細胞生物學研究

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細胞生物學研究范文第1篇

以前我國的學校進行細胞生物學實驗的方法是：老師將實驗步驟、實驗操作、注意事項在實驗之前全部告訴學生，學生在老師設置的要求里用心完成課堂實驗，造成學生在做實驗的時候，對老師的指導形成了嚴重的依賴性，缺乏創新意識，不利于學生未來實踐能力的培養。鑒于這種情況，我國開始改變實驗教學模式，在保證學生生命安全的條件下，盡可能的將實驗變成開放性實驗，增強學生在實驗過程中的自主性，學生根據自己的設想，用一定的實驗方法去驗證自己設想的可行性，老師的任務是現場監督實驗的安全性，對一些存在安全隱患的實驗方法進行制止，并在實驗快要結束的時候，將課本上的實驗方法進行講解，并鼓勵學生無論設想是否正確都要積極去做，科學的路上本來就充滿挫折，失敗是很正常的，使學生更加愿意按照自己的設想去做實驗，久而久之增強了學生的實驗設計能力和創新能力，從長遠來看必將推動我國甚至世界生物科學的發展。

2.及時的更換實驗內容。

科學技術在不斷的進步，生物科學也不例外。在生物學實踐教學的路上必須不斷豐富實驗內容，及時的讓學生學習到世界先進的研究成果或者優良的研究方法。學校可以根據本校學生的實際情況，適當增加實驗的難度，在安排實驗的時候盡量多一些創新性的實驗減少驗證性實驗的比例，因為相對應于驗證性實驗，創新性的實驗更加有利于培養學生的創新能力和生物研發能力，創新性實驗提前不知道實驗結果，學生帶著問題和好奇去做實驗，而驗證性實驗學生在做實驗之前就已經知道了本實驗的實驗結果，只是通過一定的方法驗證結論即可，此外創新性實驗的實驗結果不唯一，有利于培養學生的發散思維，根據自己對實驗現象的不同理解，從不同的角度得出不同的實驗結論。實驗是一個實踐性的教學，更改實驗內容光從改變這些實驗的理論是不夠的，還必須要求實驗硬件的配合，增加在實驗方面的投資，購買一些先進的實驗設備，聘請一些國內外知名的生物學教授來學校進行教師的培訓或者辦學生講座，軟件和硬件雙管齊下才能達到更換實驗內容目標，最終提高基于實踐的細胞生物學教學效果。

3.老師根據學校現有的物質條件，合理的安排實驗內容。

雖然我們在細胞生物學的教學過程中，大力支持和發揚實踐教學，也就是將課堂做生物實驗作為教學的主要形式，學生通過做實驗，將理論與實踐結合起來，并從中鍛煉自己實際解決問題的能力，甚至創造出一些科技成果來，但是，我們也不能盲目的追求實驗教學，因為大多數實驗尤其是生物實驗需要非常先進的設備，有的還需要珍貴的材料做實驗標本，這會無形之中提高學校的教學成本，不利于學校的可持續發展，所以，必須將實踐教學與學校的實際辦學條件緊密結合起來，老師根據目前學校目前擁有的先進設備和實驗標本合理的安排實驗，保證將現有的資源合理利用，對于那些必須的先進生物設備和實驗標本老師應該向上級部門提出申請，希望學校能盡力滿足。

細胞生物學研究范文第2篇

關鍵詞：TBL；教學模式；細胞生物學；實驗

中圖分類號：G642.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）11-0257-03

細胞生物學不僅是生命科學的重要基礎學科之一，也是現代醫藥學、生物技術領域、畜牧業、水產養殖等行業的重要基石。同時，它還是一門實驗性較強的學科，通過實驗可以讓學生將理論知識融會貫通。一直以來，細胞生物學實驗“以教師為中心，以驗證為中心”的舊教學方式大大地阻止了學生實驗的積極性和創新性。要怎樣改變細胞生物學的實驗教學來培養學生主動學習知識、獨立思考問題，以及運用實驗手段來探索生命的本質和現象，目前是細胞生物學實驗教學改革需要思考的問題。以團隊為基礎的學習（team-based learning，TBL）是上世紀70年代的美國Oklahoma大學Larry K Michaelssen教授創立的。與傳統的以授課為基礎的學習（lecture-based learning，LBL）教學模式有著很大的不同。TBL不再是以教師講授為中心，而是以學生自主學習為中心，以學生團隊式合作學習為主，注重培養學生人際交往能力，培養主動發現問題并解決問題的能力，是一種有效促進學習的新型教學模式。目前，TBL教學模式已在我國中山大學、三峽大學等高校廣泛應用，特別是在臨床、解剖等醫學基礎課程和信息素質教育課程的教學中已得到普遍認可。雖然在我國已有很多院校在不同程度上開展了TBL教學法的探索和研究并得到不同程度的好評，但沒有得到推廣和應用。針對細胞生物學實驗課程的性質，將TBL教學法應用到細胞生物學實驗課程中，擬為TBL教學模式在《細胞生物學實驗》課程中的推廣進行一些探討，提供一些思路。

