動物行為學分析方法
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動物行為學分析方法范文第1篇
關鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺
帕金森病（PD）是常見的中老年人中樞神經系統退行性疾病，其病因及發病機制目前尚不清楚， 研究認為可能與遺傳、環境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應激、過多的自由基形成及神經生長因子缺乏等有關，是多種機制協同作用的結果[1-2]。偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現與人類PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點不同而存有爭議，特別是對損傷早期大鼠行為學方面的觀察比較缺乏。本實驗通過觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學及黑質部位組織學的變化特點，驗證損傷早期PD大鼠模型的穩定性及可靠性。
1資料與方法
1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學實驗動物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購于Sigma公司。
1.2方法
1.2.1實驗動物分組 40只SD大鼠隨機分為三組：①空白對照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個亞組；③假手術組（n=8）。
1.2.2動物模型 模型組大鼠用復合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側前腦內側束（mfb）三維坐標位置，選取mfb區坐標：前囟后2.8 mm，中線左側2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據注射位點確定鉆顱部位，手術刀尖小心鉆開一直徑約2 mm顱骨孔，微量進樣器緩慢進針至靶點，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養。并于24 h、7 d、28 d分別檢測大鼠行為學和組織學的改變。假手術組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對照組不作任何處理。
1.2.3行為學檢測
1.2.3.1跨步調節試驗[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量僅由一側前肢支撐 ，記錄10s內大鼠這一前肢走步次數 ，然后同法檢測另一前肢的情況，以損傷對側前肢行走次數所占比例（損傷對側前肢行走次數/（損傷對側前肢行走次數+損傷側前肢行走次數））為評價指標。
1.2.3.2姿勢不對稱性試驗[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實驗臺上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態， 以其偏離垂直軸不超過10°為垂直位（標準位），記錄大鼠頭或上身左右擺動的情況，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記數為1次。觀察45 s內大鼠頭或身體轉動的方向和次數，以向損傷對側擺動的次數所占比例（損傷對側擺動的次數/（損傷對側擺動的次數+損傷側擺動的次數））為評價指標。
1.2.3.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 模型組分別于術后24 h、7 d、28 d于動物腹腔內注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發大鼠向右側（健側）旋轉，于阿撲嗎啡注射后5 min開始記錄，持續記錄30 min。以24 h誘發旋轉次數210次/30 min為合格模型。
1.2.4組織學檢測
1.2.4.1動物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學檢測后，用復合麻醉劑麻醉，剪開大鼠胸腔，經主動脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發白，流出液基本無色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質組織塊進行冠狀連續冰凍切片，片厚20 μm。
1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內源性過氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋），37℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽性產物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
1.2.4.3 TH陽性神經元記數 各組大鼠取包含黑質致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計數兩側黑質有完整細胞體的TH陽性細胞，計算左側與右側黑質TH陽性細胞數的百分比（左側黑質TH陽性細胞數/右側黑質TH陽性細胞數×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經細胞計數方法進行細胞計數。
1.2.5統計學分析 數據結果均使用 SPSS13.0軟件進行統計學分析。數據資料采用均數±標準差（x±s）表示。單因素方差分析進行差異性檢驗，P
2結果
2.1行為學觀察 對照組及假手術組大鼠經阿撲嗎啡誘發后無旋轉行為，也未出現非藥物誘發的行為學改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數小時即出現損毀側肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側緩慢旋轉，不能進行直線或隨意爬行。
2.1.1跨步調節試驗 對照組及假手術組大鼠兩側前肢10 s內跨步次數基本相同，模型組大鼠在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h跨步調節試驗評分出現有意義減少，7 d及28 d評分進一步減少，見表1。
2.1.2姿勢不對稱試驗 在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，姿勢不對稱試驗結果顯示模型組大鼠頭部和身體出現向右側轉動次數有意義增加，7 d及28 d姿勢不對稱試驗評分進一步增加，對照組及假手術組大鼠頭部和身體向兩側轉動次數大致相同，見表2。
2.1.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發大鼠以右側后肢為支點，首尾相接向右側旋轉，30 min旋轉次數210次/30 min，對照組及假手術組大鼠未誘發出旋轉行為，見表3。
