運(yùn)用生物信息學(xué)分析牛奶中細(xì)菌菌群
前言：本站為你精心整理了運(yùn)用生物信息學(xué)分析牛奶中細(xì)菌菌群范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價(jià)值，我們的客服老師可以幫助你提供個(gè)性化的參考范文，歡迎咨詢。
目前，對(duì)于環(huán)境中微生物菌群的研究主要分為培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)法是利用不同的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的種類。該方法具有一定的針對(duì)性，但是費(fèi)時(shí)耗力，且只能獲得可培養(yǎng)微生物的信息，對(duì)于那些不可培養(yǎng)的細(xì)菌則無(wú)能為力[11-13]。非培養(yǎng)的方法主要是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，直接從環(huán)境中提取細(xì)菌基因組DNA，再用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行分析研究，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，PCR-DGGE）、核酸雜交（Hybridization）、高通量測(cè)序（High-throughputsequencing）等。目前分析細(xì)菌的16SrRNA序列已經(jīng)成為細(xì)菌菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。16SrRNA全長(zhǎng)為1.5~1.6kb，包括9個(gè)“高度可變區(qū)”，其中V3區(qū)（nucleotides433-497）的位點(diǎn)456-479在細(xì)菌間的比對(duì)中獲得最多的單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）,能夠鑒定110多種細(xì)菌[14]。研究者已經(jīng)利用16SrRNA-V3區(qū)結(jié)合PCR-DGGE、測(cè)序等技術(shù)對(duì)環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)行鑒定及菌群分析研究[9,15]，其中包括對(duì)牛奶中細(xì)菌的鑒定和菌群分析[11]，并發(fā)現(xiàn)牛奶中存在多種細(xì)菌，具有較高的菌群多樣性。本研究中，我們從市售的常溫牛奶和巴氏消毒牛奶中提取細(xì)菌基因組DNA，利用通用引物擴(kuò)增牛奶中細(xì)菌的16SrRNA-V3區(qū)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定樣品中細(xì)菌總數(shù)；通過(guò)克隆、測(cè)序，獲得16SrRNA-V3區(qū)的序列信息，再進(jìn)行序列比對(duì)、鑒定菌種。分析不同品牌牛奶中的細(xì)菌數(shù)量、菌群分布，推測(cè)生奶的奶源環(huán)境、儲(chǔ)存時(shí)間及奶牛的健康情況。
1材料和方法
1.1材料與試劑
1.1.1樣品收集:從超市購(gòu)買了4個(gè)品牌的5種牛奶，包括高溫滅菌奶（常溫保質(zhì)期30天）和巴氏消毒牛奶（2℃~6℃保質(zhì)期7天），分別標(biāo)記為A、B、C、D、E。樣品ABC為高溫滅菌奶，DE為巴氏滅菌奶，C和D是同一品牌的常溫奶和巴氏奶，每種牛奶收集了同一批次的3個(gè)樣品。所有的樣品均在2012年5~7月進(jìn)行取樣。
1.1.2試劑：QIAgenDNAStoolextractionkit－購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，PremixTapVersion2.0、pMD18-TVector－購(gòu)自日本Takara公司，Cycle-Purekit－購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，TransDH5αCompetentCell－購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，KAPASYBRFASTqPCRKit－購(gòu)自美國(guó)KAPA公司。
1.2儀器與設(shè)備NanodropND1000分光光度計(jì)－購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，GeneAmpPCRSystem2720ThermaCycler－購(gòu)自美國(guó)ABI公司，BeckmanAllgreX-22R離心機(jī)－購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，PowerPacBasic電泳儀－購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司，凝膠成像系統(tǒng)－購(gòu)自美國(guó)AlphaInnotech公司。ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀－購(gòu)自美國(guó)ABI公司。
1.3方法