一、TBL教學模式設計與實踐

細胞生物學實驗課程教學以理論課程為基礎。理論與實踐相結合，加深對所學知識的理解，對實驗儀器要求較高，因此開設此課程的宗旨是使學生掌握細胞生物學實驗設備的操作方法。使學生更加牢固地掌握基礎知識，更重要的是培養學生動手和科研能力。

1.團隊組建。將我院2011級生物科學本科班60名學生分為15組，其中每組為4人。分組時對組內成員進行調配，以達到組與組之間的均衡，再由成員分推選出一名組長，小組必須合理組織，合理管理，組員需要有責任意識。分組時要遵循的原則是既要使小組內的各種資源均衡，還要保持小組內成員穩定不變，減少影響小組內部凝聚力的因素。

2.教學準備。根據《細胞生物學實驗》教學大綱要求，教師將需要了解與掌握的內容提綱預先告知學生，在TBL教學之前讓學生對將要開展的實驗進行預習。運用TBL教學法，學生根據老師擬定的教學提綱，實驗室具備的實驗器材，結合課程內容，進行實驗前的自我研讀和儀器、材料準備。充分體現以學生為主體，提高學生主動性的要求。

3.教學實施。（1）個人測試。在課堂開始的前十分鐘，給每位學生發放一份復選題，題目覆蓋此次實驗課的實驗目的、實驗原理、操作步驟及其注意事項，要求學生運用之前所學到的知識來完成。之后參照分組，各組共同回答同樣的復選題測驗，并交出共識建立之后的答案，最后老師來分析、總結。個人測試有助于教師了解學生學習知識的情況，有利于教師調整和安排教學進程。（2）組間交流。接著進行組間交流發言，其中某一小組選舉一名代表，上講臺把本組覺得重要內容、必須重視的注意事項向其他組的同學匯報，其他組的同學與該組交換意見，共同尋求保證實驗成功的可行性方法。教師在一旁聽證，記錄各小組在討論中存在的問題、小組的發言次數及發言的質量。在此過程中，教師應鼓勵不愛發言的學生發言，參與到討論中，必要時對不發言的學生進行有針對性的提問。（3）實驗進行。實驗進行過程中教師要注意培養學生的創新精神和能力。及時指導學生對實驗進行階段性總結。教師總體掌控任務的執行，注意隨時為學生調整實驗任務，讓學生就實驗內容進行深入的思考，發現實驗探索生命本質成功的關鍵。實驗結束后，要求學生及時記錄實驗結果，最后各組選派一名代表展示實驗結果，對實驗結果進行分析，優秀學生帶動差生，綜合提高班級水平。評估提高實驗結束后收集實驗結果，要求學生對實驗結果進行分析、討論，最后撰寫實驗報告。

二、TBL教學調查研究

研究采用問卷調查。課程結束后對全班學生進行調查。教師參考相關研究后設計調查問卷。調查問卷包括：實驗前是否進行課前預習；是否有利于提高文獻檢索能力；是否有利于提高人際交往能力；是否有利于提高學習主動性；是否有利于提高實驗動手能力；是否有利于增強團隊協作意識；今后是否繼續使用TBL教學模式等問題。

三、結果

60份調查問卷全部收回，收回率100%，其結果見表1。調查結果98.4%的學生認同TBL教學法能調動學生學習積極性，98.4%的學生認為能提高文獻檢索能力，95.1%的學生認為能提高人際交往能力，96.8%的學生認為能促進課前預習，96.7%的學生認為能提高動手能力，96.7%的學生認為能增強團隊協作意識，96.7%的學生認為能使他們建立自主學習的觀念，96.8%的學生認為TBL教學法能使課堂教學氣氛活躍，95.1%的學生認為能更好地使他們理解課堂內容，91.7%的學生認為TBL教學法能及時解決學習問題，95.0%的學生認為能提高學生運用所學知識的能力，98.4%的學生認為今后應繼續使用TBL教學模式。

四、討論

細胞生物學實驗傳統的教學主要以教師講解理論知識，學生驗證為主。學生被動地學習知識技能，不能激發學生的積極主動性。而采用TBL教學模式在教學中的優點與不足具體討論如下：

1.使實驗課教學能在更高層次提高學生的動手能力。調查結果表明有96.7%的同學對提高學生的動手能力表示認同。與傳統教學模式相比較，TBL教學模式更注重學生的主體性，教師精心設計一系列必要的知識內容，促使學生課前預習實驗內容、操作步驟、注意事項，查閱相關文獻資料解答疑惑，使其理論知識得到不斷鞏固與加強。學生用更多的時間去驗證實驗，可以發現自己在實驗中的不足，激發學生去改正并且提高實驗操作能力。

2.向后進生提供幫助與支持。TBL教學模式以團隊為單位，小組成員無論是理論還是實驗操作技能存在不足的，都會在個人測試，團隊交流、討論中顯現出來，發現有知識點或是實驗操作有不足之處的，老師或者其他懂的同學可以及時指導。所以，TBL教學模式能給后進生提供支持和幫助，能獲得較大容量的學習知識。

3.培養學生的團隊協作和人際交往能力。調查結果表明有96.7%同學對能提高團隊協作認同，有95.1%的同學對能提高人際交往能力認同。在TBL教學中，教學任務的完成主要是通過團隊協作來完成，這有利于提高學生團隊合作的精神。在整個過程中，小組的每個成員都需要參與到問題的分析和解決中去，并通過相互的溝通來達成共識[5]。TBL教學模式中，小組內成員合作學習，取長補短，共同完成組內任務，這一過程培養了學生團隊協作意識[7]。

