細(xì)胞生物學(xué)特性
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細(xì)胞生物學(xué)特性范文第1篇
關(guān)鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細(xì)胞活率；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞凋亡
中圖分類號(hào)：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）12-2862-04
Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell
CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，F(xiàn)NAG Nan-zhu，LI Zhong-shu
（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）
Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.
Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis
體細(xì)胞核移植是哺乳動(dòng)物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點(diǎn)。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)、畸形等。大量研究表明，體細(xì)胞核移植所用的供體細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等）都是高度分化的細(xì)胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細(xì)胞融合時(shí)需要經(jīng)過去甲基化才能維持胚胎正常發(fā)育，如果重構(gòu)胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生改變，從而導(dǎo)致重構(gòu)胚發(fā)育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進(jìn)而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細(xì)胞內(nèi)這種核苷類似物可以轉(zhuǎn)化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復(fù)制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進(jìn)入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合，使酶的活性降低，最終使處理細(xì)胞基因組DNA發(fā)生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細(xì)胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細(xì)胞，顯著降低了供體細(xì)胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞作為延邊奶山羊體細(xì)胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對延邊奶山羊體細(xì)胞克隆供體細(xì)胞的影響，為提高延邊奶山羊體細(xì)胞克隆效率提供參考。
1 材料與方法
1.1 試劑與材料
1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預(yù)融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎(chǔ)藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。
1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經(jīng)過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液[4]。每3～5 d換液1次。當(dāng)原代細(xì)胞匯合至80%時(shí)，消化傳代，3代以后的成纖維細(xì)胞可用于試驗(yàn)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，接種于24孔或96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。5-aza-dc的濃度設(shè)定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。
1.2.2 5-aza-dc對細(xì)胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)反應(yīng)儀測492 nm處的OD值。
1.2.3 5-aza-dc對細(xì)胞形態(tài)的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.4 5-aza-dc對細(xì)胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細(xì)胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細(xì)胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數(shù)量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數(shù)目。
1.2.5 5-aza-dc對細(xì)胞凋亡的影響
1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養(yǎng)液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。
2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細(xì)胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
1.3 數(shù)據(jù)分析
試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數(shù)據(jù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 5-aza-dc對細(xì)胞活率的影響
由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養(yǎng)延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后的細(xì)胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續(xù)試驗(yàn)中細(xì)胞均處理72 h。
2.2 5-aza-dc對細(xì)胞形態(tài)的影響
由圖1可知，未經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，接觸緊密，細(xì)胞大小均一，生長速度較快。而經(jīng)過5-aza-dc處理后的細(xì)胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細(xì)胞變得細(xì)長，生長緩慢，細(xì)胞間隙增大，形態(tài)不規(guī)則，甚至有的地方細(xì)胞大片脫壁死亡。
2.3 5-aza-dc對細(xì)胞染色體的影響
采用常規(guī)核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，每個(gè)處理組選取50個(gè)分散較好的清晰分裂相，統(tǒng)計(jì)畸變?nèi)旧w概率。由圖2可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，染色體畸變率對照組與其他兩組差異不顯著；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)染色體畸變率顯著增加，出現(xiàn)多倍體（圖3）。當(dāng)濃度達(dá)到0.1 μmol/L時(shí)，染色體畸變率達(dá)到12%。
2.4 5-aza-dc對細(xì)胞凋亡的影響
2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細(xì)胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。當(dāng)濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞；濃度為0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，死細(xì)胞數(shù)目也增多。如圖4所示。
2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測細(xì)胞凋亡 由圖5可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，細(xì)胞無拖帶現(xiàn)象，說明無凋亡細(xì)胞；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，說明出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞大量凋亡，拖帶現(xiàn)象明顯。
3 討論
3.1 5-aza-dc對細(xì)胞活率、細(xì)胞形態(tài)的影響
5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF），發(fā)現(xiàn)不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長，較高濃度的5-aza-dc處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和染色體的倍性發(fā)生改變。Enright等[8]對供體成纖維細(xì)胞進(jìn)行5-aza-dc處理后發(fā)現(xiàn)高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細(xì)胞甲基化水平，其研究也發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理72 h為最佳處理時(shí)間。鑒于5-aza-dc對細(xì)胞的毒性作用，本試驗(yàn)采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明，經(jīng)5-aza-dc處理后的細(xì)胞生長速度、形態(tài)等與對照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞對5-aza-dc具有較強(qiáng)的耐受性。但是隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞形態(tài)改變、死亡數(shù)增多，逐漸出現(xiàn)脫壁等現(xiàn)象，這可能是與5-aza-dc對細(xì)胞的毒性有關(guān)。這與Kumar等[7]的試驗(yàn)結(jié)果一致。
3.2 5-aza-dc對細(xì)胞染色體的影響
有研究證明，供體細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境以及藥物等處理會(huì)導(dǎo)致其染色體異常，進(jìn)而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細(xì)胞的染色體還是必要的[9]。本試驗(yàn)使用常規(guī)染色體核型分析方法，即經(jīng)低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標(biāo)本。結(jié)果表明，高濃度的5-aza-dc對細(xì)胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現(xiàn)異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證高濃度的5-aza-dc對染色體的影響，可見明顯的拖帶現(xiàn)象，分析原因可能是染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如斷裂等。
3.3 5-aza-dc對細(xì)胞凋亡的影響
PI、Hochest33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期凋亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞72 h后，觀察不同的濃度對細(xì)胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞均可被Hochest33342著色，但是正常細(xì)胞核的Hochest33342著色的形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒；而凋亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮藍(lán)色，或核呈分葉，碎片狀。細(xì)胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活，細(xì)胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對這些片段應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。凋亡細(xì)胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現(xiàn)明顯的拖帶現(xiàn)象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現(xiàn)象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對照組相比細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加。此結(jié)果進(jìn)一步證明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細(xì)胞適宜時(shí)間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)有所改變，接觸不緊密。當(dāng)濃度升高到0.100 μmol/L時(shí)大片細(xì)胞脫壁死亡；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對染色體核型的影響與對照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對細(xì)胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對細(xì)胞有一定毒性作用，但是低濃度對細(xì)胞影響較小，可以應(yīng)用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體成纖維細(xì)胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，又可以降低供體細(xì)胞核的甲基化狀態(tài)的方法，從而提供一種提高體細(xì)胞核移植效率的方法。
參考文獻(xiàn)：
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細(xì)胞生物學(xué)特性范文第2篇
[關(guān)鍵詞] 骨髓; 間充質(zhì)干細(xì)胞; 兔; 細(xì)胞培養(yǎng)
[中圖分類號(hào)] R329.2+8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)05-29-03
Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro
LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1
1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China
[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.
