比，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、儀器設備簡單等優勢，目前已廣泛應用于免疫分析、臨床檢驗、環境檢測、物質分析等領域[19～22]。本研究采用3條核酸鏈構建DNA夾心結構，使用λexo進行目標DNA的輔助放大，建立了新型化學發光傳感器，成功實現了DNA檢測。本方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性好等優勢，可用于實際樣品分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LS-55型發光光度計（美國Perkin-Elmer公司）；PHSJ-4A型pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

所有DN段均由上海生工生物有限公司提供（序列見表1）。Luminol、H2O2（國藥上海試劑公司）；血紅素（Hemin）、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）購于美國Sigma公司；λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）、10×λexo反應緩沖液（0.67 mol/L Glycine-KOH（pH 9.4，25℃），0.02 mol/L MgCl2，500 μg/mL BSA）購于美國New England Biolabs公司。其它試劑均為國產分析純，實驗用水為18.2 MΩ?cm的超純水。2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH緩沖液（pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0），含0.05%（w/V）Triton X-100，1%（V/V）DMSO，2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl。

2.2 實驗方法

2.2.1 DNA的檢測 將濃度均為1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同濃度的Target DNA在95℃下加熱10 min，再自然冷卻到室溫。

取出20 μL不同濃度的Target DNA與10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA，在37℃雜交2 h；雜交完成后，加入5 μL λexo （2 U/μL）及5 μL 10 × λexo反應緩沖液，在37℃下溫育30 min。隨后，將上述混合溶液加熱到75℃，保持10 min，再冷卻至37℃，孵育1 h；加入10 μL Hairpin DNA，在37℃孵育30 min，再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin（終濃度為2.0×107 mol/L）及820 μL HEPES-NH4OH緩沖溶液，充分混勻后，在室溫下孵育1 h，保證Hemin與打開的Hhairpin DNA充分反應，形成穩定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結構。最后，依次將50 μL Luminol（終濃度為1.0×103 mol/L）、50 μL H2O2（終濃度為3.0×102 mol/L）加入到上述溶液中，在室溫下立即測量樣品的CL光譜。

2.2.2 化學發光測定

CL測量均使用光程為1 cm的比色池。電壓設置為800 V，狹縫寬度設為15 nm，掃描速度為1200 nm/min，測量時關掉LS-55型發光光度計的氙燈，測定樣品溶液在425 nm處的相對化學發光強度ΔI（ΔI=I-I0， I0為無Target DNA存在時Luminol的化學發光強度， I為不同濃度的Target DNA存在時Luminol的化學發光強度）。每個樣品均平行測定3次。

3 結果與討論

3.1 實驗原理

實驗原理如圖1所示，本體系包括4種DNA：Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA。首先，Phosphate-DNA與AuxiliaryDNA及Target DNA進行雜交，形成DNA的復合結構。隨后向溶液中加入λexo，由于λexo可作用于5′磷酸化的雙鏈DNA分子，并沿5′-3′方向漸進性催化去除5′單核苷酸，破壞雙鏈DNA結構，同時釋放出Auxiliary DNA及Target DNA。釋放出的Target DNA可以繼續進入下一輪循環，不斷產生大量Auxiliary DNA，而Auxiliary DNA可以將Hairpin DNA的莖環結構打開，打開的Hairpin DNA在血紅素存在的條件下，可以形成穩定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme結構，表現出類似于過氧化物酶的活性，能夠催化H2O2氧化Luminol產生化學發光，并且Luminol產生的相對化學發光強度與目標DNA的濃度在一定范圍內成比例，從而可以實現Target DNA的定量分析檢測。

3.2 可行性研究

不同條件下的化學發光光譜（圖2） 表明，單獨的Hemin化學發光強度十分微弱（曲線a）；不加入Target DNA（曲線b）， 或者不加入λexo（曲線c）的情況下，體系的化學發光強度也較弱； 圖2 不同體系的化學發光光譜