4.樹立并保持教師的工作熱情。采用TBL教學法對細胞生物學實驗課進行教學，教師不僅要把需要講解的知識點全部熟悉，還要理解相關的其他學科知識，花更多的時間去準備測試題和相關資料。對教師來講，教師是引導者和組織者，通過與學生共同參與討論，教師也從中獲益，實現教學相長式的終身學習，從而提高了教學效率[6]，樹立并保持了教師的工作熱情。

5.真正讓學生主動學習。調查結果表明有98.4%的同學對TBL能調動學生學習的主動性認同。在TBL教學過程中，學生以討論式學習和互教式的拓展性學習，真正做到以學生為中心。例如學生從實驗課開始之前就需要自己根據教師給出的學習任務，自我研讀掌握知識。實驗過程中親自動手實驗，不明白的地方由學生向老師提問。老師在回答之前，先請其他學生來回答，這樣可以增加互動。

6.節省課時，提高課堂效率。TBL教學采用課前給學生下達學習任務，學生以團隊合作方式進行自我研讀，這一環節大大縮短了教師課堂上的講授時間，留有更多時間讓學生測驗、團隊合作學習、團隊討論，提高了課堂效率。

7.TBL教學法在細胞生物學實驗教學具體實施過程中的不足及展望。TBL教學對教學設備、教學場所、教師個人素質等提出了更高要求，首先，要求教師對本專業知識融會貫通，教師個人素養高，教學技能出色，并要具備良好的組織管理能力以及控制實驗進行的能力。其次，教師對學生的學習興趣、學習態度、能力和責任感等很難在短期內較為全面和準確的把握。當發現一些小組成員搭配得不恰當時。已經來不及重新分組，這就會造成組間成績有一定差異[5]。另外，TBL教學法的特點是以小組討論形式開展教學，1位教師組織TBL教學，心有余而力不足，不能有效地參與到每一個小組的討論和實驗指導中去，這樣也會影響到TBL教學的效果。雖然TBL教學在《細胞生物學實驗》中推廣還存在一些問題，還有待今后不斷地探索和完善。但TBL教學模式教學有利于提高學生的學習積極性、主動性以及動手能力和科學研究能力，能有效促進學生培養團隊協作精神，同時更新了教師的教學理念，促進了師生之間交流，提高了細胞生物學實驗的教學質量[5]。調查表明有98.4%的學生贊同在今后教學中繼續使用TBL教學法。

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細胞生物學研究范文第3篇

    雖然近年來對大腸癌治療的研究已經取得了很大進展，但始終不能改變其發病率和死亡率高的特點，對患者預后亦無明顯改善。因此，本研究探討δnp73基因的高表達對大腸癌細胞生物學行為的影響，為臨床防治大腸癌提供較可靠的理論依據。

    1  材料與方法

    1.1  實驗材料

    lovo細胞株及真核表達質粒pcdna3δnp73均由第三軍醫大學大坪醫院腫瘤科惠贈。rpmi1640培養基、小牛血清購自hycolone公司。胰蛋白酶購自sigma公司。millicell chamber購自millipore公司。四甲基偶氮唑藍(mtt)、青霉素、鏈霉素均購自gibco試劑公司。vegf試劑盒購自r&d公司。

    1.2  lovoδnp73細胞株的建立

    以人類大腸癌細胞株lovo細胞為研究對象，將構建于真核表達質粒pcdna3δnp73基因用脂質體法轉染lovo細胞，用g418沉篩選出過表達δnp73基因的細胞株，命名為lovoδnp73細胞株；同時以空載體pcdna3轉染細胞，命名為lovopcdna3。

    1.3  臺盼蘭活細胞記數測定細胞的增殖能力與細胞活力

    胰酶消化收獲細胞（含懸浮及貼壁細胞）制備單細胞懸液，以冷pbs懸浮，細胞濃度為1×105/ml。取9滴細胞懸液移入小試管內，加1滴0.4%臺盼蘭工作液，混勻，在3min內用血球記數板分別記數活細胞和死細胞。

    1.4  細胞增殖曲線mtt測定

    取對數生長期細胞懸液200μl/孔（含2×103個細胞）接種至96孔板，于37℃、5% co2、飽和濕度培養箱，每組每天取3個復孔，每孔加入20μlmtt（5g/l）培養4h后棄培養液，每孔加入二甲基亞砜(dmso)200μl，振蕩10min溶解結晶紫。酶聯免疫檢測儀測定490nm波長各孔光吸收值（a490值）。

    1.5  流式細胞儀檢測細胞凋亡

    將lovo細胞制備成單細胞懸液，收集到5ml離心管中，離心，2 000g，5min，室溫，冷pbs洗滌2次，離心，2 000g，5min，棄上清。再以冷pbs懸浮，細胞濃度為1×106ml。加5ml annexin vfitc溶液和2.5μl pi到100μl細胞懸液中，混勻后室溫避光反應30min。加入反應緩沖液400μl，流式細胞術對凋亡細胞進行定量檢測。

