運用生物信息學分析牛奶中細菌菌群

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目前，對于環境中微生物菌群的研究主要分為培養和非培養的方法。培養法是利用不同的選擇性培養基結合生化反應鑒定細菌的種類。該方法具有一定的針對性，但是費時耗力，且只能獲得可培養微生物的信息，對于那些不可培養的細菌則無能為力[11-13]。非培養的方法主要是通過分子生物學技術，直接從環境中提取細菌基因組DNA，再用分子生物學的方法進行分析研究，如聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，PCR-DGGE）、核酸雜交（Hybridization）、高通量測序（High-throughputsequencing）等。目前分析細菌的16SrRNA序列已經成為細菌菌種鑒定的“金標準”。16SrRNA全長為1.5~1.6kb，包括9個“高度可變區”，其中V3區（nucleotides433-497）的位點456-479在細菌間的比對中獲得最多的單核苷酸多態性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）,能夠鑒定110多種細菌[14]。研究者已經利用16SrRNA-V3區結合PCR-DGGE、測序等技術對環境中的細菌進行鑒定及菌群分析研究[9,15]，其中包括對牛奶中細菌的鑒定和菌群分析[11]，并發現牛奶中存在多種細菌，具有較高的菌群多樣性。本研究中，我們從市售的常溫牛奶和巴氏消毒牛奶中提取細菌基因組DNA，利用通用引物擴增牛奶中細菌的16SrRNA-V3區，熒光實時定量PCR測定樣品中細菌總數；通過克隆、測序，獲得16SrRNA-V3區的序列信息，再進行序列比對、鑒定菌種。分析不同品牌牛奶中的細菌數量、菌群分布，推測生奶的奶源環境、儲存時間及奶牛的健康情況。

1材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品收集:從超市購買了4個品牌的5種牛奶，包括高溫滅菌奶（常溫保質期30天）和巴氏消毒牛奶（2℃~6℃保質期7天），分別標記為A、B、C、D、E。樣品ABC為高溫滅菌奶，DE為巴氏滅菌奶，C和D是同一品牌的常溫奶和巴氏奶，每種牛奶收集了同一批次的3個樣品。所有的樣品均在2012年5~7月進行取樣。

1.1.2試劑：QIAgenDNAStoolextractionkit－購自德國QIAGEN公司，PremixTapVersion2.0、pMD18-TVector－購自日本Takara公司，Cycle-Purekit－購自美國OMEGA公司，TransDH5αCompetentCell－購自北京全式金生物技術有限公司，KAPASYBRFASTqPCRKit－購自美國KAPA公司。

1.2儀器與設備NanodropND1000分光光度計－購自美國Thermo公司，GeneAmpPCRSystem2720ThermaCycler－購自美國ABI公司，BeckmanAllgreX-22R離心機－購自美國Beckman公司，PowerPacBasic電泳儀－購自美國Bio-RAD公司，凝膠成像系統－購自美國AlphaInnotech公司。ABI7300實時定量PCR儀－購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取取100mL的牛奶樣品用Collado[16]等（2009）的方法提取牛奶中的細菌DNA－7150g離心20min，棄掉上層溶液，收集沉淀，用5mLTE（1x）重新懸浮沉淀；7150g離心5min，棄掉上層溶液，沉淀用QIAgenDNAStoolextractionkit（QIAGEN）提取細菌基因組DNA。提取的DNA溶解在50μL的TE（1x）中，用NanodropND1000分光光度計測定DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DN段大小。樣品于-20℃冰箱中保存備用。

1.3.216SrRNAPCR用通用引物338F-CCTACGGGAGGCAGCAG，534R-ATTACCGCGGCTGCTGG擴增16SrRNA-V3區[17]。引物由上海生物生工（北京合成部）有限公司合成。PCR反應體系為：PremixTapVersion2.010μL，上下游引物各10μM，模板20ng，補水（PURELABUltra–ELGA純化水，高壓滅菌備用）到20μL。反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，100V，40min，紫外光下觀察電泳條帶（如圖1）。PCR產物用Cycle-Purekit（OMEGABIO-TEK，D6942-01）進行純化，測定濃度。純化產物用于隨后的克隆實驗。

1.3.3序列信息分析測序獲得的序列在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast進行16SribosomalrRNAsequences（bacteria）的比對，當MAXindent≥98%時，記錄該序列對應的細菌屬名和一致的始末位點。用BioEdit軟件對所得的序列根據一致位點提取16SrRNA-V3區的擴增序列，用ClustalX（1.83）進行序列比對。RDP-classifier在線軟件rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp對所有序列進行菌屬鑒定，對每個樣品的菌屬進行歸類。用“1-ΣH2”（H是每種菌屬占樣本所有菌屬的百分比）來評估每個牛奶樣品中的DNA菌群多樣性[18]。PAUPversions4.0軟件構建N-J系統發生樹。