2.2組織學檢測 抗TH染色結果顯示，在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側黑質TH陽性神經元數目出現有意義減少，高倍鏡下見少部分神經元出現胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經軸突斷裂、錯亂；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元幾乎消失，殘留的TH神經元表現出染色質濃縮壞死現象，神經軸突散在稀疏；模型組大鼠右側黑質TH陽性神經元數目同時也有部分減少；對照組及假手術組大鼠兩側黑質TH陽性神經元無明顯改變，見表4，圖1。
3討論
研究PD需要建立穩定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經元毒性物質，具有很強的呼吸鏈抑制作用，偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報道了應用6-OHDA成功制備大鼠偏側PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發下產生旋轉行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動劑，能夠引起該模型向健側旋轉，這是由于損傷側紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現超敏現象[7]，此時應用DA受體激動劑使損傷側興奮作用占優勢而產生向健側旋轉。
PD的神經保護治療需要早期進行，評估6-OHDA損傷早期大鼠行為學變化，可進一步明確模型是否成功及神經保護性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發旋轉試驗結合非藥物誘發的行為學試驗，其評估結果更加有效、可靠[8]。在偏側前腦內側束注射6-OHDA后數小時，大鼠出現肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側不自主旋轉，不能進行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調節試驗和姿勢不對稱試驗出現有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導大鼠在原地向健側旋轉，以健側后肢為支點，首尾相接，形成環狀，但旋轉次數
偏側前腦內側束注射6-OHDA后24 h大鼠出現行為學和組織學方面的變化，為檢測模型的穩定性和可靠性，實驗設立6-OHDA損傷后7d和28d組。結果顯示：大鼠行為學改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發旋轉次數>210次/30 min，符合成功PD模型標準；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元減少90%。偏側前腦內側束注射6-OHDA后，損傷對側有部分DA能神經元丟失，可能與藥物的滲透作用或經血液循環等有關。
綜上所述，通過早期行為學檢測，可為神經保護性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭議。
參考文獻：
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動物行為學分析方法范文第2篇
關鍵詞：銀杏平顫方；MPTP；形態學；行為學；帕金森病；中藥
中圖分類號：R285.5
文獻標識碼：A文章編號：
1673-7717（2008）11-2348-04
Experimental Study on Treatment of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe
and Its Diffrent Combination on the Behavioral Test and Morphology in the Model
Mouse with Parkinson Disease
ZHANG Jun1,LI Qianjun1,SHUN Hongmei1,BAI Limin1,QIU Tingjian3
（1.Guangzhou University of Chinese Medicie,Guangzhou 510120,Guangdong,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Hulin Hospital of TCM,Hulin 158400,Heilongjiang,China）
Abstract：Objective：To investigate the effect and its mechanism of Chinese herb recipe in the treatment of PD，to measure the effect of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe and its three similar prescriptions on the behavioral test and neurons in substantia nigra compacta（SNc）and striatum of model mouse for PD．Methods：The Parkinson’s disease model was established by consecutive administration of MPTP to C57／BL mice． The doses of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe were respectively given for 2 weeks and 4 weeks in the treatment groups. Animals were examined behaviorally with the pole test consecutively. then killed，Taking out the forebrain and striate body were observed in morphology by HE.Results：(1)Ginkgo Biloba Pingchan Recipe(GBPR) and its three similar prescriptions improved the dyskinesia of PD mice and showed different disability in pole the test and decrease of spontaneous motor activity, the model group mice demonstrated dyskinesia, scores obtained from the behavioral test were increased significantly compared with Normal control group. While the scores in treatment groups showed a marked decrease to some degree (allP0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in model group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons．
Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinson’s disease；Chinese medicine
帕金森病又稱震顫麻痹，是一種好發于中老年人[1]的多巴胺能神經元功能降低引起的錐體外系慢性病，現在多數學者認為與氧化應激－自由基有關[2-3]。原發性帕金森病的主要臨床癥狀和體征為靜止性震顫、肌強直、少動和障礙。有時可出現面目呆滯、發音低、書寫字體過小、唾液增多、皮脂外溢、體溫增高、出汗增多、便秘、疲乏、手腳痙攣引起的疼痛、抑郁及情感方面改變等。延緩PD功能障礙的抗氧化治療有誘發精神障礙的副作用[4-5]。為了研究探討PD的發病因病機，建立了不同的動物模型。以往的研究已證實MPTP小鼠模型的生物化學和組織化學特征均與臨床PD相似。因此，本實驗采用以MPTP腹腔注射誘發PD小鼠模型，觀察PD小鼠行為學、病理學的變化，研究中藥銀杏平顫方及其拆方對PD小鼠行為及DA能神經元形態結構的影響，以探討其防治PD的機制。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1動物C57/BL6J小鼠，雄性，6～7周齡，體重（18±2）g，購于北京維通利華公司實驗動物中心。動物自由進食飲水，動物房12h光、暗交替，平均溫度22℃，相對濕度30%。
1.1.2主要儀器1510石蠟切片機：德國LETIZ公司。H-160萬能研究顯微鏡：美國POLYVAR公司。Olympus BX5顯微鏡：日本Olympus株式會社。Image-pro Plus 5.0圖象分析系統:日本Olympus株式會社。自制小鼠測試桿。
1.1.3化學試劑MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）購于美國Sigma公司。
1.2方法
1.2.1中藥制備乙醇提取法獲得浸膏,溶于蒸餾水中，根據藥理學方法計算小鼠給藥量[6]，動物用藥量根據成人6倍量計算，按照每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa滅菌15min，4℃保存備用。每次腹腔注射MPTP前40min給小鼠灌胃。
1.2.2小鼠PD模型的建立參照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的實驗方法[7]，略加修改，小鼠造模前采用爬桿法[8]進行篩選：動物給藥前，先引導動物在15s內由桿頂爬至桿底，每只訓練4次，訓練完畢對其進行測定，選用0分C57-BL/6J小鼠（評分標準見表1），用生理鹽水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，連續5天。
1.2.3動物分組及處理選取0分小鼠隨機分成6組,每組12只: ①正常對照組(簡稱正常組，Normal control，NC)：不作任何處理。②模型對照組(簡稱模型組，Model control，MC)：生理鹽水每天灌胃0.5mL/只。③銀杏平顫方全方治療組(簡稱全方組,Ginkgo Biloba Pingchan Recipe,G)：灌胃全方中藥每天約0.5mL/只(含生藥量1.18g/mL)。④清熱解毒方治療組(簡稱解毒組,Jiedu Recipe,J)：解毒中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。⑤平肝熄風方治療組(簡稱平肝組,Pinggan Recipe,P):平肝熄風中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。⑥化瘀通絡方治療組（簡稱化瘀組,Huayu Recipe,H）:化瘀通絡中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。第②～⑥各組從造模第1天開始灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min給小鼠灌胃，各治療組給予相應中藥灌胃，模型組給予生理鹽水灌胃。MPTP用生理鹽水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各組連續用藥5天。以上各組每日進行2次爬桿試驗并進行評分，結果進行統計學處理。動物的存活期分別是造模開始14天和28天。
1.2.4小鼠行為學測試爬桿實驗：所用工具為一直徑13mm、高760mm的光滑不銹鋼桿，垂直豎立，將小鼠頭向下放置在金屬桿的頂部，使其沿桿自然爬下，觀察動物在下行過程中的行為，并按標準計分，評分標準見表1。實驗前每只小鼠爬桿2次，選用爬桿行為計分為0分的動物用于實驗，稱重并隨機分組。所有動物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服藥物前后，均進行爬桿試驗，每只鼠爬桿2次，積分并計算平均分，評分結果進行統計學分析。
1.2.5組織形態學觀察①取材及材料處理：動物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打開胸腔，先經左心室升主動脈快速推注生理鹽水20mL，后緩緩推注10%福爾馬林灌流固定，取腦、置于10%福爾馬林固定1周。腦組織經常規步驟處理：脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片、片厚6μm，常溫保存備用。
②HE染色法：石蠟切片烤干，脫蠟，脫苯，Ehrlich氏蘇木精染，鹽酸酒精分化，藍化，伊紅染色，脫水，透明、中性樹脂封片。
③光鏡下觀察并攝片：根據小鼠腦立體定位圖譜，每組每只動物選一張腳間核平面切片，取材部位見圖1。
2結果
2.1小鼠行為學改變
2.1.1注射MPTP后 各組小鼠行為表現各組給藥（MPTP）后10min小鼠都出現不同程度的肢體震顫，開始前肢抬舉伴震顫，后肢僵硬，豎尾、豎毛及跳、躥等動作，持續約30min后，又出現運動障礙，動作遲緩，短暫性活動減少，對外界刺激易產生尖叫，逃避反應慢；注射MPTP后1h，小鼠表現明顯的運動減少，對外界刺激反應低下，之后逐漸恢復。但各組動物癥狀都于24h后完全消失。隨著用藥時間延長，動物運動障礙程度增加，癥狀持續時間和恢復時間延長。中藥全方組和拆方各組均可不同程度改善PD小鼠出現的爬桿能力下降、時間延長和自發活動次數減少等上述小鼠行為學異常與模型組比較有顯著性差異（P均
2.1.2中藥銀杏平顫方及其拆方對PD小鼠爬桿行為的影響正常組小鼠在給予生理鹽水前后，爬桿測試無明顯差異。MPTP 30mg•kg-1•d-1腹腔注射后當日及以后幾天，協調能力明顯降低，表現為快速下滑，甚至不能抱桿、墜落，持續4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠協調能力逐漸恢復，模型對照組1～4周評分結果與正常對照組相比升高且均有顯著性差異（P
2.2病理學改變
2.2.1肉眼觀察全部小鼠腦標本外觀均未見明顯異常，切面檢查亦未見出血、壞死和軟化灶。
2.2.2HE染色光鏡觀察正常組14天、28天腦黑質神經細胞形態正常，體積正常，結構清晰，密集成群。模型組14天、28天小鼠腦黑質神經細胞數量明顯減少，部分神經元喪失，殘留神經元呈大多角形或錐體形狀，有的胞體變小，胞核固縮，胞核結構不清，有的胞核變大，核染色質疏松，有顆粒出現，核周圍胞漿有溶解樣改變；胞漿染色加深，胞漿內可見大小不等的嗜酸性顆粒并出現小空泡。大部分小鼠黑質區域內尚可見廣泛的淋巴細胞浸潤，部分淋巴細胞圍繞在血管周圍形成血管套。殘存的神經元體積瘦小，結構不清晰，色素變淺，同時伴輕度膠質細胞增生；與模型組14天和28天比較，銀杏平顫方全方及拆方各組14天和28天小鼠腦黑質神經細胞數量明顯增多，神經元體積較飽滿，結構較清晰；各中藥治療組14天黑質區神經元形態與28天各組相比基本相似，黑質區神經元數量未見明顯減少，但有少數神經元變性，細胞呈圓形或卵圓形，胞漿內未見嗜酸性顆粒出現。但總的看來中藥各治療組與正常對照組比較神經細胞未見明顯減少，無特異性改變；有的可見星形細胞輕度增多，胞核變大，偶見核分裂現象。解毒組28天2例黑質區有散在軟化灶形成，病灶較小，灶內大多數神經元消失，殘留的神經元胞體變小，胞核固縮。部分小鼠黑質區可見彌漫性淋巴細胞浸潤，偶見淋巴細胞圍繞在小血管周圍但并未形成血管套。