    1.6  boyden小室體外侵襲實驗

    用改良的boyden小室法[1]：用人工基質覆蓋millicell chamber濾膜上的微孔，向小室內加入1×105/ml的細胞懸液, 培養 12h 后取出濾膜, 將下室面的細胞刮下，將膜固定，結晶紫染色細胞，高倍鏡下隨機取5個視野,計數細胞,取平均值。

    1.7  westernblot檢測vegf蛋白表達

    按照ripa蛋白提取步驟提取細胞總蛋白,采用bradford法測定總蛋白濃度。取總蛋白40μg行sdspage,電泳結束后電轉印17h至pvdf膜,膜封閉液內封閉室溫1h,4℃過夜,pbs洗膜5min×4,加入兔抗人vegf單克隆抗體(1∶350),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,再加入羊抗兔igg(1∶2 000),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,化學發光試劑與pvdf膜共同孵育1min,將pvdf膜與x光片共同放暗盒曝光4min,顯影3min,定影10min。以gelproanalyzer凝膠定量分析軟件分析westernblot檢測結果,得出各條帶的灰度值,以平均灰度值代表vegf蛋白表達水平。

    1.8  統計學方法

    數據結果以±s表示,采用t檢驗, spss10.0統計學軟件進行分析。

    2  結果

    2.1  臺盼蘭拒染實驗

    臺盼蘭拒染實驗中活細胞不染色，而死細胞染藍色。結果顯示δnp73轉染后lovo細胞的死細胞比例為（4.6+1.1）%,較lovopcdna3組（7.5+0.8）％明顯減少，差異有統計學意義（p<0.01）。

    2.2  mtt法測定細胞生長曲線

    mtt結果顯示，轉染δnp73的lovo細胞較轉染空載體pcdna3的lovo細胞組和空白對照組細胞生長明顯增快，差異有統計學意義（p<0.01），見圖1。

    圖1  mtt法測定細胞生長曲線

    2.3  基因轉染對大腸癌細胞凋亡率的影響

    fitcpi流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示轉染空載體pcdna3的lovo細胞組凋亡率為（5.8＋1.2）％，而轉染δnp73的lovo細胞組的凋亡率為（2.4＋0.8）％，與lovo/pcdna3組對比凋亡率明顯降低（p<0.01），見圖2。

    圖2  δnp73轉染對lovo細胞凋亡的影響

    2.4  boyden 小室體外侵襲實驗

    lovo、lovopcdna3 和 lovoδnp73細胞穿過人工基底膜的細胞數分別為（21.4±0.1）、（22.8±0.4） 和（39.5±0.6）, lovoδnp73 細胞與lovo 細胞和 lovopcdna3細胞比較, 穿膜數量明顯增加, 兩者間差異具有統計學意義(p<0.01) 。而lovo細胞和 lovopcdna3細胞穿膜數的差異無統計學意義(p>0.05) 。

    2.5  vegf蛋白表達westernblot檢測結果

    vegf蛋白表達westernblot檢測結果見圖3。轉染pcdna3后lovo細胞中vegf蛋白表達水平與對照組比較差異無統計學意義(p>0.05),而轉染δnp73能使vegf蛋白表達水平升高,灰度值上升，與未轉染p73基因的細胞相比上升了44.2％，差異有統計學意義 (p<0.05)，見表2。表2  轉染δnp73前后lovo細胞中vegf蛋白含量

    3  討論

    研究表明δnp73因為n末端轉錄活化區缺失導致轉錄活化功能完全喪失,對p53和全長型p73的轉錄活化和促凋亡活性有明顯的負調節作用[2,3], δnp73除與大腸癌的發生、發展關系密切外，對神經母細胞瘤也是一個預示較差預后的分子標志[4]。但在某些腫瘤中，如甲狀腺腫瘤，δnp73卻有著抑制增殖的作用[5,6]。由于δnp73基因在不同的腫瘤中對細胞凋亡和血管生成的影響不同，因此本實驗以δnp73基因在對大腸癌細胞的生長、凋亡率、體外侵襲性以及對血管調節因子的表達調節作為主要切入點進行了研究。

    本實驗采用臺盼蘭拒染、mtt測定對轉染后細胞的體外生長情況進行了分析。臺盼蘭拒染、mtt測定均可反映細胞的增殖情況，但作用的機制與側重點不同。臺盼蘭是一種有機染料，當細胞損傷或死亡時，可透過細胞膜與解體的dna結合，使其著色，而活細胞阻止其進入，借此可鑒別活細胞和死細胞。本實驗用該方法測定細胞的總數與存活率。mtt是一種淡黃色的化合物，它參與活細胞線粒體的能量代謝。在活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶可將mtt還原成難溶性的紫蘭色結晶物formazan并沉淀在細胞中，而死細胞無此功能。在一定的細胞范圍內，mtt結晶物形成的量與活細胞數成正比。dmso能溶解細胞中藍紫色的結晶物，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可以間接反映活細胞數量。我們認為，臺盼蘭拒染實驗操作簡單，方便快捷，但結果受人為因素影響較多。mtt法較客觀準確，是一種較好的判斷細胞增殖的指標，而boyden 小室體外侵襲實驗，則為檢測大腸癌細胞轉染δnp73基因后的侵襲力改變提供了直接證據。本實驗將3種實驗方法的結果相結合分析更具準確性和說服力。進一步流式細胞分析提示δnp73基因轉染lovo后細胞凋亡比例明顯減少。這一結果提示δnp73基因過表達可以促進大腸癌細胞的惡性增殖，其可能的機制是δnp73的過表達通過影響p73的反式激活而導致其啟動子活性的減弱,抑制p73誘導的凋亡[2]。