Fig.2 CL spectra of hemin （a）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin （b）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin （c） and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin （d and e）. Experimental conditions： 1.0×107 mol/L phosphate-DNA， 1.0×107 mol/L auxiliary DNA， 1.0×107 mol/L hairpin DNA， 5.0×1012 mol/L target DNA（curve d） and 8.0×109 mol/L target DNA（curve c and e）， 2.0×107 mol/L hemin， 10 units lambda exonuclease （λexo）， 1.0×103 mol/L Luminol， 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后，體系的化學發光強度增加，且Target DNA濃度越高，發光強度越高（曲線d和e）。化學發光強度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端，釋放Target DNA，并不斷進入下一循環，產生大量的Auxiliary DNA，可以與Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結構。上述結果表明，本方法可用于Target DNA檢測。

3.3 測定條件的優化

3.3.1 λexo用量對體系化學發光強度的影響 由于λexo用量直接影響目標DNA的循環效果，進而影響檢測體系的化學發光信號的強弱，因此實驗首先考察了λexo用量對體系化學發光強度的影響（圖3），結果表明，體系的化學發光強度隨著λexo用量的增加而逐漸增強，并且當λexo的用量達到10 units 時，體系的化學發光強度趨于穩定。因此，實驗將λexo的最佳用量定為10 units。

3.3.2 pH值對體系化學發光強度的影響 由于體系的化學發光強度與緩沖介質的pH值之間存在一定關系[6，16]，因此考察了不同pH條件對體系化學發光強度的影響。實驗結果如圖4所示，所用HEPES-NH4OH緩沖溶液使體系pH值從7.4逐漸增加到9.0時，體系的化學發光強度逐漸增強，且在pH=9.0時達到最大值；之后繼續增大pH值，體系的化學發光強度逐漸減弱。最終選擇pH=9.0的HEPES-NH4OH緩沖溶液作為最佳緩沖條件。

3.3.3 Luminol濃度對體系發光強度的影響 作為化學發光的底物，Luminol的濃度強烈影響體系的化學發光強度。本研究考察了不同濃度的Luminol對體系化學發光強度的影響，實驗結果如圖5所示。在0.4～1.0 mmol/L的濃度范圍內，隨著Luminol濃度的增加，體系的化學發光強度逐漸增強，且在Luminol濃度為1.0×103 mol/L時，發光強度達到最大值；之后繼續增大Luminol的濃度，體系的化學發光強度反而呈現下降趨勢。因此選擇Luminol的最佳濃度為1.0 mmol/L。

3.3.4 H2O2濃度對體系化學發光強度的影響 考察了化學發光的氧化試劑H2O2的濃度對體系化學發光強度的影響示。從圖6可見，H2O2濃度在5.0～30 mmol/L范圍內，隨著H2O2濃度增加，體系的化學發光強度逐漸增強；當H2O2濃度在30～50 mmol/L時，體系的化學發光強度逐漸減弱。為了獲得較大的化學發光強度，實驗選擇H2O2的最佳濃度為30 mmol/L。

3.4 靈敏度的考察

在優化的實驗條件下，測定目標 DNA濃度與體系的化學發光強度之間的關系（圖7和圖8）。從圖7可見， Luminol的化學發光強度隨著目標DNA濃度的增加而不斷增強，并且Luminol的相對化學發光強度ΔI與目標DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L濃度范圍內呈現良好的線性關系（圖8），檢出限為0.7×1013 mol/L（3σ）。與文獻報道的方法比較（表2）可見，本方法的靈敏度優于文獻報道的光學檢測方法， 或與之相當。

3.5 特異性的考察

為考察所建立方法的特異性，選擇濃度均為8.0×108 mol/L的隨機序列DN段、單堿基錯配的DN段， 以及三堿基錯配的DN段作為對照樣品，與8.0×109 mol/L目標DNA進行分析比較。從圖9可見，僅有完全互補的目標DNA存在時，才能使體系的化學發光強度顯著增加；相比之下，其它幾種DNA的化學發光強度很低。結果表明，構建的化學發光傳感器具有很好的特異性，可以區分不同錯配的DNA序列。

3.6 實際樣品的測定

為了考察所建立的方法檢測復雜生物樣品的可行性，進行了人血清樣品中的標準添加實驗。人血清樣品稀釋100倍進行加標分析。從圖10可見，目標DNA在人血清樣品中的化學發光強度值與其在緩沖溶液中的化學發光強度值基本一致，表明通過樣品稀釋可以有效降低復雜樣品的基質的影響。結果表明，本方法在復雜生物樣品的分析方面具有潛在的應用價值。