[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture
骨髓基質(zhì)中存在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多向分化潛能,是組織工程學(xué)技術(shù)的重要的種子細(xì)胞[1]。目前,國內(nèi)外已分離培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),但尚無統(tǒng)一的分離培養(yǎng)方案。雖然有多種MSCs的分離方法,但密度梯度離心法和貼壁分離法是目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最常用的分離培養(yǎng)方法。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心分離法與貼壁分離法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),并比較分析這兩種分離法對MSC生物學(xué)特性的影響,為選擇對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單的MSCs分離方法提供理論指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均為國產(chǎn)分析純試劑。碘化丙啶、噻唑藍(lán)和二甲基亞砜均為SIGMA產(chǎn)品,Percoll為Pharmacia公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白兔12只,體重2kg左右,雌雄隨機(jī),動(dòng)物飼養(yǎng)條件為25℃,濕度60%~ 70%。
1.2 方法
1.2.1 骨髓細(xì)胞的制備 用3%戊巴比妥鈉將兔全身麻醉,用脫毛劑脫去兔后下肢的毛發(fā),用3%的碘酊和75%酒精徹底消毒兔后下肢后移入工作臺(tái),鋪無菌巾,解剖出脛骨上、下端,用骨鉆分別在脛骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7號(hào)針頭刺入兩側(cè)骨端的骨孔內(nèi),用加有肝素的DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔,收集骨髓細(xì)胞懸浮液備用。
1.2.2 離心分離法制備MSCs 將骨髓細(xì)胞懸浮液貼壁加入到預(yù)置等體積1.077g/L的Percoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,2000r/min離心20min。吸取中間乳白色的界面層,與5倍體積的生理鹽水混勻后1000r/min離心5min,除去殘留的Percoll成分。用磷酸鹽緩沖液洗滌1次,然后均采用F12-DMEM 培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1的進(jìn)口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素)重懸細(xì)胞,按1×105的密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中,37℃、0.05%的CO2飽和濕度下培養(yǎng),3d后首次更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細(xì)胞,此后2~3d換液1次。
1.2.3 貼壁分離法制備MSCs 將骨髓沖洗液放入平皿,再抽出平皿中液體對髓腔進(jìn)行二、三次沖洗。用吸管反復(fù)吹打呈單細(xì)胞懸液,每個(gè)脛骨的骨髓單細(xì)胞懸液經(jīng)接種入一個(gè)25mL培養(yǎng)瓶中,于37℃ 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱飽和濕度培養(yǎng),5d后首次更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細(xì)胞,此后每三四天換液1次。
1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
在倒置顯微鏡下,每天觀察貼壁分離培養(yǎng)、密度梯度離心培養(yǎng)條件下的原代及傳代細(xì)胞的生長情況和活體形態(tài)特征。MSCs活力測定取1～3代傳代細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以0.4% 臺(tái)盼藍(lán)作為染色劑,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,共3次,取3次平均值,計(jì)算細(xì)胞活力:活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))×100。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按2×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。分別于接種后第2,3,4,5,6,7天收集4個(gè)復(fù)孔細(xì)胞(注:原代培養(yǎng)細(xì)胞于接種后4d換液時(shí)開始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長曲線。取MSCs按2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi),從接種后第2天起,每日隨機(jī)收集4個(gè)復(fù)孔細(xì)胞用計(jì)數(shù),取均數(shù)描記生長曲線。
1.4 MSCs傳代培養(yǎng)
原代細(xì)胞長滿單層后,即可進(jìn)行傳代,首先棄去培養(yǎng)液,用CMF-PBS液洗細(xì)胞兩次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)約1mL,消化約5min,倒置顯微鏡下證實(shí)細(xì)胞已完全分離(此時(shí)鏡下可見細(xì)胞呈圓球形),加入4mL含血清培養(yǎng)基,反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,離心并用無血清培養(yǎng)基洗滌1次后重新加入含血清培養(yǎng)基計(jì)數(shù),按所需密度傳代培養(yǎng)或冷藏。
1.5 MSCs細(xì)胞的HE、Gimas染色及細(xì)胞骨架制備
Gimas及HE染色采用文獻(xiàn)報(bào)道方法,細(xì)胞骨架制備按參考文獻(xiàn)[2]方法。
1.6 MSCs流式細(xì)胞儀觀察制樣
按文獻(xiàn)[2]的方法制備觀察樣本,用流式細(xì)胞光度計(jì)(FCM)檢測,采用激發(fā)波長為488nm的氬離子激光,DNA被PI著色成紅色熒光,蛋白質(zhì)被FITC著色成綠色熒光,打印出各組細(xì)胞周期所占百分比,計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index,PIX)衡量細(xì)胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。兩組檢測數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示,各項(xiàng)指標(biāo)差異顯著性用t 檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
2.1.1 密度梯度離心法 細(xì)胞培養(yǎng)24h后,均可見大圓形細(xì)胞與少量小圓形細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,4d首次換液后可見少量細(xì)胞呈短梭形、多角形細(xì)胞及三角形,培養(yǎng)到12~14d細(xì)胞增殖鋪滿至80%左右,15~16d細(xì)胞增殖逐漸匯合成單層細(xì)胞。傳代后至第3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)較均勻,呈長梭形集落狀分布。