    除了上述指標，目前，對大腸癌的細胞生物學行為的研究中還有一個研究熱點就是腫瘤血管生成 [7]。vegf是迄今鑒定出來的最重要的促血管生成因子之一,vegf能特異地與血管內皮細胞上vegf受體結合,刺激內皮細胞增殖并促進血管形成。因此,vegf是反映大腸癌細胞生物學行為的良好指標。在本研究中, 采用westernblot法檢測高表達δnp73的細胞中的vegf蛋白表達水平,發現過表達δnp73大腸癌細胞株中vegf蛋白的表達較對照組明顯增高,表明δnp73的高表達打破了血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡,從而促進了血管生成。其可能的機制是當大腸癌發生時,抑制因子表達下調、刺激因子上調,并伴隨著癌基因激活和抑癌基因失活從而促使病理性血管生成[8,9]。本實驗結果提示δnp73的高表達能促進大腸癌血管生成，增強了其侵襲和轉移的能力，這也給我們今后對大腸癌臨床治療研究提出了一個思路和課題：有效的抑制δnp73的過度表達，可以在基因水平上抑制大腸癌血管的生成，從而對癌腫的生長和侵襲起到有效的抑制作用。

    綜上所述，δnp73以高表達的方式參與大腸癌的發生發展，抑制大腸癌細胞凋亡，上調血管生成因子vegf的表達，促進了大腸癌血管增生，增強了大腸癌細胞的侵襲性。鑒于δnp73基因對大腸癌細胞的這些影響,我們認為，對δnp73進行檢測，有利于從基因水平了解大腸癌的發生機制和生物學行為，從而對大腸癌作前瞻性估計，為臨床上對大腸癌的診斷、鑒別診斷、治療及預后判斷提供重要的參考指標，同時，還可將δnp73作為新的腫瘤治療靶點進一步深入研究。

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細胞生物學研究范文第4篇

[關鍵詞] 牙囊細胞； 基因轉染； 端粒酶； 成骨分化； 增殖

[中圖分類號] Q 813 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.002 牙囊細胞（dental follicle cells，DFC）來源于形成牙周組織始基的牙囊[1]，系牙周組織工程研究中受到廣泛關注的種子細胞之一[2]。數量豐富并且細胞表型

和生物學性質穩定的種子細胞是牙周組織工程研究的前提[3]，但是牙囊細胞體外培養的數量較少，容易

失去自我更新能力發生老化。通過轉染外源性基因片段至目的細胞可以抑制細胞的衰亡，使有限的生命細胞轉化成為具有長期傳代能力和穩定表型的細胞。

猿腎病毒SV40大T抗原（simian virus 40 large tu-mor antigen，SV40Tag）是較常用和有效的外源性基

因之一[4]，目前國內外已成功將其用于牙骨質細胞

以及牙周膜成纖維細胞[5]的永生化構建。本研究將

SV40Tag基因片段轉染至體外培養的SD大鼠牙囊細胞，對其傳代增殖能力和抗衰老能力、成骨分化及細胞增殖等生物學特征進行觀察和檢測，為牙周組織工程研究的種子細胞來源提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1周齡SD大鼠由重慶醫科大學實驗動物中心提供，含SV40Ta段質粒pSSR69、pAmpho、293細胞均由重慶醫科大學基礎醫學院羅進勇教授惠贈，胎牛血清、DMEM培養基（Hyclone公司，美國），胰酶、Ⅰ型膠原酶、脂質體2000、二甲基亞砜（dimethyl sul-foxide，DMSO）、聚凝胺（polybrene）、潮霉素（hygro-mycin）（Sigma公司，美國），端粒酶逆轉錄酶（telome-rase reverse transcriptase，TRT）抗體、山羊抗兔二抗、甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Cell Signaling Technology公司，美國），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）（Bio Basic公司，美國），Rever Tre Ace-a-逆轉錄試劑盒、SYBRGreen逆轉錄試劑盒（Toyobo公司，日本），瓊脂糖（TaKaRa公司，日本）。

1.2 牙囊細胞體外培養及SV40Tag基因轉染

將SD大鼠引頸法處死后取出下頜第一磨牙牙胚，分離出牙囊組織立即置入DMEM培養基并剪成l～2 mm大小的組織塊。加入0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化1 h，0.25%胰蛋白酶消化5 min，離心棄上清液。加入DMEM培養基3 mL轉入培養瓶。5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養，2～3 d換液1次，細胞生長形成單層后常規消化傳代并鑒定細胞來源。37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，細胞融合至75%～80%時胰蛋白酶消化傳代。