4 結 論

本研究發展了一種基于λexo輔助放大和G-Quadruplexes/hemin DNAzyme催化放大的簡單、快速的傳感新方法，成功實現了目標DNA在緩沖溶液和復雜生物樣品中的高靈敏檢測。本方法具有獨特的優勢：與傳統的光學分析方法相比，本方法不需要標記任何發光基團，分析成本低；整個檢測過程都是在均相溶液中進行，無需經過洗滌、分離等繁瑣的操作步驟，簡單方便；本方法具有很高的靈敏度和特異性；本方法對目標DNA的檢測具有良好的通用性，通過改變Phosphate-DNA的堿基序列很容易應用于其它目標DNA的檢測，具有潛在的應用價值。

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核酸檢測方法范文第2篇

【關鍵詞】風資源 多尺度 數據融合 大型風電基地

1 引言

風力是風力發電的基礎，對風電場風資源分布的有效監測是風電場理論出力評估和預測準確性的保障。過往的風電場中簡單利用少量幾個測風塔監測整個風電場的風資源情況，在大型風電基地中會導致風電場群內部大部分區域的風資源情況與實際情況存在一定誤差，對風電場發電分析造成很大的影響。為解決上述問題，本文提出了風電場風資源多尺度立體監測網絡。

為更好地實現對大型風電基地的風資源監測，建立了基于測風塔、風機機頭監測系統及雷達的多尺度立體監測系統。

根據側風塔數據、風機機頭數據、雷達測量數據、地形數據、天氣數據等環境因素，利用多時空尺度的融合插值等算法，對大型風電基地整體風場進行模擬分析，構建環境因素在實際風機位置點的插值模型。風電基地監測環境構架如圖1所示。

2 并行多尺度數據融合

風資源多尺度立體監測系統是一個較簡單的分布式檢測系統，三種類別的監測節點使用不同的監測方法、原理和裝置，所以在集中分析之前會分別對三種類型的監測數據進行預處理，例如數據最優局部處理和融合處理等，以減小多尺度分布式監測系統的性能損失。

2.1 檢測級融合并行結構

并行結構分布式監測系統結構如圖2所示，當三種類型的監測節點收集到未經處理的原始數據，需在各自的分處理中心作出局部檢測判決等處理；最后，監測中心對所有集中后的數據進行融合處理，得到相應的全局數據。

2.2 基于并行結構的數據融合算法

在并行結構局部判決融合處理中，使用貝葉斯假設檢驗獲得極小化系統運行的平均代價R（Γ），其判決規則集合為Γ={γ0，γ1，L，γN}，其中γ0表示融合規則，γ0（g=1，2，L，N）代表局部檢測的判決規則。

新的融合估算值基于以前的融合估算以及新的測量值，小波變換被用來連接不同尺度之間的測量數據。該算法對于多尺度數據濾波融合是很有效的。

4 基于多尺度數據的Kriging插值方法

經多尺度數據融合處理，幾種采集時間間隔不同、范圍不同的數據被融合為相同時間、空間刻度上的數據，并得到插值方法所需要的風資源基礎數據。大型風電基地地形較為復雜，Kriging插值在該類三維空間插值分析中得到了廣泛的應用。

4.1 時空協方差函數

時空域隨機過程滿足二階平穩或固有假設時，其協方差函數可表示為：

式中，U（s，t）表示定義在時空域的隨機過程，且U（s，t）∈Rk×T，其中Rk表示k維的歐氏空間，T代表時間；（s，t）為時空場中任意監測節點的位置，s為監測節點空間中的距離，t為時間上的距離。

同時，對應的變差函數可表示為：

實際中多采用簡化的樣本變差函數，如式（10）所示：

4.2 Kriging插值

Kriging方法假定采樣點之間的距離和方向可以反映一些空間相關性，對周圍的測量值進行加權分析得出未測量位置的預測，與反距離權重法類似。Kriging插值是一種線性的無偏估計，并且要求估計誤差的方差最小。在風資源監測環境中，監測節點的空間位置是三維的，所以監測位置參數可表示為si={xi，yi，zi}，Kriging插值公式為：