2.1.2 貼壁分離法 細(xì)胞培養(yǎng)24h后,均可見數(shù)目較多的小圓形細(xì)胞、血細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。4d時(shí)首次換液后可見到梭形、多角形細(xì)胞及三角形的貼壁細(xì)胞;第7~ 8天可見這些細(xì)胞呈集落樣分布;至第10~12天細(xì)胞增殖鋪滿至80%左右,14~15d時(shí)增殖逐漸匯合成單層細(xì)胞。Gimas 染色可見細(xì)胞核為紫紅色,圓形或橢圓形,鏡下可見分裂相細(xì)胞,兩種分離方法未見不同。(圖1)
2.2 細(xì)胞活性檢測
密度梯度離心法:活細(xì)胞率為96.2%,貼壁分離法:活細(xì)胞率為98.7%,組間比較差異無顯著性(P>0.05)。
2.3 細(xì)胞生長曲線
見圖4,應(yīng)用密度梯度離心法與貼壁分離法第1代細(xì)胞生長曲線測定結(jié)果是密度梯度離心法的MSCs生長期比貼壁分離法MSCs的生長曲線延遲1~2d。第2、3代細(xì)胞生長曲線測定結(jié)果,細(xì)胞生長曲線基本相似,在培養(yǎng)1d時(shí),細(xì)胞量稍有減少;第2天開始至第6天,細(xì)胞呈指數(shù)生長,細(xì)胞數(shù)迅速增長,7d進(jìn)入平臺(tái)期,此后細(xì)胞數(shù)目無顯著改變,細(xì)胞增殖減慢(圖2)。
2.4 培養(yǎng)MSCs細(xì)胞骨架觀察
鏡下可見細(xì)胞骨架主要結(jié)構(gòu)形式為環(huán)形排列,貫以輻射狀微管組成圓形蜘蛛網(wǎng)形,細(xì)胞間有角形的突起。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增大,細(xì)胞骨架逐漸過渡到以梭形細(xì)胞骨架為主要形式(圖3)。
2.5 培養(yǎng)MSCs的細(xì)胞周期
第3代MSCs培養(yǎng)72h后,經(jīng)PI和FITC雙染在流式細(xì)胞儀下觀察分析可見細(xì)胞增殖活躍,細(xì)胞蛋白質(zhì)含量較豐富。貼壁法MSC:G1期細(xì)胞為67.5%,G2期細(xì)胞為28.9%,S期細(xì)胞為3.6%,細(xì)胞增殖指數(shù)為(PIX)32.5%,離心法MSC:G1期細(xì)胞為68.2%,G2期細(xì)胞為28.1%,S期細(xì)胞為3.7%,細(xì)胞增殖指數(shù)為(PIX)31.8%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析貼壁法和離心法MSC的PIX差別無意義(表1)。
3 討論
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細(xì)胞之一,在適當(dāng)?shù)臈l件下,可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞[3-7]。獲得大量高純度的MSCs是將MSCs用于研究或臨床治療的基礎(chǔ),目前用于分離MSCs的方法主要有貼壁分離法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠分離法。其中后兩者由于所需儀器昂貴、對MSCs損傷較大加之骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尚未發(fā)現(xiàn)其特有的表面標(biāo)志,故較少應(yīng)用[3]。目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。
本實(shí)驗(yàn)采用貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,隨著細(xì)胞傳代,去除其它可貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞,傳過三代后細(xì)胞形態(tài)趨向一致,獲得較為純化的梭形成纖維樣細(xì)胞(MSCs)。應(yīng)用密度梯度離心法在原代培養(yǎng)獲得的細(xì)胞,仍需用貼壁法進(jìn)一步純化,并且其操作步驟復(fù)雜,離心過程中不可避免地造成細(xì)胞損失或損傷,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的活性和生長曲線都遲于貼壁法分離的MSCs,而且MSCs貼壁所需的時(shí)間較貼壁分離法長,這可能與離心過程中丟失了骨髓微環(huán)境中對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長有利的細(xì)胞因子和促貼附物質(zhì)有關(guān)。原代培養(yǎng)中可見離心法的MSCs純度較貼壁法的MSCs大,但隨著細(xì)胞的傳代,兩者之間的差別逐漸消失。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用離心分離法與貼壁分離法經(jīng)過傳代都可獲得活性好、形態(tài)均一的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,但在實(shí)驗(yàn)過程中要避免軟組織的細(xì)胞污染沖洗出的骨髓細(xì)胞,對所用試劑盡量做到現(xiàn)用現(xiàn)配。同時(shí)應(yīng)用離心分離法時(shí)應(yīng)注意時(shí)間不能過長,離心力不能過大,盡量減少細(xì)胞的損傷。本研究揭示雖然密度梯度離心法理論上可在原代獲得較純化的細(xì)胞,但仍需用貼壁法進(jìn)一步純化,而且容易發(fā)生細(xì)胞污染和損傷等,因此其并不具有明顯優(yōu)勢,相反貼壁分離法具有方法簡單、細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)。
總之,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的兩種方法均可獲得可靠的MSCs。對原代培養(yǎng)的MSCs,貼壁分離法具有對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單等優(yōu)點(diǎn),但其MSCs純度較離心分離法稍低。經(jīng)過多次傳代后采用兩種方法所獲得的MSCs的生物學(xué)特性已無區(qū)別,均可獲得具有良好的活性的MSCs。
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細(xì)胞生物學(xué)特性范文第3篇
關(guān)鍵詞: 成纖維細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng)
摘 要:目的 探討來自正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織的成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性. 方法 對三種組織均采用組織塊法進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng)，采用胰蛋白酶消化傳代，分別利用繪制細(xì)胞生長曲線，3 H-胸腺嘧啶摻入及3 H-脯氨酸摻入等方法觀察細(xì)胞的增殖，DNA合成代謝及膠原合成等情況，并比較它們之間的差異. 結(jié)果 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在細(xì)胞增殖、DNA合成代謝及膠原合成量等方面均明顯高于正常皮膚及增生性瘢痕組織來源的成纖維細(xì)胞，后兩者之間有一定區(qū)別但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 結(jié)論 不同組織來源的成纖維細(xì)胞其生物學(xué)行為亦有所區(qū)別，因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)有一定的針對性.