3討論
3.1模型的建立和銀杏平顫方對PD模型小鼠行為學改善的作用
帕金森病又稱震顫麻痹，臨床以肢體震顫、木僵為典型癥狀，是一種好發于老年人的多巴胺能神經元功能降低引起的錐體外系慢性病，同老年癡呆一樣是與衰老相關的神經退行性病。目前認為其腦內黑質紋狀體的多巴胺能和膽堿能神經功能平和失調是運動障礙的主要原因，凡引起前者功能降低或后者功能亢進的因素均可以導致震顫。帕金森病人的行為變化為運動協調能力降低，在本實驗中，用爬桿實驗作為測定動物協調運動能力的指標。模型組小鼠協調運動能力明顯降低，并且這種行為異常可持續數日，與正常組有顯著性差異，這一結果與文獻報道一致。
現在世界公認的兩種帕金森病模型藥物是6－羥基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一種神經毒素，大鼠單側紋狀體注射微量的6－OHDA，能夠造成多巴胺能神經元壞死，經阿樸嗎啡誘導，動物可出現向健側旋轉的現象[9－10]，6-OHDA模型存在造模周期長、成功率低、癥狀不典型等問題，限制了它的應用。
MPTP是哌替啶的衍生物，可由腦中單胺氧化酶B催化生成MPP+，后者是一種選擇性的神經毒素，可以損害人類和靈長類動物腦中黑質中的多巴胺能神經元，MPTP最初發現于吸毒患者的腦內，經分離獲得該化合物，注射到猴體內可引起酷似臨床震顫麻痹患者的幾乎全部癥狀，并且嚴重程度與所用劑量和動物年齡成正比。最初認為嚙齒類動物對MPTP的毒性不敏感，后來發現接受MPTP注射可能導致該動物出現震顫，但是種屬差異很大，大鼠由于腦內MAO-B的活性或水平較低，MPTP不能被代謝成活性產物，因而大鼠對MPTP的毒性不敏感。MPTP注射給藥可引起小鼠震顫，特別是C57／BL、BABC等，對注射MPTP產生的毒性極敏感， MPTP引起的小鼠行為學異常雖不像在靈長類動物上的癥狀典型，但造模周期短、重復性好，實驗動物費用低，可引起腦內黑質紋狀體的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被國外許多實驗室廣泛采用，這種模型為研究帕金森病的發病機理和藥物治療提供了條件[11-12]。
MPTP確可引起小鼠的行為異常，但其引起的小鼠行為變化，因采用的注射劑量、注射次數、注射途徑的不同以及所采用的行為觀察方法的不同而有所不同[13-16]。本實驗采用的是最大劑量和最常用的注射途徑，為縮短實驗周期采用5次注射，得到比較明顯的運動能力降低的效用。為了檢查PD小鼠的協調運動能力，本實驗選用爬桿試驗，即讓小鼠頭向下倒豎于垂直的金屬桿頂部，待其四肢握緊桿后，松手任其自由下行，此實驗中，動物被動地下行，當協調能力降低時，行為發生明顯改變。
實驗結果顯示， MPTP注射后，小鼠爬桿能力降低，并且這種行為異常可持續幾日，以后逐漸恢復，這一結果與文獻使用自主活動法觀察的結果一致，采用此方法觀察得到的銀杏平顫方及其拆方對MPTP所致小鼠運動能力降低的改善作用這一結論是可靠的。
3.2銀杏平顫方對PD小鼠DA神經元形態的影響
很多實驗證實，MPTP對黑質DA能神經元具有選擇性神經毒作用，其致病的過程是MPTP進入體內首先穿過血腦屏障，被星形膠質細胞、5－羥色胺能神經元攝取并在單胺氧化酶 B迅速催化下生成吡啶類代謝產物甲基－苯基吡啶離子（MPP+），MPP+與 DA的化學結構極為相似，故可以被DA轉運體（DAT）識別并載入DA能神經元內，然后通過線粒體外膜上能量依賴性轉運機制進入線粒體集中起來，之后阻斷線粒體NADH氧化呼吸鏈，最終造成ATP衰竭和細胞死亡[17]，故直接損害DA能神經元的是MPP+。因MPP+和鐵離子一樣與神經黑色素有很高的親合性，而黑質DA能神經元含有較高濃度的神經黑色素，所以 MPP+選擇性地損傷了SNpc的 DA能神經元，中樞神經系統內其它部位的DA能神經元，如腹側被蓋區DA能神經元損傷則很小[18]。筆者在HE染色和TH免疫組化染色實驗中也得到同樣結果。DA合成限速酶TH與PD的關系很早就受到了普遍關注。TH已經成為DA神經元的標志酶。大量研究證明，PD動物模型及PD病人體內TH從基因表達、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在廣泛的異常改變，筆者的另一實驗觀察了各組小鼠中腦TH陽性黑質神經元，結果顯示：模型組小鼠中腦SNpc內TH免疫組化觀察到大量DA能神經元脫失，因而經黑質－紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經遞質減少，從而引起小鼠多巴胺和乙酰膽堿系統平衡失調而產生行為學障礙；HE染色結果與銀杏平顫方全方及拆方各組小鼠行為改變成正比，而且黑質區神經元的變性、退化及壞死程度較模型組均明顯改善，僅個別小鼠有輕微的軟化灶形成。HE染色和TH免疫組化染色結果相吻合，這表明中藥可減少多巴胺神經元的丟失、增加多巴胺神經元內TH的表達，各組中藥在不同的時間療效各不相同，就減少多巴胺神經元丟失的數量而言，在14天以解毒組最明顯，28天以全方組最明顯；就增加TH的表達而言，14天全方組和解毒組較明顯，28天化瘀組較明顯。這些變化說明中藥銀杏平顫方全方及拆方能使黑質神經元的損傷程度減輕，結構和功能接近正常，進一步從形態學方面證實了銀杏平顫方全方及拆方可保護神經組織免受MPTP引起的自由基增多及氧化損傷所造成的損害，從而為PD的防治提供形態學依據。
以上結果從行為學和神經病理角度分別證明了模型成功。停藥后小鼠行為恢復較快與腦內的表現不太相符，這與其他學者的報道一致[19]，具體機制尚不清楚。中藥各給藥組（14天，28天）小鼠行為障礙有明顯恢復、TH免疫組化顯示SNpc內DA能神經元數目較模型組明顯增多，且全方組和化瘀組更為明顯一些。這些結果提示銀杏平顫方及其拆方能改善PD小鼠的行為障礙、對DA能神經元的正常形態及功能有保護作用。銀杏平顫方及其拆方28天組治療效果稍好一些，但與14天各組相比兩者之間的差別并不很大，一方面提示銀杏平顫方及其拆方對PD的治療可能存在一定的量效和時效關系，同時也說明在短時間內銀杏平顫方及其拆方即可達到滿意的治療效果。
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動物行為學分析方法范文第3篇
【關鍵詞】 慢性酒精中毒；模型；動物
慢性酒精攝入會造成的神經元凋亡，各種認知功能也由此而受到影響（尤其是記憶力、分析能力和注意力）。會出現心理問題、焦慮、抑郁，尤其母體吸收酒精，可引起胎兒酒精綜合征，導致神經元發育過程中變性或凋亡，從而影響胎兒［1］。建立良好穩定的酒精中毒的動物模型對于研究慢性酒精中毒的發病機制，指導慢性酒精中毒的防治有實際應用價值。尤其是長期以來多數慢性酒精攝入模型多是采用了灌胃的方法，并且很少在小鼠中建模，局限了研究慢性酒精攝入對臟器，尤其是大腦的病理改變中的作用.本研究探索通過直接飲用含酒精水建立慢性酒精攝入腦損傷小鼠模型，模仿自然攝入，避免了灌胃可能造成小鼠臟器損傷，尤其是腦組織的應激改變，影響對小鼠腦損傷機制的研究。
1 材料和方法