1.3.416SrRNA基因的Real-TimePCR定量細菌總數提取的牛奶中細菌DNA用于模板定量細菌總數，DNA克隆獲得的pMD18-16SrRNA重組質粒用于標準品的制備。10倍梯度稀釋的質粒用于實時定量PCR中標準曲線的生成。反應體系為：KAPASYBRGreenMasterMix（2×）10μL，上下游引物各4μM，模板20ng，補水到20μL。反應條件為：95℃預變性3min，95℃變性3s，60℃延伸40s，共40個循環。數據結果用7300SystemSDSSoftware進行分析。每孔3個重復。

2結果分析

2.1DNA提取與PCR擴增我們成功提取了5種牛奶的15個樣品的細菌基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳的結果顯示，DNA呈現彌散狀，沒有明顯的主帶。用16SrRNA-V3區的通用引物對全部樣品進行PCR擴增，均得到約為190bp的擴增片段，陰性對照無擴增條帶（圖1）。在15個PCR擴增產物中隨機選擇了5個（每個品牌選擇一個樣本）進行T-A克隆。每個樣品得到了至少1000個克隆，隨機選取100個克隆進行測序（表1）。

2.2牛奶中的細菌總數利用檢測細菌的16SrRNA基因數量來反映牛奶中細菌總數。結果顯示，所有牛奶樣品中均含有大量的16SrRNA基因片段。考慮到不同種類細菌中16SrRNA基因的拷貝數在2~15個[19]，我們對絕對定量獲得的數據進行最小化和最大化處理（各樣品中的細菌16SrRNA基因按照最小拷貝數和最大拷貝數計算），所得結果和國家標準進行比較（圖4）。按照每個細菌含有最少16SrRNA基因拷貝數計算獲得最大細菌總數，各品牌牛奶樣品中最大細菌總數均低于國家標準。

2.3菌種鑒定及菌群結構分析我們對5個牛奶樣品的500個克隆進行了測序，成功的獲得了472條16SrRNA-V3區的序列，其中有131種不同的序列。樣品A和B得到93條序列，其中A中有20種不同的序列，樣品B中有25種不同序列。C、D、E分別得到95、96、95條序列，不同的序列數目為39、51、32（表1）。菌屬鑒定的結果表明，472條序列中的452條序列可以鑒定到五個綱的17個屬：芽孢桿菌綱（Bacilli）占12%、黃桿菌綱（Flavobacteria）占3%、β-變形菌綱（Beta-proteobacteria）占2%、放線菌綱（Actinobacteria）占1%和γ-變形菌綱（Gamma-proteobacteria）占82%（表1）。另外的20條序列只能鑒定到綱的水平，分別為黃桿菌綱（5%）、β-變形菌綱（5%）和γ-變形菌綱（90%）。可以明確鑒定到屬的序列中，有58條序列鑒定為革蘭氏陽性菌，分屬于棒狀桿菌屬（Corynebacterium），厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus），占總序列的12%。其中Corynebacterium只在樣品E中檢測到1個克隆；所有的10個Anoxybacillus克隆都是在D樣品中檢測得到，且與A.kestanbolensis有99%以上的相似性。在樣品C和E中都檢測到Streptococcus，分別占其所測序列的1%和49%。C樣品中的Streptococcus序列鑒定為嗜熱鏈球菌屬（S.thermophilus）；E樣品中的46個Streptococcus克隆全部與無乳鏈球菌（S.agalactiae）有100%的相似性。革蘭氏陰性菌的序列占所有序列的83%，分屬于14個屬：假單胞菌屬（Pseudomonas），不動桿菌屬（Acinetobacter），沙雷氏菌屬（Srratia），氣單胞菌屬（Aeromonas），黃桿菌屬（Flavobacterium），水棲菌屬（Enhydrobacter），嗜冷菌屬（Psychrobacter），希瓦爾氏菌屬（Shewanella），金黃色桿菌屬（Chryseobacterium），腸桿菌屬（Enterobacter），詹森菌屬（Janthinobacteriu），無色桿菌屬（Achromobacter），微小菌屬（Microvirgula），戴米提亞菌屬（Demetria）。其中Pseudomonas最多，占全部序列的46%，其次為Acinetobacter，占23%，而且這兩種細菌都以較高比例存在于在所有樣品中。Pseudomonas和Acinetobacter在各個樣品中檢測到的比例分別為：A（71%，16%）、B（75%，13%）、C（30%，43%）、D（40%，17%）、E（16%，25%）（表1，圖3）。Serratia在樣品A（8%）和B（5%）中檢測到；Aeromonas存在于樣品B（1%）、C（1%）、D（13%）和E（1%）中；Flavobacterium在樣品C（8%）和D（3%）中發現。C樣品中有3%的序列為Enhydrobacter，比對結果顯示，與氣囊棲水菌（E.aerosaccus）有≥99%的序列相似性。樣品C克隆中有3%為Shewanella，序列比對結果證明為腐敗希瓦爾氏菌（S.putrefaciens）。樣品C和D中檢測到Psychrobacter，分別占比例為3%和1%。Chryseobacterium分布在樣品C和E中。Janthinobacterium在C和D中分別占1%和4%。