Keywords:fibroblasts;cell culture
Abstract:AIM To investigate the biological characteristics of fibroblasts derived from normal human dermal，hyper-trophic scar and keloid tissues.METHODS Fibroblasts pri-mary culture was carried out by the assay of planting tiny tis-sue masses into culture bottles.The fibroblasts，after being isolated from different tissues，were cultivated and the cell growth curves were drawn.Meanwhile，3 H-TdR and3 H-pro-line incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively.RESULTS Keloid fibroblasts had a much more active bio-logical characteristic than that of the other two kinds of fibroblasts.There was a slight difference between the normal dermal fibroblasts and hypertrophic scar ones.CONCLUSION Fibroblasts derived from different tissues have their own biological characteristics.This makes it necessary for us to do the research on different tissues with different fibrob-lasts.
0 引言
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩常見于燒傷或皮膚外傷愈后，是機(jī)體組織異常修復(fù)的結(jié)果.在臨床上輕者可影響美觀，重者可導(dǎo)致鄰近器官的功能障礙甚至畸形，這些均直接影響患者的生活質(zhì)量［1］ .研究證實(shí)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成主要是由于組織在修復(fù)過程中成纖維細(xì)胞的活動(dòng)異常增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量的Ⅰ型膠原、蛋白聚糖及纖維粘連蛋白等基質(zhì)成分并使之沉積所致［2，3］ .對于這種疾病目前臨床上尚缺乏有效的治療手段，實(shí)驗(yàn)研究則由于缺乏理想的動(dòng)物模型而受到很大的限制，因此我們通過該實(shí)驗(yàn)初步探討不同組織來源的成纖維細(xì)胞的生物學(xué)區(qū)別.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均購自Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司，3 H-TdR及3 H-脯氨酸購自中科院原子能物理研究所，MTT購自華美生物工程公司.
1.2 方法 正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織均來自外科手術(shù)后所切除標(biāo)本，所培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞分別命名為正常皮膚成纖維細(xì)胞（normal skin fi-broblast，NsFb）、增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hyper-trophic scar fibroblast，HTsFb）及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblast，KFb）.標(biāo)本剪去表皮及皮下組織，在小瓶中剪成碎組織塊（0.5mm×0.5mm×0.5mm），接種于25mL培養(yǎng)瓶中，37.0℃，50mL L-1 CO2 孵箱中孵育4～6h后加入含100mL L-1 小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，2～3d換液1次，待細(xì)胞長出后即為原代成纖維細(xì)胞.當(dāng)原代成纖維細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10mL L-1 小牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，按1 3傳代，實(shí)驗(yàn)用第3～6代. 1.3 觀測指標(biāo) ①細(xì)胞增殖.計(jì)數(shù)法:將三種細(xì)胞取相同代數(shù)并于其對數(shù)生長期時(shí)同時(shí)消化并制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106 L-1 ，將細(xì)胞按1mL/孔接種48孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞設(shè)1個(gè)復(fù)孔，共設(shè)12組.置孵箱培養(yǎng)24h后以2.5g L-1 胰蛋白酶消化第一組細(xì)胞并以胎盼藍(lán)做活細(xì)胞染色，在鏡下計(jì)數(shù)，此后每日于相同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測量12d，依所得數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞數(shù)-時(shí)間的細(xì)胞生長曲線.四唑鹽（MTT）比色法:同上法接種細(xì)胞并于24h后將第一組細(xì)胞每孔加入80μL MTT（20g L-1 ），繼續(xù)孵育4h后棄去上清，再每孔加入0.5mL二甲基亞砜，振蕩30min后選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定個(gè)孔的吸光度，此后每日于相同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測量12d并繪制吸光度值-時(shí)間的細(xì)胞生長曲線.②細(xì)胞DNA合成的測定.胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，為DNA合成所必需，因此用同位素3 H標(biāo)記TdR即3 H-TdR作為DNA合成的前體能摻入其合成代謝過程，通過檢測細(xì)胞放射性強(qiáng)度可以反映出細(xì)胞DNA的代謝情況.接種細(xì)胞于48孔板，每種細(xì)胞設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104 ，于接種后24h換液并每孔加入1μci3 H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)12h后棄培養(yǎng)基，用37℃PBS緩沖液沖洗培養(yǎng)板10次，風(fēng)干后每孔加入2mol L-1 NaOH200μL，室溫放置30min，鏡下觀察細(xì)胞完全溶解后將各孔溶液分別收集于纖維濾紙上，于Beckman LS-6500型液閃計(jì)數(shù)儀上測定cpm值.③細(xì)胞膠原合成的測定.脯氨酸是成纖維細(xì)胞合成膠原所必需的氨基酸之一，因此3 H-脯氨酸作為膠原合成的前體能摻入其合成代謝過程.同上法接種細(xì)胞于48孔板，于接種后12h換液，繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行3 H-脯氨酸摻入:配制β-氨基丙腈，L-維生素C，3 H-脯氨酸混合液，終濃度分別為100g L-1 ，50g L-1 ，10ci L-1 ，按每孔100μL進(jìn)行摻入，孵育24h后收集并進(jìn)行cpm值測定.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x ±s表示，應(yīng)用Origin軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn).