1.1 實驗動物 選用健康6周齡BALB/c雄性小鼠12只，體重（23±2g），購自于徐州醫學院實驗動物中心。
1.2 藥物與試劑 無水醫用酒精（西隴化工股份有限公司，分析純，酒精度100%）；鼠飼料（購自于徐州醫學院實驗動物中心）；HE染色試劑盒（碧云天生物研究所）；olympus倒置顯微鏡X70（日本olympus公司）；MGC-BP智能型光照培養箱（上海一恒科技有限公司）；冰凍切片機（德國萊卡CM1900）；BK10000光學顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 實驗分組 將12只6周齡正常BALB/c鼠，隨機分二組：不飲酒對照組和慢性酒精攝入組，分籠飼養。模型組小鼠給予酒精混合飲水喂食（乙醇濃度為10%）；對照組給予常規不含酒精飲水，兩組小鼠均為標準飼料飼養。喂食過程觀察記錄模型組小鼠的性情變化，每5天檢測小鼠體重一次。
1.3.2 建立模型2個月后小鼠行為學檢測后，稱重，短頸處死模型組和對照組小鼠，取小鼠大腦甲醛固定，脫水，-80°C切片，進行HE染色（染色步驟見碧云天HE染色試劑盒），顯微鏡下觀察。
1.4 統計學分析 采用SPSS軟件進行統計學處理，組間比較采用t檢驗，以P
2 實驗結果
2.1 一般觀察 對照組小鼠皮毛光滑潤澤，行動靈活，進食及大便正常；模型組小鼠隨著飼養，活動量減少、精神萎靡、嗜睡，毛皮松軟、稀疏、蓬亂缺乏光澤，進食量減少，體重出現負增長，兩組小鼠的體重有統計學差異（P均
2.2 Morris水迷宮 實驗通過記錄小鼠每次自入水時間直至其找到并爬上平臺所需的時間，判斷小鼠自身的學習記憶能力，以此作為小鼠腦損傷的一個指標。水迷宮訓練5天時間里，模型組小鼠潛伏期時間比正常組小鼠需要時間長，無論是入水找到平臺時間還是經過平臺的時間都與正常組小鼠相比有顯著性差異（P
2.3 組織學觀察 冰凍切片HE染色分別觀察模型組和正常組小鼠腦組織，發現模型組腦組織有明顯的結構空泡、胞質增大、排列疏松、結構不清晰，隱約可見變性壞死的死亡細胞輪廓，提示慢性酒精攝入對小鼠腦照成了一定的實質性損傷。
3 討論
酒精具有脂溶性，極易透過血腦屏障，與腦中豐富的卵磷脂直接結合，使神經細胞變性、神經纖維脫髓鞘、大腦皮質神經元活動受到抑制，產生持久的神經毒性作用［1］。慢性酒精中毒對人體的損害是一個長期的過程，可造成精神、神經系統和多器官的損害，尤其是對大腦皮層的損害，影響認知功能，可產生精神病性癥狀［2-3］。研究認為長期酒精攝入導致線粒體功能紊亂、氧化乙醛代謝能力下降、腦組織和腦靜脈中乳酸濃度升高，引起腦組織的損傷。研究表明通過母體吸收酒精，引起胎兒酒精綜合征，導致胎兒神經元發育過程中變性或凋亡。本實驗通過長期低劑量喂食酒精構建慢性酒精攝入腦損傷小鼠模型，模擬現實中慢性乙醇中毒患者長期飲酒的過程。本實驗結果表明，直接飲用含酒精水后的小鼠大腦組織神經細胞的數目減少、體積縮小、變形；細胞核輕度固縮，深染，結構消失；部分細胞壞死，細胞溶解、消失，隱約可見輪廓模糊的壞死細胞；小鼠的學習記憶能力大幅衰減，這些癥狀與與臨床上長期飲酒患者出現學習力、記憶力、定向力和智力等功能降低相符合。通過直接在飲用水中加入酒精進行慢性酒精攝入腦損傷小鼠模型造模方法，簡單易行，但要保證每只動物飲酒量的一致和酒精有效濃度。這種造模方式更符合自然狀態下的慢性酒精中毒腦損傷特征，適合于慢性酒精中毒動物模型的制備，有利于慢性酒精攝入異常機制的深入研究。
參考文獻
［1］ 李翠蓮，石秋艷，等.慢性酒精中毒腦損害［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18（2）：197-198.
動物行為學分析方法范文第4篇
【Abstract】 AIM: To study whether the blockade of glutamate NMDA receptors in the ventral tegmental area (VTA) modulates the morphine withdrawal in rats. METHODS: The effects of (+) MK801， microinjected unilaterally into the VTA 30 min before naloxone (2 mg/kg， ip) administration， on the morphine withdrawal were assessed. Morphine dependence developed with increasing morphine injection (ip) and morphine withdrawal was induced by injection (ip) of naloxone (2 mg/kg). Wet dog shakes and GellertHoltzman score were used as the indexes to evaluate the intensity of morphine withdrawal. RESULTS: Unilateral microinjection of MK801 into the VTA significantly reduced the GellertHoltzman score and the incidence of wet dog shakes in morphine withdrawal rats. CONCLUSION: MK801 (2， 5， 10 g/L) unilaterally administered into the VTA significantly reduces the intensity of morphine withdrawal syndrome in dependent rats. These data support that glutamatergic transmission in the VTA and its interactions with dopaminergic neurons in the mesolimbic system play some important roles in opiate withdrawal syndrome. Our findings also suggest a potential use of NMDA antagonists in the therapeutic treatment of opiate abuse.
【Keywords】 MK801; Morphine deperdence; substance withdrawal syndrome; receptors， NmethylDaspartate; Rats; ventral tegmental area
【摘要】 目的： 研究中腦―邊緣多巴胺回路腹側被蓋區(VTA)內源性谷氨酸信號轉導在嗎啡戒斷形成中的作用. 方法： 給VTA微注射不同劑量谷氨酸NMDA受體拮抗劑（+）MK801，用行為學方法觀察對嗎啡戒斷大鼠戒斷癥狀的影響. 遞增量嗎啡ip 7 d建立依賴模型，末次給藥1.5 h ip鹽酸納洛酮（2 mg/kg）誘發戒斷癥狀，以GellertHoltzman Score和濕狗樣顫為評價戒斷癥狀程度的指標，進行統計學分析. 結果： （+）MK801（2， 5， 10 g/L）微注射于VTA可明顯減弱嗎啡戒斷大鼠濕狗樣顫的發生次數，且能顯著降低嗎啡戒斷鼠的GellertHoltzman Score. 結論： VTA內源性谷氨酸受體及其與中腦―邊緣多巴胺能信號轉導相互作用，參與嗎啡戒斷的形成，提示谷氨酸受體拮抗劑可用于嗎啡戒斷的治療.