1.3.1DNA提取取100mL的牛奶樣品用Collado[16]等（2009）的方法提取牛奶中的細(xì)菌DNA－7150g離心20min，棄掉上層溶液，收集沉淀，用5mLTE（1x）重新懸浮沉淀；7150g離心5min，棄掉上層溶液，沉淀用QIAgenDNAStoolextractionkit（QIAGEN）提取細(xì)菌基因組DNA。提取的DNA溶解在50μL的TE（1x）中，用NanodropND1000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DN段大小。樣品于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.216SrRNAPCR用通用引物338F-CCTACGGGAGGCAGCAG，534R-ATTACCGCGGCTGCTGG擴(kuò)增16SrRNA-V3區(qū)[17]。引物由上海生物生工（北京合成部）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：PremixTapVersion2.010μL，上下游引物各10μM，模板20ng，補(bǔ)水（PURELABUltra–ELGA純化水，高壓滅菌備用）到20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，100V，40min，紫外光下觀察電泳條帶（如圖1）。PCR產(chǎn)物用Cycle-Purekit（OMEGABIO-TEK，D6942-01）進(jìn)行純化，測(cè)定濃度。純化產(chǎn)物用于隨后的克隆實(shí)驗(yàn)。
1.3.3序列信息分析測(cè)序獲得的序列在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast進(jìn)行16SribosomalrRNAsequences（bacteria）的比對(duì)，當(dāng)MAXindent≥98%時(shí)，記錄該序列對(duì)應(yīng)的細(xì)菌屬名和一致的始末位點(diǎn)。用BioEdit軟件對(duì)所得的序列根據(jù)一致位點(diǎn)提取16SrRNA-V3區(qū)的擴(kuò)增序列，用ClustalX（1.83）進(jìn)行序列比對(duì)。RDP-classifier在線軟件rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp對(duì)所有序列進(jìn)行菌屬鑒定，對(duì)每個(gè)樣品的菌屬進(jìn)行歸類。用“1-ΣH2”（H是每種菌屬占樣本所有菌屬的百分比）來(lái)評(píng)估每個(gè)牛奶樣品中的DNA菌群多樣性[18]。PAUPversions4.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)生樹。
1.3.416SrRNA基因的Real-TimePCR定量細(xì)菌總數(shù)提取的牛奶中細(xì)菌DNA用于模板定量細(xì)菌總數(shù)，DNA克隆獲得的pMD18-16SrRNA重組質(zhì)粒用于標(biāo)準(zhǔn)品的制備。10倍梯度稀釋的質(zhì)粒用于實(shí)時(shí)定量PCR中標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成。反應(yīng)體系為：KAPASYBRGreenMasterMix（2×）10μL，上下游引物各4μM，模板20ng，補(bǔ)水到20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性3s，60℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)結(jié)果用7300SystemSDSSoftware進(jìn)行分析。每孔3個(gè)重復(fù)。
2結(jié)果分析
2.1DNA提取與PCR擴(kuò)增我們成功提取了5種牛奶的15個(gè)樣品的細(xì)菌基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示，DNA呈現(xiàn)彌散狀，沒有明顯的主帶。用16SrRNA-V3區(qū)的通用引物對(duì)全部樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約為190bp的擴(kuò)增片段，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶（圖1）。在15個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中隨機(jī)選擇了5個(gè)（每個(gè)品牌選擇一個(gè)樣本）進(jìn)行T-A克隆。每個(gè)樣品得到了至少1000個(gè)克隆，隨機(jī)選取100個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序（表1）。
2.2牛奶中的細(xì)菌總數(shù)利用檢測(cè)細(xì)菌的16SrRNA基因數(shù)量來(lái)反映牛奶中細(xì)菌總數(shù)。結(jié)果顯示，所有牛奶樣品中均含有大量的16SrRNA基因片段。考慮到不同種類細(xì)菌中16SrRNA基因的拷貝數(shù)在2~15個(gè)[19]，我們對(duì)絕對(duì)定量獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行最小化和最大化處理（各樣品中的細(xì)菌16SrRNA基因按照最小拷貝數(shù)和最大拷貝數(shù)計(jì)算），所得結(jié)果和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較（圖4）。按照每個(gè)細(xì)菌含有最少16SrRNA基因拷貝數(shù)計(jì)算獲得最大細(xì)菌總數(shù)，各品牌牛奶樣品中最大細(xì)菌總數(shù)均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