2 結(jié)果
2.1 原代成纖維細(xì)胞的生長 結(jié)果表明，KFb游出組織塊的速度明顯快于NsFb及HTsFb（P
圖1 －圖3 略
2.2 細(xì)胞的增殖 細(xì)胞記數(shù)法與MTT比色法均顯示，KFb的生長增殖明顯較NsFb與HTsFb快，表現(xiàn)為進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間短而持續(xù)時(shí)間長且沒有明顯的平臺(tái)期;HTsFb的增殖較NsFb略慢，但基本趨勢一致，無明顯區(qū)別（Fig4）.
2.3 細(xì)胞的DNA代謝及膠原合成 結(jié)果表明，KFb的DNA合成量及膠原合成量均明顯高于NsFb與HTsFb（P
3 討論
燒傷及皮膚損傷是臨床上較常見的病種，其損傷后的愈合過程是一系列修復(fù)細(xì)胞如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等與細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞生長因子共同作用的結(jié)果，其中成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)構(gòu)成了創(chuàng)面愈合與瘢痕形成的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，因此目 前國內(nèi)外在研究增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的形成機(jī)制時(shí)主要將目光集中于成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為及其相關(guān)因素的研究方面［4-6］ .
從皮膚組織中獲取成纖維細(xì)胞的方法有消化法和組織塊法兩種，消化法又分為胰酶消化法及膠原酶消化法，由于消化法易受組織塊的來源、大小、酶作用的時(shí)間和溫度等多方面因素的影響［7］ ，因此在本實(shí)驗(yàn)中對三種組織我們均采用組織塊法進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng).人體成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)情況下一般能存活一年左右，能繼續(xù)培養(yǎng)50代，用于實(shí)驗(yàn)時(shí)國外學(xué)者多采用3～10代［8，9］ 處于對數(shù)生長期的細(xì)胞.
我們首先通過組織塊培養(yǎng)法對正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)它們在細(xì)胞游出及生長方面均存在著一定的差異，其中瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表現(xiàn)最為活躍.其次在細(xì)胞的繼代培養(yǎng)研究中，我們通過比較它們在生長增殖、DNA代謝及膠原合成等方面的區(qū)別，進(jìn)一步證實(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能遠(yuǎn)較其他兩種成纖維細(xì)胞活躍，這與臨床上這三者的區(qū)別是一致的.來自增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞之間雖有一定區(qū)別但差異不明顯，這可能是臨床上增生性瘢痕在晚期發(fā)生退化的原因之一.
綜上所述，我們的研究在一定程度上揭示了不同組織來源的成纖維細(xì)胞在生物學(xué)特性上的差異，同時(shí)說明在進(jìn)行相應(yīng)研究時(shí)應(yīng)有一定的針對性.
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細(xì)胞生物學(xué)特性范文第4篇
【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);表面抗原
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.03.005
In vitro culture ofmarrow stroma cell and its biological characteristics WANG Xiang-yi， LI Ji-shen， LIU Fu-quan， et al. Department of Neurosurgery， The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Baotou 014010， China
【Abstract】 Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells （BMSCs） of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics. Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae， and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte， and multiple liquid purification. Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope. Cell surface markers CD29， CD34， CD45， and CD105 in the third and sixth generation were tested by flow cytometer. Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate， there were several spindle-shaped cells. After 6～8 d， cells were in colony. After passage， cellular morphology tended to be conform and swirling. Flow cytometer showed that CD34 and CD45 were positive， while CD29 and CD105 were negative. Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.
【Key words】 Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen
細(xì)胞移植開辟了一條治療腦損傷后遺癥的途徑， 目前發(fā)現(xiàn)BMSCs植入后會(huì)改變損傷區(qū)的局部環(huán)境， 通過自分泌和旁分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來保證自身的存活和促發(fā)內(nèi)源修復(fù)[1]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是成體干細(xì)胞，與其他的干細(xì)胞相比有顯著的優(yōu)越性，是細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞之一。由于骨髓中細(xì)胞成分比較混雜， BMSCs在骨髓中含量極少， 僅占骨髓中有核細(xì)胞的 0.001%～0.01%， 實(shí)際應(yīng)用中需對其進(jìn)行體外分離純化并大量擴(kuò)增[2]。本實(shí)驗(yàn)對人BMSCs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)， 并對培養(yǎng)細(xì)胞的表面抗原進(jìn)行測定， 為臨床應(yīng)用提供足量有活性的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。現(xiàn)報(bào)告如下。
1 材料與方法
1. 1 主要試劑與設(shè)備 淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque （1.077 g/ml， 上海試劑二廠）， DMEM/F12培養(yǎng)基 （Gibco）， 胰蛋白酶（Gibco）， 胎牛血清（Hyclone）， 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105（Immunotech）， Caliber 流式細(xì)胞儀（BD公司）、倒置相差顯微鏡（Nikon）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（Heraeus）， 低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。
1. 2 方法