式中，U*（s，t）為待測點（s，t）處的插值；λi為相應監測點的加權系數，當然應滿足∑λi=1，該參數的計算式為：

5 實驗結果

使用上述多尺度插值融合算法，基于某一時刻（2015年1月22日03時10分）雷達監測數據、風機機頭處監測數據和測風塔測量數據，對某一樣本風電場中的風速分布進行分析，整個風電場中的風速的分布情況如圖3所示。從整體上可以看出，風電場上游為強風速區，下游為弱風速區；同時在距離上游一定的距離處，風電場中心的風速明顯小于風電場邊緣兩側的風速，一般風速差能達到1-2m/s。

選取該時刻該風電場的風場數據對整個風電場中風機尾流效應造成的風速衰減現象進行分析。如圖4所示，對該時段整個風電場中所有風機的機頭風速從大到小的排列，結果顯示風速從上游風機機頭風速的8.5 m/s 衰減為下游的3.2 m/s，風速下降率為62.4%。

6 結論

風資源立體監測網絡使用多個尺度的監測數據對大型風電基地風資源進行監測，與過往單一的測風塔監測方法相比更能監測風電基地中風電群場內部細節處的風資源分布情況，使風資源監測的精度大大提高。

參考文獻

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作者簡介

蔣何（1992-），男，四川省人。碩士學位。研究方向為控制科學與工程。

核酸檢測方法范文第3篇

關鍵詞：絕緣子；憎水性；稀疏表示；圖像識別

中圖分類號：TM855 文獻標識碼：A

與傳統電瓷、玻璃絕緣子相比，復合絕緣子因其具有優異的耐污閃性能而在電力系統中被廣泛使用.復合絕緣子的憎水性和憎水遷移性是其具有較強耐污閃性能的基礎，然而其在運行中因受到紫外線、污穢、電磁場等條件的共同作用會出現老化現象，使得復合絕緣子憎水性下降，嚴重老化的絕緣子甚至會喪失其憎水性[1-2].因此有必要定期對運行中的復合絕緣子的憎水性進行檢測，及時更換憎水性不合格的絕緣子.目前現場測量復合絕緣子憎水性的方法主要為噴水分級法[3]，該方法將復合絕緣子憎水性分為HC1至HC7 7個等級，其操作簡單，對檢測設備要求低，但完全依賴于人的主觀判斷，容易引起檢測結果的不一致性.

目前，國內外一些學者提出了基于絕緣子憎水性圖像的智能檢測方法，文獻[4-5]采用圖像預處理去除噪聲和雜波，利用方向濾波、自適應濾波等方法提取圖像的水珠或者水跡邊緣，對水珠特征參數進行統計以后利用K鄰近算法進行模式識別，從而確定憎水性等級.這種方法克服了目測的主觀性，但是由于圖像分割處理中很容易出現過度分割或者欠分割現象而導致分割失敗，使得后續的特征值提取失準從而導致分類算法無法進行.如圖1所示為運用先進的水平集方法對去噪后憎水性圖像進行分割時，出現過分割和欠分割的現象.

本文采用稀疏表示分類算法（Sparse Representation Classification， SRC）對復合絕緣子憎水性圖像進行識別與分類.稀疏表示的算法是由Wright等于2009年提出應用于人臉識別領域中的算法[6].在該方法中一個測試樣本被所有訓練樣本稀疏線性表示，然后從中找出對測試樣本表示誤差最小的一類訓練樣本.這一研究為稀疏表示在圖像識別中的應用開辟了新的方向.本文運用稀疏表示分類算法對復合絕緣子憎水性圖像進行分類，通過對稀疏表示系數以及最小殘差的計算找出樣本庫中與測試圖像最接近的訓練圖像，從而判斷測試圖像所對應復合絕緣子的憎水性等級.

1稀疏表示算法

由于拍攝圖片光照條件、拍攝角度、拍攝距離等實際因素的影響，即使是同一等級的水珠圖像也會呈現出多種不同的效果，所以在選擇訓練樣本時，要綜合考慮各種水珠圖像所可能呈現的情況.以HC1級別的憎水性圖像為例，此時的復合絕緣子憎水性能較好，噴水后復合絕緣子傘裙表面會呈現出單個獨立的水珠.但由于受到拍攝條件的影響，水珠的大小、形狀、分布有很大的不同.為了能使訓練樣本最大限度的代表HC1級別憎水性圖像的特征，選取具有不同大小水珠、不同光照條件、水珠分布疏密不一致、以及水珠重心傾斜不同角度的憎水性圖像作為訓練樣本集.對于HC4～HC6級別的憎水性圖像，由于這些類別復合絕緣子表面出現了不同程度的污穢，使得拍攝所得水珠圖像的背景進一步復雜化，需要考慮背景中污穢的分布以及污穢等級的影響.本文所用到的部分HC1～HC6的訓練樣本圖像如圖2所示.