2.4優勢菌群的系統發育樹分析各牛奶樣本中不但檢測到的菌屬不同，即使是同一菌屬，其序列（菌株）也存在差異，圖4a是所有Pseudomonas序列構建的N-J系統發育樹，發現樣品A、B的序列集中在上端的分支上，中間的分支中大部分序列出自樣本E，而樣品C、D的序列集中在下端的分支上。說明同一品牌牛奶中的細菌可能具有更近的親緣關系。圖4b是所有Acinetobacter序列構建的N-J系統發育樹，與圖4a情況相似，同一品牌牛奶中的序列相似性更高。

2.5市售牛奶中細菌的多樣性我們發現各個樣品中能夠明確鑒定的屬為：A到D依次為5個、5個、11個、8個、8個，各個樣品中有一定差異。為了更好了解牛奶樣本中的細菌多樣性，我們利用各樣品中所有的序列進行了多樣性分析。5個樣品A、B、C、D、E的值分別為0.61、0.65、0.93、0.94、0.74，平均值為0.78。可以看出，A和B的菌群多樣性明顯低于C和D。

3討論

3.1基于16SrRNA-V3區克隆測序鑒定細菌菌群用分子生物學技術直接從環境中提取細菌DNA并對其進行分析，再結合PCR擴增等方法研究環境中菌群多樣性及結構是近年來國內外比較常見的研究方法。如林海龍等[19]對中藥廢水污泥中的菌群結構的分析，Rasolofo等[10]、Raats等[9]對生奶中細菌菌群結構以及冷藏過程中的菌群結構的變化情況的分析。幾乎所有這些研究都基于基本的培養法獲得生牛奶（即原料奶）中細菌的單克隆，再通過大量培養后提取細菌的基因組DNA進行PCR鑒定。然而市售牛奶，尤其是高溫滅菌的市售牛奶，細菌DNA在牛奶中已經成游離狀態，對DNA提取的要求比較高。所以如何從市售牛奶中提取到可以用于PCR擴增的DNA成為整個研究成功的關鍵。本研究通過增加牛奶的使用量，利用提取糞便中細菌DNA的試劑盒成功的從市售牛奶中提取到細菌DNA，并對這些DNA進行細菌16SrRNA-V3區的PCR擴增，成功獲得了目的產物（圖1）。通過T-A克隆和測序分析，得到了不同品牌的5種市售牛奶中菌群的16SrRNA-V3序列信息，并對其進行比對、鑒定。所得結果表明，用該方法可以提取到市售牛奶中的細菌DNA，所提基因組DNA可以用來進行下游的實驗研究。

3.2各品牌牛奶中的細菌總數均處于相對較高水平牛奶中細菌總數是評價牛奶質量的一個重要標準。雖然牛奶中不可避免的存在一些細菌[1-3]，但是各種細菌的大量存在勢必影響牛奶的品質[25]。我們的實驗結果表明各個品牌牛奶中細菌總數均低于國家標準，然而相比較于乳業發達國家的105個/mL細菌數量，各牛奶樣品中細菌總數均處于相對較高水平（圖2）。這與我國部分奶源依賴散戶養殖，飼料質量和衛生狀況都不佳造成細菌總數不易控制，長時間儲存導致的細菌繁殖，以及規模化養殖管理不善不無關系[21]。因此，監督部門應加強管理，促使國內奶制品產業環境進一步得到改善。