1. 2. 1 BMSCs獲得和培養(yǎng) 骨髓來源：病例1， 54歲， 男， 高血壓腦出血患者， 行髂骨嵴骨髓穿刺獲得， 無菌抽取， 肝素抗凝的骨髓中加入等體積的無鈣鎂磷酸緩沖液， Ficoll分離， 取單個(gè)核細(xì)胞層， 用無鈣鎂磷酸緩沖液洗滌2次， DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌1次， 以1×106/ml的細(xì)胞密度接種， 用含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)， 第1次72 h后更換新鮮培養(yǎng)基， 去除未貼壁細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)， 后每3～4天換液1次， 以去除未貼壁細(xì)胞。連續(xù)培養(yǎng)2周后， 當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞貼壁約80%時(shí)， 按照1：2比例傳代。通過傳代， 對BMSCs進(jìn)行純化和擴(kuò)增， 取第3、6代的細(xì)胞用于流式檢測。體外培養(yǎng)的BMSCs采用倒置相差顯微鏡， 逐日觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)特征。
1. 2. 2 BMSCs表面抗原檢測 采用直接免疫熒光染色流式細(xì)胞術(shù)， 測定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。
2 結(jié)果
2. 1 體外培養(yǎng) BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下， 剛接種的骨髓懸液中含有大量懸浮細(xì)胞， 無細(xì)胞貼壁;48 h后， 發(fā)現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞貼壁， 呈梭形。72 h后換液， 將未貼壁細(xì)胞棄去。貼壁細(xì)胞呈克隆性生長， 細(xì)胞增殖后形態(tài)多樣， 呈異質(zhì)性， 以長梭形細(xì)胞為主， 亦可見三角形、多角形及扁圓形細(xì)胞。6～8 d后細(xì)胞形成集落。傳代后， 細(xì)胞形態(tài)趨于一致， 呈長梭形， 細(xì)胞排列緊密， 可成漩渦狀。見圖1。細(xì)胞傳至第12代時(shí)， 胞漿內(nèi)顆粒物增多， 細(xì)胞折光性變差， 提示細(xì)胞活力變?nèi)酰?增殖能力減弱。
2. 2 BMSCs細(xì)胞表面抗原檢測結(jié)果 流式細(xì)胞儀分析 BMSCs表面抗原， 流式細(xì)胞儀檢測顯示CD34、CD45陰性為非造血細(xì)胞， 且表達(dá)率在3代時(shí)（2.52%、2.07%）%較6代時(shí)（0.32%、0.14%）高， 說明第6代幾乎為純基質(zhì)細(xì)胞。而CD29、CD105陽性說明BMSCs較為幼稚， 且3代和6代數(shù)值無差異。
3 討論
研究已明確BMSCs是成體干細(xì)胞的一種， 但細(xì)胞成分不單一， 有可能包含不同分化階段的前體細(xì)胞的混合物[2， 3]。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潛能， 在體外經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為骨、軟骨、脂肪組織、神經(jīng)組織及肝組織等。由于骨髓來源豐富， 取材方便， 創(chuàng)傷小， 在組織再生和損傷修復(fù)中有很好的臨床應(yīng)用前景[1]。
BMSCs廣泛存在于胎兒和成人的各種組織和臟器中， 骨髓組織中含量最為豐富， 為了獲取種子細(xì)胞， 目前用于分離骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度離心法;流式細(xì)胞儀分選法;貼壁培養(yǎng)法;免疫磁珠分選法。作者用密度梯度分離聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行了BMSCs的分離和培養(yǎng)， 其操作簡單， 經(jīng)多次傳代可獲得足夠量的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測顯示CD34、CD45均陰性， 傳3代時(shí)表達(dá)率分別為2.52%和2.07%， 較6代時(shí)0.32%和0.14%高， 說明第6代幾乎為純基質(zhì)細(xì)胞。
研究表明BMSCs的表面標(biāo)志尚無特異性表面標(biāo)志表達(dá)， 部分與間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志有關(guān)[4-6]。主要包括：①粘附分子， 如CD44等。②生長因子和細(xì)胞因子受體， 如IL受體3、4、6、7， 干擾素γ受體等。③整合素家族成員， 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。實(shí)驗(yàn)選用的標(biāo)記物也符合鑒定BMSCs通用標(biāo)志物， 因此， 本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞符合BMSCs的免疫表型。
BMSCs具有多向分化潛能， 在細(xì)胞移植和基因治療方面有重要優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)成功對BMSCs 進(jìn)行分離、純化及培養(yǎng)， 為深入研究 BMSCs 的組織再生和修復(fù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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細(xì)胞生物學(xué)特性范文第5篇
原癌基因和抑癌基因所編碼的蛋白存在于細(xì)胞的各個(gè)組成部分中，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞膜。通過對原癌和抑癌基因蛋白結(jié)構(gòu)和功能的分析，發(fā)現(xiàn)許多原癌基因和抑癌基因位于信號(hào)通路中的不同部位，參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)過程，如細(xì)胞生長和分化、DNA復(fù)制和損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控等，在細(xì)胞凋亡、衰老過程中起重要作用，也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成員之一，具有抗細(xì)胞凋亡作用，并明顯地在腫瘤組織異性表達(dá)。目前的研究表明， Livin基因在各系統(tǒng)的正常組織中很少表達(dá)，但在胚胎組織或發(fā)育組織、淋巴細(xì)胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種組織中廣泛表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的腫瘤細(xì)胞系中也有Livin基因的表達(dá)，但其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性等之間的確切關(guān)系尚不清楚。Livin基因特異性地表達(dá)于腫瘤組織，有可能成為NSCLC早期診斷的分子標(biāo)志物，并為基因治療提供新靶點(diǎn)［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表達(dá)及其抗細(xì)胞凋亡作用、信號(hào)傳導(dǎo)途徑與調(diào)節(jié)機(jī)制等分子生物學(xué)特性作一綜述。
1 Livin基因及蛋白結(jié)構(gòu)功能的多樣性
IAP是一類重要的抗細(xì)胞凋亡因子，其共同的結(jié)構(gòu)特征是N端含有一個(gè)或多個(gè)(最多為3個(gè))串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain，RING)。目前已發(fā)現(xiàn)人類IAP家族有8個(gè)成員，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。
Livin蛋白是IAP家族的一個(gè)新成員，一些實(shí)驗(yàn)室采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法，分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到Livin核苷酸序列，從不同的組織中發(fā)現(xiàn)了Livin基因的表達(dá)。Kasof等［3］在發(fā)育組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)并命名了Livin基因。Lin等［4］從人胎腎cDNA文庫中分離到該基因，故稱其為KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］發(fā)現(xiàn)Livin基因在G361 和 SKMel29兩種黑色素瘤細(xì)胞源株中高表達(dá)，將其命名為MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］發(fā)現(xiàn)了該基因存在2個(gè)剪接變異體（isoforms），分別命名為Livin α和Livin β。 同時(shí)，Lin等［4］用熒光原位雜交方法確定Livin基因位于人20號(hào)染色體20q13.3區(qū)域，全長4.6 kb，包含7個(gè)外顯子。此外還發(fā)現(xiàn)存在長約2.2，2.8和4.0 kb的轉(zhuǎn)錄子，Livin蛋白N端僅包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)α螺旋和一個(gè)三股抗平行 β片層，與相應(yīng)的氨基酸殘基共同構(gòu)成疏水核心。C端含有一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)［4，6］，氨基酸殘基C124，C127，H44及C151與鋅原子結(jié)合，借以穩(wěn)定整個(gè)重疊結(jié)構(gòu)。