3實驗結果統計與分析

3.1可理解性分析

一個分類模型的質量通常由兩方面進行評估決定：分類試驗的準確率以及該模型的可理解性.圖4（a）和（b）給出了同屬憎水性等級HC1級的兩個測試樣本，圖4（c）和（f）為利用訓練樣本庫里所有樣本圖像對測試樣本進行稀疏表示所得的兩組稀疏表示系數和利用式（6）計算得到的各類表示誤差.從圖4（c）中可以看出：第1類訓練樣本所對應的稀疏表示系數明顯大于其他幾類的稀疏表示系數.這說明訓練樣本集中第1類樣本對稀疏表示的貢獻最大，這也在圖4（d）表示的各類測試誤差中得到了體現.因此我們僅通過圖4（c）就可判定測試樣本屬于第1類，即該憎水性圖像所對應的復合絕緣子的憎水性屬于HC1級.但是，在對第2個測試樣本圖像進行測試時，僅根據圖4（e）的稀疏表示系數對其憎水性級別進行劃分有一定的困難，各個類別所對應的稀疏表示系數變化跨度很大，系數之間大小相近的也很多.此種情況下通過進一步計算該測試圖像與稀疏表示各類之間的殘差來對測試圖像進行分類.由圖4（f）可知：第1類訓練樣本與測試圖像之間的殘差最小，以此可判定該測試樣本屬于第1類，即該憎水性圖像所對應的復合絕緣子憎水性等級為HC1級.

通過這個例子可以看出，利用稀疏表示對復合絕緣子憎水性圖像進行分類時，稀疏表示的系數具有以下兩個特點：

1）測試樣本所對應類別的訓練樣本參與該稀疏表示的比例最大.

2）同類測試樣本所對應的稀疏表示系數都比較接近.

3.2實驗結果分析

據文獻[11]，憎水性為HC1～HC2級的復合絕緣子可以繼續入網運行，HC3～HC5級時需要進行跟蹤監測，HC6～HC7級的復合絕緣子必須退出運行.本文在實驗測試階段將復合絕緣子憎水性試驗圖像分成繼續運行，繼續觀測，退出運行3大類.將HC1～HC2分為第1類，HC3～HC5分為第2類，HC6～HC7分為第3類.相對應的樣本訓練集也進行了相應的調整，形成了具備上述3大類共107幅標準憎水性圖像的訓練樣本庫即訓練樣本空間，其中第1類樣本40幅，第2類樣本30幅，第3類樣本37幅.由于第1類樣本圖像中水珠較多，導致圖像情況復雜，故相應增加了第1類樣本圖像的數量.

4結論

測試結果表明：運用稀疏表示分類算法對復合絕緣子憎水性圖像進行檢測分類具有較高的準確率和可行性.復合絕緣子圖像光照情況復雜，水珠分布隨機不規則，可見該算法對外界環境的改變具有一定的魯棒性.與傳統的憎水性圖像識別分類方法相比，稀疏表示分類算法避開了復雜的圖像分割和特征提取過程，大大簡化了復合絕緣子憎水性檢測步驟.如何通過豐富和優化憎水性圖像訓練樣本庫進一步提高算法準確率是今后努力的方向.

參考文獻

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[10]DONOHO D， TSAIG Y. Fast soluion of l1-norm minimization problems when the solution maybe sparse[R]. Department of Statistics， Stanford University， USA，2008.