3.3不同品牌牛奶中的菌群結構不同Tatsuro等[22]用通用引物擴增16SrRNA-V3區的結果顯示Lactobacillus和Staphylococcus是牛奶中的主要菌群，Lafarge等[12]也得到的相同的結果；與此不同，Delbes等[11]的結果則表明牛奶中的優勢菌群是Clostridium和Lactobacillus；我們在市售牛奶中檢測到的優勢菌群是Acinetobacter和Pseudomonas，這與部分研究者的檢測結果一致[9,10]。即使同為優勢菌群，我們發現它們在5個樣品中所占比例也不盡相同（圖3）。然而在E樣本中，Acinetobacter和Pseudomonas已非優勢菌群,進化樹的聚類分析顯示同一屬的細菌中，來自同一樣本的細菌序列具有更高的相似性，其親緣關系更近（圖4）。各個樣本中的非優勢菌的種類也不同，如Serratia存在于樣品A和B中，在樣品C、D檢測到了Janthinobacterium，只在樣品E中檢測到了Streptococcusagalactiae（表1）。Vacheyrou等[23]的研究表明大量的微生物菌群轉移是從牛棚到擠奶室，然后到牛奶中，而且牛奶中存在的大部分細菌都能在乳頭表面發現。因此我們推測不同品牌牛奶中菌群結構的差異是由于奶源不同所造成的，而奶源環境中的菌群結構存在較大差異。

3.4牛奶中的致病菌乳腺炎是世界奶牛養殖業中發病率最高、造成經濟損失的主要疾病之一。其病因多為細菌感染。RiffonR等[24]根據感染特點提出環境感染和接觸感染的觀點。環境感染的主要病原菌為大腸桿菌（E.coli），其次有停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）、乳房鏈球菌（S.uberis）和副乳房鏈球菌（S.parauberis）等；接觸感染的主要病原菌是金黃色葡萄球菌（S.auresu）和無乳鏈球菌（S.agalactiae）。我們在樣品E中不僅檢測到，且檢測到近一半的序列（49%）為S.agalactiae，說明該品牌的該批次生奶可能受到了嚴重污染。所以我們懷疑E樣品奶源已有患有乳腺炎的奶牛，盡管這些奶牛可能沒有表現乳腺炎的病癥。

3.5牛奶中的耐冷細菌耐冷細菌是牛奶的主要腐敗菌，它們被定義為能在7℃生長的細菌[25]。許多的研究者已經報道，在牛奶冷藏過程中耐冷細菌會大量繁殖，從而影響牛奶質量。在農場和加工廠，制冷技術在保證牛奶品質的同時，也為耐冷細菌的生長提供了選擇條件[26]。所以隨著生奶低溫保存的時間延長，耐冷細菌的數目就會隨之增多。Raats等[9]利用基于16SrRNA克隆測序的DGGE對生牛奶在制冷條件下細菌菌群的變化進行研究。結果表明，在農場到乳制品加工廠的冷藏過程中，Gammaproteobacteria是主要的細菌類群，尤其是耐冷細菌Pseudomonas占總數的46%~63%。Rasolofo等[10]的結果則顯示，隨著牛奶冷藏時間的延長，Gammaproteobacteria和Bacilli成為兩大主要的細菌類群，分別占總細菌株的40.3%和40%。我們的結果顯示，C、D樣品中Pseudomonas占全部序列的30%和41%，這與文獻報道的結果基本一致。多樣性分析表明樣品A和樣品B在5個樣品中多樣性低（分別為0.61和0.65），聚類分析發現其不同的序列數少且集中在一起。Pseudomonas的序列數分別占A和B樣品總體的71%和75%，其中相同的序列數分別為56和54，占A和B樣品中Pseudomonas序列的86%和79%。因此我們推測生奶在加工為市售牛奶前，樣品A和B比樣品C、D、E低溫儲存的時間更長，使得耐冷細菌Pseudomonas大量繁殖，結果降低了牛奶中細菌的菌群多樣性。本研究中，我們利用16SrRNA-V3區的序列信息分析了4個品牌市售牛奶的細菌菌群結構。結果證明16SrRNA-V3區克隆測序方法可從乳品生產銷售的終端產品中檢測細菌群落，使牛奶監測不再僅限于生奶階段；同時檢測結果也可以提供某些奶源信息。本研究表明各品牌牛奶中的細菌總數均處于相對較高水平，各品牌牛奶間菌群分布不同，菌群多樣性存在明顯差異—原因可能來自奶源環境、生奶儲存時間以及奶牛自身的健康狀況，要確定具體原因需進一步驗證。

作者：李引強律娜吳俊朱寶利張慶波王秋涯高可心單位：河北聯合大學基礎醫學院中科院微生物所病原微生物與免疫學重點實驗室清華大學附屬中學中國人民大學附屬中學