Livin蛋白有α和β兩種變異體，分別由298和280個(gè)氨基酸組成，二者相差18個(gè)氨基酸，此區(qū)域由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5′端54 bp的基因序列編碼。Livin蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，但Kasof等［3］認(rèn)為livin蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布與Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞質(zhì)內(nèi)呈絲狀表達(dá)，同時(shí)也表達(dá)于胞核，并認(rèn)為livin蛋白 C末端的RING結(jié)構(gòu)對介導(dǎo)其在亞細(xì)胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)多腺苷酸化與存在未剪接加工成熟的前體RNA有關(guān)，不同的剪輯有不同的變異體及亞型，這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有可能解釋Livin基因蛋白存在多個(gè)結(jié)構(gòu)功能。如BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個(gè)氨基酸的突變就能發(fā)揮其抗凋亡作用，作者的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中表達(dá)的Livin 蛋白缺少66個(gè)核苷酸的變異體，其確切的功能意義尚不清楚。但Livin基因蛋白結(jié)構(gòu)的變化與其功能的多樣性存在明顯的相關(guān)性。
2 Livin基因在NSCLC中的表達(dá)
Livin基因僅在少數(shù)正常組織中表達(dá)，各家報(bào)道的研究結(jié)果存在較大差異，目前還不能確定Livin基因在人正常組織中的表達(dá)譜及其生理意義［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法對15例正常肺組織和38例NSCLC組織作對比研究，發(fā)現(xiàn)Livin mRNA在NSCLC組織陽性率為73.6%，正常肺組織陽性率為6.7%，顯示Livin基因在NSCLC中呈高表達(dá)，同時(shí)證明Livin基因與Survivin基因在NSCLC中的表達(dá)并不相關(guān)。CrnkovicMertens 等［1，8］同時(shí)采用NSCLC組織和NSCLC源 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng)檢測Livin基因及其兩種異構(gòu)體Livin α和Livin β的表達(dá)，結(jié)果顯示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表達(dá)。采用RNAi技術(shù)分別使異構(gòu)體基因沉默，發(fā)現(xiàn)Livin β和Livin α基因的功能意義不完全相同， Livin β在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。國內(nèi)崔肅等［9］采用RTPCR法檢測NSCLC組織中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表達(dá)，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示45例NSCLC組織中Livin mRNA表達(dá)陽性率為71.1％，兩種異構(gòu)體基本同時(shí)表達(dá)，Livin β mRNA的表達(dá)量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺組織和肺良性瘤樣病變組織呈低表達(dá)，陽性率分別為5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表達(dá)陽性標(biāo)本中均能檢測到Livin蛋白表達(dá)。陳淼等［10］采用免疫組織化學(xué)(SABC)的方法檢測Livin蛋白在40例NSCLC組織以及12例正常和肺良性疾病組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示22例腺癌和18例鱗癌組織中的Livin蛋白陽性率分別為45.5﹪和50.0﹪，而正常肺組織和肺良性疾病組織均未檢出Livin蛋白表達(dá)。他們同時(shí)觀察到不同分化程度NSCLC組織之間Livin蛋白的表達(dá)無顯著性差異。有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中Livin蛋白表達(dá)的陽性率分別為72.7﹪和11.1﹪，兩組的顯著性差異標(biāo)志著不同的生物學(xué)特性。孫建國等［11］ 的研究結(jié)果顯示，48例NSCLC組織中Livin mRNA表達(dá)陽性率為22.9%，其表達(dá)與NSCLC組織學(xué)類型相關(guān)，腺癌中Livin mRNA表達(dá)陽性率達(dá)45.5%，明顯高于鱗癌和大細(xì)胞癌，而癌旁組織和肺良性疾病組織均未檢出陽性結(jié)果，而且Livin 蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)相一致。研究還發(fā)現(xiàn)放、化療后NSCLC組織中的Livin表達(dá)的陽性率為43.5%，顯著高于未放、化療組織，提示放、化療可明顯誘導(dǎo)Livin蛋白的表達(dá)，這可能與臨床上NSCLC對化療藥物和放療耐受有關(guān)。
目前，Livin基因在NSCLC組織異性地高表達(dá)的現(xiàn)象已引起許多學(xué)者的關(guān)注［12］，但Livin mRNA的表達(dá)與NSCLC患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等的相關(guān)關(guān)系尚未完全闡明，Livin基因作為NSCLC的分子標(biāo)志物，成為診斷和治療NSCLC新靶點(diǎn)的可能性已引起人們的極大興趣。
3 Livin抗細(xì)胞凋亡作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制
Kasof等［3，8］研究顯示，Livin蛋白N端的羧基與Caspase3，7，9的直接結(jié)合，阻斷了caspase發(fā)揮凋亡作用的途徑，從而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。將Livin基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可被有效阻斷。Vucic等［13］將Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細(xì)胞，證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。許多化療藥物可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA的損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細(xì)胞可有效對抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是各家報(bào)道Livin α和Livin β蛋白的抗細(xì)胞凋亡作用存在一定差異。Yang等［14，15］觀察在Jurkat T淋巴細(xì)胞株中，Livin基因可明顯抑制由TNFα及抗CD95抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其抗細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于Bcl 2。Livin α對STS誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出一定的抑制作用，而Livin β則無此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干擾技術(shù)分別使內(nèi)源性Livin α和Livin β基因沉默，檢測兩者的抗凋亡作用，結(jié)果顯示Livin β可顯著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外線放射治療（UV irradiation）等誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，但Livin α則不明顯。更多的研究則認(rèn)為Livin α和Livin β基因均具有抗細(xì)胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途徑有待進(jìn)一步證實(shí)。