核酸檢測方法范文第4篇

關鍵詞：微生物；核酸探針檢測法；基因芯片檢測法；PCR技術檢測法

隨著社會的不斷進步，人類生活水平的提高，各式各樣的食品層出不窮，食品的衛生安全是否達標成為人們熱切討論的話題。為了加強對食品安全的監測和管理，各國的科學家研究出很多食品微生物檢驗的方法，以求能夠及時、準確的檢測出食品中微生物的含量。雖然傳統的食品微生物檢驗的方法準確性和靈敏度都很高，可是檢驗起來較為繁瑣，會浪費很多的時間。隨著現代科技的進步，微生物學、分子化學、生物化學、生物物理學等領域取長補短研究出了準確率高且檢驗起來較為簡便的食品微生物檢驗方法。本文就當今運用最為廣泛的核酸探針檢測法、基因芯片檢測法、PCR技術檢測法進行了介紹。

1.核算探針檢測法

人類和各種生物之所以具有遺傳特性是因為體內含有細胞核酸，而DNA和RNA是核酸中唯一具有遺傳功能的大分子結構。通常不同的生物中具有遺傳特性的核酸片段也是有所不同的。因而不同的微生物含有的核酸片段也有所不同，核酸探針檢測法就是利用堿基配對的原理，核酸探針用同位素標記法標記出已知的核苷酸DNA或RN段，使互補的兩條核酸單鏈變成雙鏈。

由于DNA和RNA的基本組成單位有區別，所以核酸探針被分為DNA探針和RNA探針。根據檢測的食品的種類不同，通常選取不同的探針進行檢測。DNA探針能夠和微生物中一大部分遺傳基因發生反應，所以它經常被用來檢測一些菌屬、菌種和菌株；而RNA探針只能和微生物中某一個與其配對的DAN發生反應，它一般被用來檢測微生物中某一特定的可能與其配對的菌株。

總而言之核酸探針檢測法使用起來比傳統的微生物檢測更加便捷。而且特異性和靈敏度較高是核酸探針檢測法的優點所在。同時核酸探針也具有準確找出微生物組織的化學染色體的功能，核酸探針檢測法經常被用來檢測食品中具有致病性的微生物含量。雖然它的優點很多可是他也有存在一個重大的缺點。由于不同微生物的基因都有差別，所以要對不同的微生物進行檢測就需要多種探針，而且核酸探針檢測技術尚未發展成熟，所以不具有一些比較稀有的微生物探針，因此有事食品中的微生物不能完全被檢測出來。

2.基因芯片檢測法

基因芯片檢測法利用寡核苷酸的原理。取微生物的寡核苷酸點樣在檢測芯片上，提取微生物樣品的基因通過PCR技術制作熒光標記探測針，然后放到芯片上的寡核苷酸中，使其進行雜交，最后掃描熒光探針的數量并確定其位置，來判斷 被檢測的食品中是否含有某種微生物。

基因芯片檢測法有三大優點：一是不管是哪一種介質，基因芯片檢測法都可以檢驗出它里面的微生物含量；二是只需要一次實驗就可以檢測出食品中含有哪種微生物；三是用同一個芯片就能夠準確的檢測出食品中一種微生物的遺傳指標，而且對于復雜的生物群體基因的研究也有重要的作用。與傳統的食品微生物檢驗技術相比，基因芯片檢測法有以下三點先進性：第一點是，基因芯片檢測法可以一次檢驗出一種食品中含有的所有微生物，不需要像傳統檢測技術那樣反復進行檢測；第二點是，基因芯片檢測法比傳統檢測更加快捷，利用基因芯片檢測食品只需要四個小時就能夠得出檢測的結果，而傳統的檢測方法要四到七天才能得出結果；第三點是，相對于傳統檢測方法而言，基因芯片檢測法的特異性較強且敏感性高。可是相比于傳統檢測方法，基因芯片檢測法也有以下四點缺點：