【關鍵詞】 腹側被蓋區；嗎啡依賴；物質禁斷綜合征受體，N甲基D天冬氨酸；MK801；大鼠
0引言
阿片依賴是一種細胞適應性反應，許多腦區參與，中腦―邊緣多巴胺回路系其中之一. 研究表明嗎啡戒斷大鼠腹側被蓋區（VTA）多巴胺神經元直徑、數目減小［1］，放電頻率及多巴胺釋放量降低［2，3］，可見VTA多巴胺神經元功能下調. VTA多巴胺能神經元既接受自身受體D2的調節，又接受谷氨酸能投射. 激動VTA谷氨酸受體可增加伏隔核多巴胺釋放和大鼠運動行為［4］，重復給予嗎啡等可增加VTA谷氨酸釋放和其受體亞基表達，可見VTA谷氨酸受體功能上調. 但該回路谷氨酸受體在嗎啡戒斷形成中的作用說法不一，因多數研究以全身或腦室內給藥方式進行. 我們在嗎啡依賴大鼠誘發戒斷前，微注射谷氨酸NMDA受體拮抗劑（+）MK801于VTA，觀察其對嗎啡戒斷癥狀的影響.
1對象和方法
1.1對象
SD雄性大鼠48只，體質量(235±15) g（西安交通大學醫學院實驗動物中心）. 鹽酸納洛酮，（+）MK801（美國Sigma公司），鹽酸嗎啡粉劑（青海制藥廠，批號：010202），鹽酸嗎啡針劑（沈陽制藥廠，批號：020907）.
1.2方法
1.2.1手術大鼠在戊巴比妥鈉麻醉下，行單側VTA套管埋植手術，套管埋植在距VTA背側2 mm處，用不銹鋼螺釘和牙科水泥固定在顱骨表面，VTA定位為AP -5.3 mm， ML +0.7 mm， DV -7.7 mm，手術過程用電熱毯保持大鼠體溫在(37±1) ℃，術后大鼠單籠喂養，且前3 d ip青霉素2000 u/d，術后7 d建立嗎啡依賴模型.
1.2.2制模按照文獻［5］的方法，首次劑量為10 mg/kg，分別在8：00和16：00各ip 1次，以后嗎啡劑量每日增加10 mg/kg，連續注射7 d，其中第6，7日劑量維持在50 mg/kg，建成嗎啡依賴模型. 末次給藥1 h后，經套管VTA給予(+) MK801 (2， 5，10 g/L)或生理鹽水0.5 μL， 30 min后ip鹽酸納洛酮（2 mg/kg）誘發戒斷癥狀［6］，并立即放進透明玻璃缸（50 cm×50 cm×60 cm）內觀察大鼠戒斷癥狀1 h.
1.2.3實驗分組將大鼠隨機分為6組，即第1（鹽水對照）組，第2（嗎啡依賴對照）組，第3（嗎啡戒斷對照）組，第4［（+）MK801小劑量治療］組，第5［（+）MK801中劑量治療］組和第6［（+）MK801大劑量治療］組. 每組8只.
1.2.4組織再建行為學觀察后，60 mg/kg戊巴比妥鈉ip麻醉大鼠，經心灌注200 mL生理鹽水快速沖洗血液后，用40 g/L多聚甲醛固定液（0.1 mol/L PB配制，pH 7.4）400 mL灌流1 h，灌注后取腦，置入40 g/L多聚甲醛固定液4℃后固定12 h，再移入250 g/L蔗糖溶液固定24 h以上，按Paxinos大鼠立體定位圖譜在前囟后4.8～5.8 mm范圍內用冰凍切片機連續冠狀切片，片厚50 μm，連續取片，收集于100 mL/L的乙醇溶液，5 g/L Cresyl violet染色［6］，確定給藥部位.
1.2.5行為學分析參考FernandezEspejo等［7］的行為學定義和評分標準，戒斷癥狀的嚴重程度用10個指標衡量，將其分為等級癥狀（依據出現次數的多少得分）和觀察癥狀（出現即得分）2類，并定義不同的分值，① 等級癥狀： 濕狗樣顫1～2次計2分，3次或更多計4分；后腿直立，跳躍或異常姿勢1～4次計1分，5～9次計2分，10次及10次以上計3分；體質量喪失一個百分點計1分. ② 觀察癥狀： 腹瀉，眼瞼下垂或咬牙出現計2分；激惹或出現計3分. 累加各戒斷癥狀的得分，求得GellertHoltzman Score 評分.
統計學處理： GellertHoltzman Score評分以x±sx表示，所得數據采用Sigma Stat 2.0統計軟件進行統計處理，應用單因素方差分析進行各組間比較，應用Post hoc comparisons (NewmanKeuls) 進行均數間兩兩比較檢驗；濕狗樣震顫發生次數偏態分布，因此以中位數、25百分位數和75百分位數描述，采用Sigma Stat 2.0統計軟件進行統計處理，應用KruskalWallis法進行多樣本間的秩和檢驗，應用MannWhitey U法進行兩組間比較，以P
2結果
2.1組織再建Fig 1表明了各實驗組VTA給藥的部位. 其中鹽水或(+)MK801注射在VTA范圍以外的實驗動物，在統計分析時已剔除.