許多研究證實(shí)［12-16］，Livin蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制存在不同的調(diào)節(jié)途徑，通過與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結(jié)合，抑制其活性。Livin蛋白還可與未加工的或斷裂形式的Caspase 9結(jié)合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、細(xì)胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白與Caspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性，BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個(gè)氨基酸的突變即可導(dǎo)致Livin蛋白與Caspase的結(jié)合作用的減弱或消失，致使Livin蛋白抗細(xì)胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失，這也許可成為基因治療的調(diào)節(jié)點(diǎn)。Sanna 等［12］的研究顯示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但對JNK3無激活作用，而Livin蛋白對JNK1的激活作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于JNK2，并且這是Livin蛋白對抗TNFα和ICE介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的重要途徑之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白對JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號(hào)途徑，而是通過TAB1/TAK1途徑實(shí)現(xiàn)。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身對于JNK1無激活作用，但可促進(jìn)TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。Livin蛋白可與TAB1結(jié)合，并進(jìn)一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］證實(shí)SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可與Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，抑制Livin蛋白與caspase的結(jié)合及其抗細(xì)胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導(dǎo)的對Livin蛋白抗細(xì)胞凋亡作用的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制。
4 Livin基因治療NSCLC的臨床應(yīng)用前景
鑒于Livin基因具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用以及在腫瘤組織中的特異性表達(dá)，人們注意到其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并開始探討Livin用于腫瘤基因治療的可行性。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可獲得穩(wěn)定表達(dá)Livin α和Livin β的NSCLC A549細(xì)胞克隆。孫建國等［17］用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究A549細(xì)胞生長情況，用MTT法檢測其對放、化療的敏感性，用細(xì)胞周期分析法觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Livin α和Livin β基因后的細(xì)胞尤其是表達(dá)Livin α的A549細(xì)胞，克隆形成能力提高、倍增時(shí)間縮短，對多種化療藥物和放射線敏感性降低，10 Gy放射線照射下僅有0.2%細(xì)胞發(fā)生凋亡?？梢?Livin基因參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，也可能是NSCLC細(xì)胞對放、化療耐受的重要機(jī)制之一。
CrnkovicMertens等［18］利用基因轉(zhuǎn)染和特異性小干擾RNA(siRNA)技術(shù)，在肺癌SPCA1細(xì)胞株中建立Livin異構(gòu)體α和β特異的基因沉默體系，觀察誘導(dǎo)SPCA1細(xì)胞凋亡效應(yīng)中的不同作用，并用TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示內(nèi)源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1細(xì)胞克隆形成能力較對照組顯著下降，促使SPCA1細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明Livin α和Livin β兩種異構(gòu)體均能作為誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子靶點(diǎn)，通過使Livin基因沉默的靶向誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡可作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段。
由于Livin基因僅在腫瘤組織表達(dá)而在正常組織極少表達(dá)，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和腫瘤組織中均檢測到自身Livin蛋白抗體，其組織特異性顯而易見。Hariu等［20］ 用Livin反義核苷酸片段刺激周圍淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HLAA24與Livin 7肽具有特殊親和力，Livin蛋白表達(dá)陽性的NSCLC患者可檢測到特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表達(dá)陰性NSCLC患者則測不到CTLs。結(jié)果提示Livin蛋白可成為NSCLC免疫治療的靶點(diǎn)，將Livin 7肽作為免疫制劑具有良好的應(yīng)用前景。
綜上所述，Livin基因是腫瘤細(xì)胞凋亡途徑中的一個(gè)信號(hào)調(diào)節(jié)點(diǎn)，其在NSCLC組織中的特異性表達(dá)為NSCLC的診斷提供了新的分子標(biāo)記物，亦可成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)［21，22］。目前，人們已能在基因水平上干預(yù)因基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病，尤其是以mRNA為靶標(biāo)的反義藥物，可抑制和消除致病基因的表達(dá)，達(dá)到治療的目點(diǎn)。因此，采用反義核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制劑（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治療手段直接阻斷Livin 蛋白與目的分子的結(jié)合，可以促使腫瘤細(xì)胞的凋亡，為NSCLC的治療開辟新的途徑［23，24］。同時(shí)，對NSCLC患者腫瘤組織和外周血免疫細(xì)胞的Livin蛋白（受體）及其mRNA表達(dá)的聯(lián)合檢測，有可能成為NSCLC早期診斷、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的分子標(biāo)記物。
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