利用293細胞包裝病毒構建含SV40Tag的逆轉錄病毒載體，制備重組逆轉錄病毒并轉染至SD大鼠牙囊細胞。方法：將293細胞按30%～40%密度鋪于T-25細胞培養瓶，待細胞貼壁（8～12 h）后，設置轉染體系，將含有SV40Ta段的pSSR69質粒1～2 μg、pAmpho質粒0.5～1.0 μg、脂質體2000 15 μL、DMEM（無血

清、無雙抗）250 μL混合均勻，室溫放置15～20 min。將T-25細胞培養瓶中293細胞用3 mL無血清、無雙抗的DMEM洗滌2遍，再加入無血清、無雙抗的DMEM 2.5 mL。將設置好的轉染體系加入細胞培養瓶，輕柔混合均勻。3～5 h后，將培養瓶中的培養基換成完全DMEM 4 mL，在繼續培養36、60、84、108 h后，分別收集細胞上清液（含有轉染體系），合計收集約16 mL，低速離心5 min去除細胞懸液，0.22～0.45 μm醋酸纖維膜濾器過濾，4 ℃保存備用。將牙囊細胞按20%～30%密度鋪于T-25細胞培養瓶，等待細胞貼壁。在含有轉染體系的293細胞培養上清液中加入80～100 μL聚凝胺，吸取SD大鼠牙囊細胞培養基，換成含有轉染體系的細胞培養上清液4 mL，6～8 h后吸出上清液，再加入含有轉染體系的細胞培養上清液

4 mL，過夜培養，第2天換成完全DMEM 4 mL，培養4 h。2 μg?mL-1潮霉素篩選。

1.3 細胞形態學觀察

以轉染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，連續傳代至60代。在倒置相差顯微鏡下觀察2組的細胞形態及生長狀態。

1.4 轉染SV40Tag基因前后DFC端粒酶表達的檢測

細胞中端粒的長度會隨著細胞分裂逐漸縮短，進而衰老死亡，因此維持端粒的長度成為阻止細胞衰老的方法之一[12]。本研究對轉染SV40Tag前后的DFC細胞進行TRT檢測，發現實驗組TRT灰度值明顯高于對照組，證明轉染SV40Tag后DFC的端粒酶被激活，端粒長度增加，提示轉染SV40Tag后的DFC具備抗衰老的特性。

轉染SV40Tag后的DFC獲得了極強的傳代和抗衰老能力，但其成骨分化和細胞增殖特性與正常牙囊細胞有無差異尚需要進一步的研究。ALP是細胞向成骨細胞分化的早期標志[13]，OC是成骨活性細胞分化晚期的重要標志[14]，Runx2基因是成骨細胞分化的

特異性轉錄因子[15]，BMP2通過信號轉導上調成骨

調控基因的轉錄直接及間接地促進成骨分化[16]。本

實驗結果表明，實驗組與對照組細胞內ALP、OC、BMP2、Runx2的表達均無統計學差異，說明SV40Tag轉染大鼠DFC后成骨早期和晚期分化能力以及成骨特異性因子的轉錄與正常牙囊細胞均無明顯差異，保持了相對一致性。IGF和bFGF[17]作為一種多肽生長因子，可促進細胞在同一生長周期內的增殖活性。本研究結果顯示，大鼠DFC轉染SV40Tag基因前后的IGF-1及bFGF表達水平均不具有統計學差異，表明轉染SV40Tag后大鼠DFC在細胞周期內增殖活性與正常牙囊細胞無明顯差異，保持了功能狀態的穩定。

本研究通過轉染SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊細胞，對其生物學特性觀察檢測，結果發現轉染SV40Tag后的DFC獲得了無限傳代增殖和抗衰老的能力，染色體端粒長度得以維持。同時該細胞保持了與正常牙囊細胞相對一致的成骨分化特性和增殖活性，表明其生物學性質穩定，有望成為牙周組織工程研究中較理想的種子細胞來源。

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細胞生物學研究范文第5篇

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-1959(2009)07-0280-02

腎細胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一,長期危害著人類健康。近十年來,對腎細胞癌的分子生物學研究取得了長足的進展,使我們對腎細胞癌有了更深刻的認識。本文就腎細胞癌各種病理分型的分子生物學研究進展進行綜述。

1腎細胞癌發生的分子生物機制

腎癌的發生發展是多階段、多步驟的過程,包括癌基因激活和抑癌基因(tumorsuppressorgene,TSG)失活在內的一系列遺傳學改變。抑癌基因的缺失或失活是腫瘤發生發展過程中重要的分子事件之一。腫瘤常在抑癌基因位點出現染色體基因缺失,表現為等位基因雜合性缺失(lossofheterozygosity,LOH),通過檢測分析腫瘤LOH及其規律,可在染色體一定范圍內發現腫瘤的抑癌基因及易感基因。為了能較全面的了解導致腎細胞癌發生發展的關鍵分子事件,不同學者對腎細胞癌全基因組進行了不同的研究,發現腎細胞癌發生高頻率LOH主要見于以下幾個染色體:3p、5q、8p、9p、10q、14q、17和18q染色體。