（1）檢測的費用比傳統檢測法昂貴得多。因為基因芯片檢測法需要專門的儀器，而用于檢測的儀器價格非常高，這也是基因芯片檢測法沒有在我國廣泛應用的最主要的問題之一。

（2）基因芯片檢測法操作起來比較復雜而且非常浪費時間，檢測時操作人員要具有較高的專業技術。這也是導致基因芯片檢測法不能夠被很多人采納的原因。

（3）基因芯片檢測法對實驗操作的要求非常嚴格，因為在對檢測的微生物進行放大的過程中，提取出來的樣品很容易就會造成污染，從而影響了檢測的結果。

（4）在對食品進行檢測時，微生物樣品制作和標記的過程比較復雜，而且至今為止沒有學者提出精確的關于檢測樣品質量的定義，所以檢測結果往往因人而異。

3.PVR技術檢測法

3.1 常規PCR技術檢測法

常規PCR技術檢測法的原理：在含有DNA模板、引物、適當的緩沖液等等溶液的反應混合物中，以熱穩定DNA聚合酶為催化劑，來擴增由一對寡核苷酸引物界定的DN段。

3.2 多重PCR技術檢測法

多重PCR技術檢測法的檢測原理與常規PCR技術檢測法大致相同。在某一個反應體中添加多于一對的特異性引物，如果反應體中出現特異性與各引物對互補的模板，那么在相同的測驗管中就會出現多條現在的DN段。與常規PCR技術檢測法相比，多重PCR技術檢測法的優點是：在特異性和靈敏性與常規PCR技術檢測法相同的條件下，減少了實驗步驟和實驗試劑的使用，而且一次可以檢測食品中多種微生物。可是多重PCR技術檢測法也有很多缺點，例如，擴增效率和敏感性低、會出現引物干擾等。

結語：隨著社會的高速發展，人們的生活品質也越來越高，同時對食品衛生安全的監督也越來越強。雖然比起傳統的檢測方法，新興的檢測方法更加快捷，可是檢測成本和結果卻比不上傳統模式。因此，各個學科的研究者們還應該繼續努力，對食品的檢測方法繼續進行優化，讓人們都能夠吃上低微生物危害的食品。

參考文獻

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核酸檢測方法范文第5篇

【關鍵詞】環介導等溫擴增；副溶血性弧菌屬；食源性；檢測

【中圖分類號】R155 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0555-02

隨著生活水平的不斷提高，食源性食物的安全越來越受到全社會和政府各級部門的高度重視與關注，而與食源性食物安全相關的微生物檢測已成為食品保障的重要措施之一[1]。用LAMP法可以快速、簡便、準確的檢測出食源性食物中致病性微生物，大大縮短檢測時間，提高致病性微生物的檢出率，為致病性微生物的分離培養提供指導方向和科學依據。

副溶血性弧菌是引起人類急性胃腸炎和食物中毒的一種重要的食源性致病菌，在海水產品中其感染水平可達80%[2]，在細菌性食物中毒中，由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。傳統的副溶血性弧菌國標法[4]檢測時間長，檢出率低，不宜快速出結果。

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術[7]是一種新型等溫核酸擴增方法，針對靶基因設計4-6條引物，利用一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件 （60-65 ℃） 保溫約 60 分鐘，即可完成核酸擴增反應，產物為針對靶基因擴增產生的各種大小的莖環狀DNA混合物，副產物為肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀。目前LAMP多側重于檢測方法的建立[8]，用于實際樣品檢測的研究較少。本實驗室參加了國家食品風險安全監測，收集了12類286份食源性食品同時進行副溶血性弧菌國標法和LAMP法的檢測對比，探究副溶血性弧菌屬LAMP法在食源性食物檢測中的實際應用價值，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DYY-6C型電泳儀 （北京市六一儀器廠） ；凝膠成像儀 （Gel Doc 2000 BIO-RAD） ；DK-8D 電熱恒溫水槽 （上海精宏） ； Bst DNA 聚合酶 （Biolabs） ；Betaine （Fluka） ；MgSo4 （Sigma） ；SYBR Green I 、SYBR? Safe DNA Gel Stain （invitrogen） ；dNTP（北京天根公司）；通用型核酸提取試劑盒（廣州華瑞安生物）；全自動微生物鑒定生化儀（美國BD）。干燥培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司，顯色培養基購自法國CHROMagar公司， API生化鑒定卡購自法國生物梅里埃公司，均在有效期內使用。

1.2 標本來源 本科室2010年6月至12月收集的12類286份（生禽肉26份；生畜肉26份；熟肉制品32份；速凍熟制米面制品16份；速凍米面制品16份；即食非發酵豆制品26份；動物性水產64；沙拉16份；鮮榨果汁16；生食類蔬菜4份；冰激凌16份；嬰幼兒配方食品16份）食源性食物標本；陽性控制菌株：副溶血性弧菌（ATCC-17802）。

1.3 食源性食品樣品的前增菌 參照國標《食品衛生微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[4]進行處理。