2.2(+)MK801治療對嗎啡戒斷大鼠GellertHoltzman Score評分的影響各癥狀的累計GellertHoltzman Score評分應用單因素方差分析（one way ANOVA）顯示6組間的評分差異顯著，Post hoc comparisons（NewmanKeuls）檢驗顯示第3組的GellertHoltzman Score評分顯著高于其他5組（P
2.3MK801治療對嗎啡戒斷大鼠濕狗樣顫的影響濕狗樣顫系嗎啡戒斷大鼠的特征性行為，實驗過程中第1，2組均未出現. 第3至6組大鼠均有濕狗樣顫發生，KruskalWallis法秩和檢驗顯示各組間濕狗樣顫發生次數差異顯著，進一步應用MannWhitey U方法進行兩樣本間比較，第3組顯著高于其他5組（P
3討論
VTA是多巴胺神經元的集中區之一，主要起源于A8A10細胞群，該區的多巴胺神經元同時接受抑制性GABA能和興奮性谷氨酸能纖維投射，前者的輸入減弱或后者的輸入增加均會導致VTA多巴胺神經元興奮. 大量研究證實嗎啡依賴和戒斷的產生與中樞多巴胺能神經元活動密切相關，伏隔核［8］給予D1受體拮抗劑可誘發嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，而全身給予D1受體激動劑可減弱嗎啡戒斷癥狀，可見在嗎啡戒斷時中樞多巴胺能神經元活動減弱. VTA多巴胺神經元主要投射NAcc和mPFC (medial prefrontal cortex)，同時也投射下丘腦和腦干，而下丘腦和mPFC又是自主神經網絡的核心，嗎啡戒斷引起的VTA多巴胺能神經元活動下調進而引起自主神經系統功能加強，表現出戒斷行為，因此有人認為多巴胺間接參與嗎啡戒斷行為的產生［9］；還有人認為嗎啡戒斷時運動增強直接由VTA多巴胺D2受體引起［10］. 近期的研究表明嗎啡戒斷大鼠中腦邊緣多巴胺回路谷氨酸能神經元活動加強［11，12］，表現為該回路谷氨酸釋放量增加，谷氨酸受體亞基GluR1，NMDAR1 表達上調，全身給予AMPA或NMDA受體拮抗劑可減弱嗎啡戒斷癥狀，因此認為在嗎啡戒斷時中腦―邊緣多巴胺回路通過谷氨酸能神經元的活動發揮作用.
嗎啡依賴模型建立時給予大劑量鹽酸嗎啡ip，且用2 mg/kg鹽酸納洛酮誘發戒斷行為，以大鼠特異和敏感的行為學指標為參數，換算求得GellertHoltzman Score評分，整體衡量嗎啡戒斷大鼠戒斷癥狀的程度，同時以大鼠敏感而特異的濕狗樣顫發生次數為等級癥狀的代表，進行統計處理. 在實驗過程中，嗎啡戒斷的特異行為如濕狗樣顫、跳躍、扭體，在嗎啡依賴對照組和鹽水對照組均未出現，可見實驗所得數據可靠. 另外GellertHoltzman Score評分系GellertHoltzman 于1978年建立的一種經典的阿片類物質軀體戒斷評價指標體系. 實驗結果表明VTA單側微注射（+）MK801能明顯減弱了嗎啡戒斷大鼠的GellertHoltzman Score 評分和濕狗樣顫的發生次數，但(+)MK801這一作用在3個不同劑量組間未表現出顯著的差異. VTA微注射（+）MK801拮抗了谷氨酸受體，從而降低VTA區多巴胺能活動，可見VTA內源性谷氨酸受體調節嗎啡戒斷行為的形成. 總之，微注射（+）MK801（2， 5， 10 g/L）于VTA顯著減弱嗎啡戒斷大鼠的GellertHoltzman Score評分和濕狗樣顫的發生次數，表明VTA內源性谷氨酸受體，及其與中腦邊緣多巴胺能神經元相互作用參與嗎啡戒斷形成，同時提示谷氨酸受體拮抗劑（+）MK801具有治療嗎啡戒斷和復吸作用.
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動物行為學分析方法范文第5篇
摘 要：目的：應用Walker-256細胞建立大鼠骨癌痛模型。方法：將4×104個W256癌細胞注入SD大鼠脛骨上段骨髓腔內，利用大鼠熱板法和足跖加壓法分別測量熱刺激和機械刺激痛閾的變化，x線攝片進行放射學評、估骨質破壞程度，同時，組織切片HE染色觀察腫瘤生長和骨結構的破壞情況。結果：造模動物在12天左右開始出現熱刺激和機械刺激痛閾明顯下降(痛覺過敏)，并呈漸進性發展；脛骨x線攝片顯示14天即有明顯的骨破壞，第21天時出現病理性骨折；組織切片顯示骨髓腔內腫瘤生長活躍，向外侵蝕破壞骨皮質。結論：從疼痛行為學、放射學、組織學等方面的研究結果顯示，應用Walker-256細胞成功建立了大鼠骨癌痛模型。
關鍵詞：Walker-256癌細胞；骨癌痛；大鼠；動物模型；痛覺過敏
骨癌痛是癌癥病人最常見的一種疼痛，約三分之一的晚期癌癥病人都會發生骨轉移。腫瘤引起的疼痛嚴重影響了患者的生活質量。雖然治療骨癌痛有化療、放療、三階梯療法及二磷酸鹽等多種手段，但由于存在療效短暫和藥品不良反應等問題，仍有相當一部分癌痛得不到理想控制。發展新療法的關鍵在于對癌痛發病機制的正確認識，然而由于長期以來缺乏相應的動物模型，阻礙了對癌痛發生機制的認識及抗癌痛藥物的研發。近幾年來國外相繼有了股骨、肱骨、跟骨和脛骨癌痛動物模型成功建立的報道，為認識人類骨癌痛的機制以及篩選治療性藥物提供了很好的工具。但在國內，由于受到造模用細胞株來源的限制，癌痛模型復制仍然成為相關課題研究的障礙。筆者通過反復試驗，成功地應用國內易得的Walker-256細胞株建立了大鼠骨癌痛模型，從而為抗癌痛藥物的評價，尤其是對中藥及其復方的篩選提供一個有用的工具。現將研究結果報道如下。
1 材料和方法
1．1 瘤株Walker－256大鼠腹水癌細胞株，由浙江醫學科學院提供。
1．2 動物SD雌性大鼠，清潔級，體重140－160g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。
1．3 主要儀器XZC一2B型自控溫度熱板儀(山東醫學科學院生產)，XZC―A型壓力測痛儀(山東醫學科學院生產)，高頻乳腺攝片機(意大利產)。