1.13號染色體:3號染色體短臂的部分缺失是腎癌基因改變中的高發事件。其中定位于3p25-26的VHL抑癌基因被認為是這些基因改變的首要目標。在以前的研究中,VHL在腎透明細胞癌(cc-RCC)中的失活機制主要為等位基因缺失和突變,DNA超甲基化很少見。劉寧等利用PCR限制性片段長度多態性法對3號染色體上的VHL基因的兩個單核苷酸多態性位點進行檢測來分析VHL基因的雜合性缺失失情況,發現,42%(8/19)發生VHL基因LOH,并未發現VHL基因失活與腫瘤的分期、分級存在聯系。

有雜合性缺失研究顯示,有可能在染色體3p上存在另外的RCC相關抑癌基因。定位于染色體3p14.2上包含最常見的FRA3B脆性位點的FHIT基因作為候選抑癌基因日益受到關注。Velickovic等通過選擇性的檢測FHIT區域的LOH發生情況認為這個基因在ccRCC的發展過程中起到很重要的作用。并且發現在cc-RCC中染色體3p的LOH發生率達76%。Farkas等對88例腎細胞癌病例進行LOH研究,選取了3p14.2-p25范圍內16個位點采用PCR技術進行LOH分析,結果顯示VHL基因和FHIT基因區域,透明細胞癌的LOH發生率高達96%,而狀細胞癌和嫌色細胞癌僅為10%和18%,并且LOH的發生率與腫瘤大小、分期、分級無關。從而認為VHL和FHIT的等位基因缺失是腫瘤發生的早期事件。

1.25號染色體:1986年APC基因首次在一位患有息肉病及多種其它先天性畸形患者的5號染色體長臂片段先天性中間缺失中得到證實,確切的基因位點隨后由定位克隆確定。Pecina-SlausN等利用相對外顯子11和15的特殊寡核苷酸引物對36例腎細胞癌病例進行限制性片段長度多態性的檢測,了解與APC基因相關的LOH情況,并同時檢測APC蛋白的表達情況。研究發現36例樣本中有33例為信息性病例,其中有17例出現LOH,并且LOH的發生與年齡以及腫瘤的TNM分期呈正相關。但并不是所有出現LOH的病例都有APC蛋白的表達。從而認為APC基因與腫瘤的進展有著密切關系,可能不是腫瘤發生的早期事件。

1.38號、9號染色體:Presti等學者對72例腎透明細胞癌進行LOH測定,并將LOH作為臨床預后指標的評估,他們選取了3p,8p,9p,14q四個不同的染色體,在每個染色體上選取兩對引物,結果顯示8p、9p的LOH發生率與腫瘤復發率正相關。由此推測8p、9p的LOH可作為判斷局部進展型腎癌預后的一個指標。

近年來許多學者在多種腫瘤,如肺癌、食管癌、黑色素、胃癌、成神經細胞瘤等研究中均發現,9號染色體常出現較高頻率的LOH,所以推測9號染色體上存在不止一個與這些腫瘤的發生相關的抑癌基因。Fukunaqa等利用熒光多重PCR技術比較提取自腫瘤組織和對應的外周血液樣本中的DNA,通過對9號染色體上的13個位點進行分析,發現109例腎細胞癌中27例至少有一個位點出現LOH,其中最高發生率出現在PTCH基因所在的9P22區域。而Sanz-casla等對40例單發腎細胞癌病例同時進行p16基因附近染色體9p21區域的LOH和p16基因啟動子超甲基化的檢測,出現LOH的為9例,超甲基化的為8例但是兩者之間沒有必然聯系由此推測p16基因的失活和其他未知的抑癌基因共同參與腎細胞癌的發病機制。Grady則通過對60例腎細胞癌病例進行9號染色體上的16個微衛星位點的LOH分析,60例樣本中至少一個位點出現LOH的為44例,主要缺失區域出現在位于9p21的DS171、D9S1749和DS270上。有46%的病例在9q32-9q33出現LOH,在這一區域的D9S170位點LOH發生率達22%,研究認為除了在9p21附近的p16候選抑癌基因外,在9p21以及9q32-9q33附近很有可能存在其它的抑癌基因。

1.410號染色體：Velickovic等對10號染色體上與PTEN/MMAC1抑癌基因相關的7個微衛星標記物LOH發生率進行分析，其中腎透明細胞癌的LOH發生率為37.5%，狀細胞癌為29.7%，嫌色細胞癌為87.5%，且LOH發生率與腫瘤的分期、分級和生存率有關，并且認為雙等位基因失活的發生多由非點突變畸變導致。

1.514號染色體：Kaku等對染色體14q24-31區域的7個微衛星位點進行研究，發現42例信息性病例中23例（54.8%)出現LOH，并發現LOH發生最普遍的區域位于D14S67附近的2-Mb范圍，且LOH的發生率與腫瘤分期呈正相關。同樣Alimov等利用2個RFLP位點對45例腎細胞癌患者進行研究，發現45例信息性病例中17例（38%）在染色體14q31-q32.2上出現LOH，并且LOH的發生率與腫瘤的分級和低生存率正相關。而Gallou等的實驗則將14q上的普遍缺失區域定位于D14S281到D14S277之間。另外有學者對130例腎透明細胞癌病例采用D14S588、D14S617、GATA136B01三個位點進行LOH分析，數據顯示LOH發生率與腫瘤大小、組織學分級、生長速度以及致死率呈正相關。