1.4 LAMP檢測食源性食品中的副溶血性弧菌 分別取1mL食源性食品標本前增菌液（3%氯化鈉堿性蛋白胨水）10000 rpm離心2分鐘，棄其上清液后，利用核酸通用提取試劑盒進行核酸提取，再取1μl上清液做待檢模板DNA。利用文獻[2，6]報道的LAMP檢測方法及引物（F3：5'- GGCGATATTGGTGTTTATGGGG -3'，B3：5'- AACGATAAACTGGACCACGG-3'，FIP：5'- GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG -3'，BIP：5'- CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG -3'；由上海invitrogen公司合成。）對286份食源性食品標本增菌液DNA進行檢測，反應體系（25μl）：FIP、BIP（40 uM）各1.0 μl，F3、B3（10 uM）各0.5 μl，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture（10 mM） 3.5 μl，Betaine（5 M）5.0 μl，Mgso4（250mM）0.6 μl，Bst DNA 聚合酶 （8 U/μl）1. 0 μl，DNA 模板2μl，加ddH2o 至 25 μl。輕彈混勻后于水箱內65 ℃孵育60 min，80 ℃ 2分鐘滅活酶結束LAMP反應。LAMP反應結束后可直接進行肉眼檢測：檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；也可將LAMP產物加熒光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分鐘觀察結果，反應液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性； 電泳鑒定：1μl擴增產物與0.2μl上樣緩沖液混勻后點樣于含適量SYBR? Safe DNA Gel Stain的2 %瓊脂糖凝膠中，70 V電泳約60～100 min，電泳圖片顯示為最小片段大于100bp的LAMP特征性梯狀條帶，結果為陽性；如無任何條帶則結果為陰性；如見最小片段小于100bp的梯狀條帶，則判斷為非特異性擴增，需要重新檢測。

1.5 食源性食品中副溶血性弧菌的分離培養鑒定 參照國標《食品衛生微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[8] 進行分離培養鑒定。

1.6 統計學方法 利用Pearson's卡方統計分析結果。

2 結果

2.1 食源性食品中的副溶血性弧菌LAMP檢測結果 所有標本增菌液經LAMP法，僅從64份動物性水產標本中檢測出副溶血性弧菌陽性菌株44份，陽性率為68.75%。并且可以通過肉眼判斷：檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；也可將LAMP產物加熒光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分鐘后觀察結果，反應液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性，見圖1。電泳檢測結果，凝膠瓊脂糖電泳出現最小片段大于100bp的LAMP特征性梯狀條帶為陽性，結果圖2。

2.2食品中的副溶血性弧菌分離培養結果 所有標本經國標法，僅從64份動物性水產標本中分離出副溶血性弧菌陽性菌株33份，陽性率為51.6%。

2.3統計學分析結果 64份動物性水產標本經LAMP法和國標法，兩種檢測方法皆為陽性數：32份；兩種檢測方法皆為陰性數：19份；LAMP法陽性，而國標法為陰性數：12份；國標法為陽性，LAMP法為陰性數：1份；經Pearson's卡方統計分析，結果：P

3 討論

本研究中利用LAMP法對食源性食品標本的前增菌液進行核酸檢測，并和平行檢測的國標法進行了檢出率的比較，結果顯示：LAMP法檢出率更高，達68.75%，而國標法只有51.6%，兩種檢測結果經統計學分析，有統計學差異，LAMP法檢測陽性率更高。

國標法需要經過增菌、分離、生化鑒定這幾個步驟，檢出副溶血性弧菌至需要4-7天。LAMP法檢測只需要采用前增菌液進行核酸提取后即可開始LAMP擴增試驗，在60分鐘即可以完成LAMP擴增過程，24 小時內檢出副溶血性弧菌屬，相比國標法更快速。另外LAMP法還可以利用肉眼判斷結果，直觀方便，對于生鮮食品的快速檢測具有重要的意義。

LAMP法是對副溶血性弧菌屬的通用核酸檢測，不能進一步鑒定分型和分離菌株，將LAMP法配合國標法進行食源性食品的衛生檢測，LAMP檢測發現陽性結果后再進行國標法試驗來鑒定菌株，可以提高食品衛生檢驗的效率。

綜上所述，在對食源性食物進行檢測的過程中，運用LAMP快速檢測方法，結合國標法，進行綜合判斷，可以在最短的時間內取得最準確的檢驗結果。

參考文獻

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基金項目：

長沙市科技發展項目（K0902167-31）