1．4造模方法 參照Medhurst等報道的方法，將動物經3％戊巴比妥鈉麻醉后，腹部朝上，左側后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約1cm小口，小心暴露脛骨，先用5mL注射器針頭穿刺打孔，然后換用5μL微量注射器進入骨髓腔，緩慢注入4μL含4×104個W256癌細胞的生理鹽水細胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創口處滴撒少許慶大霉素注射液以防感染，假手術組動物左側脛骨上段注入等體積的生理鹽水，其余操作同模型組。
2 模型評價
2．1行為學分別于手術前及手術后第7、12、15、18、21天用大鼠熱板法和足趾加壓法測量熱刺激和機械刺激痛閾。
熱刺激：先將熱板儀調節溫度至(52±0.1)℃，然后將大鼠放置在熱板上，待出現舔后足時所需要的時間值(s)即為該動物的痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5min以上，取3次均值作為該動物的熱刺激痛閾值，篩選基礎痛閾在10～30s的動物用于實驗。
機械刺激：將大鼠左后足掌置于壓力測痛儀壓力針下，按動電動按鈕，使壓力搖桿旋動，隨搖桿的旋動大鼠足掌壓痛點壓力逐漸增加，以縮足或嘶叫為痛反應，出現痛反應時的重量值(×10g)即為該動物的機械刺激痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5min以上，取3次均值作為該動物的機械刺激痛閾值。
2．2 放射學于造模后第7、14天分別隨機抽取每組大鼠3-4只，第21天收集全部剩余大鼠雙側后肢，進行x線攝片，評估腫瘤誘發的骨破壞程度。放射學評分標準如下，O分：正常的骨結構，無任何骨質破壞的征象；1分：在脛骨近骺端注射部位附近，見小的放射性的骨質缺損病灶(數量少于3個)；2分：髓質骨缺損放射性病灶增多(大于3個)；3分：髓質骨缺失，同時皮質骨受侵；4分：單面的骨皮質完全缺損；5分：雙面的骨皮質缺失，移位性骨折。
2．3 組織學將x線攝片后的大鼠后肢進行修剪，留下脛骨及少許軟組織，先用4％中性甲醛液固定l周，再在含10％甲酸的多聚甲醛固定液中脫鈣1周，石蠟切片，HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結構的破壞情況。
2．4統計學處理采用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異標準。
3 結果
3．1痛敏的形成熱刺激：與造模前的基礎痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現熱刺激痛閾明顯下降(P＜0.01)，以后逐漸降低，其中術后第21天痛閾與第12天比較均有差異顯著(P＜0.05)。而假手術組大鼠術后各時間點痛閾與術前基礎痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現熱痛覺過敏，且呈漸進性加強趨勢。
機械刺激：與造模前的基礎痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現機械刺激痛閾明顯下降(P＜0.01)，并隨時間推移逐漸降低，其中術后第21天痛閾較第12天進一步降低(P＜0.05)。而假手術組大鼠術后各時間點痛閾與術前基礎痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現機械性痛覺過敏，且呈漸進性加強趨勢。
3．2骨損壞程度大鼠脛骨X線片顯示，模型組大鼠左側脛骨隨造模時間的推移逐漸出現明顯的骨質破壞，且骨破壞的程度與造模時間成正相關。造模第7天的x線片僅見注射部位松質骨有小的放射性缺損病灶(見圖1，評分為1，范圍0-2)；第14天，X線示松質骨放射性病灶增多，同時骨皮質有明顯缺損病灶(見圖2，評分為3，范圍2.4)；到第21天，骨破壞進一步加重，骨皮質完全缺失，病灶范圍擴大，部分脛骨已出現病理性骨折(見圖3，評分為4。范圍3-5)。而假手術組脛骨X線片未顯示明顯的骨質破壞(見圖4，評分為0)。
3．3腫瘤細胞的生長造模第7天的脛骨HE切片顯示。骨髓腔內及骨小梁間見大量活躍的腫瘤細胞生長，骨小梁破壞較輕，骨皮質仍完整(見圖5)；造模第14天，骨髓腔內充滿了腫瘤細胞，大部分呈活躍狀態，骨小梁破壞加重，骨皮質受侵，變薄，局部可見新生編織骨形成(見圖6)；造模第21天，骨髓腔完全被腫瘤細胞所填充，中央大部分腫瘤細胞已退變壞死，而在骨髓腔的邊緣部分，腫瘤細胞多呈活躍狀態，腫瘤向外生長，骨小梁和骨皮質均完全被破壞(見圖7)。而假手術組各時間點大鼠脛骨切片顯示，骨髓腔內見各種正常的骨髓細胞，未見其他骨結構的改變(見圖8)。
4 討論
國外報道成功建立的骨癌痛模型主要應用兩種瘤細胞，即NCTC2472纖維肉瘤細胞和MRMT-1大鼠乳腺癌細胞，然而，這兩種細胞在國內很難獲得，限制了癌痛模型的復制及相關課題的研究。因此，如何應用國內易得的瘤株建立穩定癌痛模型具有重要的現實意義和科研價值。資料顯示，Walker一256癌細胞具有較好的骨侵襲能力，并且該細胞株來源于大鼠原發性乳腺癌組織，因而應用該瘤細胞建立骨癌痛模型可視為乳腺癌骨轉移模型，具有重要的科研價值。
參照文獻所述的方法，筆者采用了3種不同濃度的Walker-256癌細胞注入大鼠脛骨上段，并進行動態的行為學、放射學及組織學觀察，結果表明，4×103、4×104、4×105個細胞3種濃度均可成功建立骨癌痛模型，且骨損壞和痛覺過敏的程度與瘤細胞濃度大小呈一定的正相關，隨注入的癌細胞濃度增大其成模的時間會相應縮短，其中用4×104個細胞造模與文獻報道的成模時間基本一致。
通過多次反復試驗，筆者的經驗是，在整個操作過程中應注意以下幾點：一是造模用細胞懸液應于冰塊上低溫放置，每次抽取時要搖勻，并在2-3b內使用，最好不要超過4h，否則會影響癌細胞的活力；二是穿刺打孔時不可將對側骨皮質穿透，且注射完癌細胞后應迅速用骨蠟封住針孔止血，否則均會導致癌細胞在骨外生長，易致造模失敗；另外，無菌觀念和熟練輕巧的動作也是保證造模成功的重要因素，需反復練習。