以上關于14q染色體的LOH研究均顯示與腫瘤的分級和低生存率呈正相關關系，表明腫瘤的14qLOH很可能與腫瘤的侵襲發展有關。

1.617號染色體：p53基因位于17p13.1上，具有反式激活功能和廣譜抑癌作用，與多種惡性腫瘤的發生、發展及預后有關。因此研究染色體17p上TP53位點的LOH情況對于揭示P53在腫瘤發生過程中發揮的作用意義重大。在29例腎細胞癌中，W.M.L.報道了關于P53的雜合性缺失為48%(14/29)，并通過序列測定確認單鏈構象多態性而發現了有11例出現突變。Ogawa等利用p53基因附近的5個多態性探針對48例腎癌進行研究，發現染色體17p的等位基因缺失率為17%(6/36)，并且染色體17p的等位基因缺失與腫瘤分期無確切相關性。其他研究者發現在17號染色體上還存在著其它LOH發生區域。Khoo等對BHD基因區域的2個微衛星位點D17S740和D17S2196進行檢測，28例腎細胞癌中10例（36%）出現LOH，其中6例嫌色細胞癌中2例（33%）出現LOH，6例狀細胞癌中出現5例（83%），透明細胞癌12例出現3例（25%）。并推測BHD基因可能在腎臟腫瘤的發生發展中起重要作用。而Simon-kayser等對處于17q11到17q23之間的7個微衛星標記物進行檢測，15例狀腎細胞癌中14例為信息性病例7例出現LOH。發生頻率最高的為與FBXO47候選抑癌基因相關的D17s250位點。

1.718號染色體：Hirata等對126例腎透明細胞癌病例進行研究，通過對染色體18q上的9個微衛星位點實驗，發現24例(19%)發生LOH，LOH最高發生率出現在DCC基因所在的18q21.3區域，并發現LOH的發生率與性別、腫瘤分期、分級、等參數無關。認為DCC和SMAD4可能做為候選抑癌基因與腎透明細胞癌的發生有關。 2腎細胞癌的病理分型與分子生物學機制

1997年國際抗癌聯盟(UICC)和美國癌癥聯合委員會(AJCC)根據已知基因改變以及腫瘤細胞起源，并結合腫瘤細胞形態特點將腎癌分為透明細胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)、狀腎細胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma)、嫌色細胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)和集合管癌（carcinomaofthecollectingducts）4種基本形式。約有4％~5％腎癌細胞形態及遺傳學改變不一，細胞成分混雜或有未識別的細胞成分，此類腫瘤歸為未分類腎細胞癌（renalcellcarcinoma，unclassified），有待今后進一步研究。由于在各型腎癌組織中都可見到細胞質中含有嗜酸顆粒或梭形細胞成分，所以在新分類中取消了顆粒細胞癌和肉瘤樣癌。

腎透明細胞癌或稱為傳統的腎細胞癌或非狀腎癌，約占70％~80％，是最常見的病理類型，起源于腎近曲小管。已明確的遺傳學改變是以3p缺失、VHL基因突變、甲基化或缺失為特征，此外尚有不十分明確的改變。綜合國內外文獻報道，常見的染色體缺失區域包括4q、6q、9p、13q、Xq、8p，常見的染色體擴增區域包括5q、9q、17p、17q。Jiang等利用分枝樹模型及時間樹模型對腎癌比較基因組雜交數據進行分析后認為透明細胞癌至少可能分為兩個亞型，一型伴有-6、+17p、+17q，另一型伴有-9p、-13q、-18q。-4q是透明細胞癌發展過程中除-3p外的另一重要早期事件，-8q多出現在轉移灶中，是原發性透明細胞癌的一個晚期事件，9p、13q上可能存在與腎癌進展相關的抑癌基因。

狀腎細胞癌或稱為嗜色腎細胞癌或腎小管狀癌，約占10％一15％，是第二常見的腎惡性腫瘤，可能起源于腎近曲小管。遺傳學上，以Y染色體丟失、7號染色體和17號染色體的三倍體或四倍體異常為特征，此外較典型的分子遺傳學異常尚有C-MET基因活化、+12q、+16q、+20q、-1P、-4q、-6q、-9p、-13q、-xp、-xq、-Y等。Delahunt和Eble在1997年應用免疫組化方法分析91例狀腎細胞癌，根據形態學改變分為2型，1型狀腎細胞癌光學顯微鏡下呈管狀結構，被覆小細胞，含有卵圓形小細胞核，核仁不顯著，胞質少、灰白。2型狀腎細胞癌為狀結構，被覆豐富嗜酸性胞質的大細胞，含有大球形細胞核。分析結果顯示：7號染色體和17號染色體倍體異常多見于狀腎細胞癌1型，而-Xp常提示預后不良。與透明細胞癌相比，狀腎細胞癌的多灶性或雙腎癌更常見。

嫌色細胞腎細胞癌約占5％，起源于腎集合小管暗細胞。遺傳學以多個染色體丟失和單倍體為特征，LOH常發生在1、2、6、10、13、17或21號染色體。

腎集合管癌少見，起源于腎髓質或腎的中央區集合管上皮，遺傳學上的改變無統一形式，以染色體18、21和Y染色體單體丟失以及染色體7、12、17、20的多倍體異常較常見。