2.3菌種鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析我們對(duì)5個(gè)牛奶樣品的500個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，成功的獲得了472條16SrRNA-V3區(qū)的序列，其中有131種不同的序列。樣品A和B得到93條序列，其中A中有20種不同的序列，樣品B中有25種不同序列。C、D、E分別得到95、96、95條序列，不同的序列數(shù)目為39、51、32（表1）。菌屬鑒定的結(jié)果表明，472條序列中的452條序列可以鑒定到五個(gè)綱的17個(gè)屬：芽孢桿菌綱（Bacilli）占12%、黃桿菌綱（Flavobacteria）占3%、β-變形菌綱（Beta-proteobacteria）占2%、放線菌綱（Actinobacteria）占1%和γ-變形菌綱（Gamma-proteobacteria）占82%（表1）。另外的20條序列只能鑒定到綱的水平，分別為黃桿菌綱（5%）、β-變形菌綱（5%）和γ-變形菌綱（90%）。可以明確鑒定到屬的序列中，有58條序列鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌，分屬于棒狀桿菌屬（Corynebacterium），厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus），占總序列的12%。其中Corynebacterium只在樣品E中檢測(cè)到1個(gè)克隆；所有的10個(gè)Anoxybacillus克隆都是在D樣品中檢測(cè)得到，且與A.kestanbolensis有99%以上的相似性。在樣品C和E中都檢測(cè)到Streptococcus，分別占其所測(cè)序列的1%和49%。C樣品中的Streptococcus序列鑒定為嗜熱鏈球菌屬（S.thermophilus）；E樣品中的46個(gè)Streptococcus克隆全部與無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）有100%的相似性。革蘭氏陰性菌的序列占所有序列的83%，分屬于14個(gè)屬：假單胞菌屬（Pseudomonas），不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），沙雷氏菌屬（Srratia），氣單胞菌屬（Aeromonas），黃桿菌屬（Flavobacterium），水棲菌屬（Enhydrobacter），嗜冷菌屬（Psychrobacter），希瓦爾氏菌屬（Shewanella），金黃色桿菌屬（Chryseobacterium），腸桿菌屬（Enterobacter），詹森菌屬（Janthinobacteriu），無(wú)色桿菌屬（Achromobacter），微小菌屬（Microvirgula），戴米提亞菌屬（Demetria）。其中Pseudomonas最多，占全部序列的46%，其次為Acinetobacter，占23%，而且這兩種細(xì)菌都以較高比例存在于在所有樣品中。Pseudomonas和Acinetobacter在各個(gè)樣品中檢測(cè)到的比例分別為：A（71%，16%）、B（75%，13%）、C（30%，43%）、D（40%，17%）、E（16%，25%）（表1，圖3）。Serratia在樣品A（8%）和B（5%）中檢測(cè)到；Aeromonas存在于樣品B（1%）、C（1%）、D（13%）和E（1%）中；Flavobacterium在樣品C（8%）和D（3%）中發(fā)現(xiàn)。C樣品中有3%的序列為Enhydrobacter，比對(duì)結(jié)果顯示，與氣囊棲水菌（E.aerosaccus）有≥99%的序列相似性。樣品C克隆中有3%為Shewanella，序列比對(duì)結(jié)果證明為腐敗希瓦爾氏菌（S.putrefaciens）。樣品C和D中檢測(cè)到Psychrobacter，分別占比例為3%和1%。Chryseobacterium分布在樣品C和E中。Janthinobacterium在C和D中分別占1%和4%。
2.4優(yōu)勢(shì)菌群的系統(tǒng)發(fā)育樹分析各牛奶樣本中不但檢測(cè)到的菌屬不同，即使是同一菌屬，其序列（菌株）也存在差異，圖4a是所有Pseudomonas序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)樣品A、B的序列集中在上端的分支上，中間的分支中大部分序列出自樣本E，而樣品C、D的序列集中在下端的分支上。說(shuō)明同一品牌牛奶中的細(xì)菌可能具有更近的親緣關(guān)系。圖4b是所有Acinetobacter序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，與圖4a情況相似，同一品牌牛奶中的序列相似性更高。
2.5市售牛奶中細(xì)菌的多樣性我們發(fā)現(xiàn)各個(gè)樣品中能夠明確鑒定的屬為：A到D依次為5個(gè)、5個(gè)、11個(gè)、8個(gè)、8個(gè)，各個(gè)樣品中有一定差異。為了更好了解牛奶樣本中的細(xì)菌多樣性，我們利用各樣品中所有的序列進(jìn)行了多樣性分析。5個(gè)樣品A、B、C、D、E的值分別為0.61、0.65、0.93、0.94、0.74，平均值為0.78。可以看出，A和B的菌群多樣性明顯低于C和D。
3討論
3.1基于16SrRNA-V3區(qū)克隆測(cè)序鑒定細(xì)菌菌群用分子生物學(xué)技術(shù)直接從環(huán)境中提取細(xì)菌DNA并對(duì)其進(jìn)行分析，再結(jié)合PCR擴(kuò)增等方法研究環(huán)境中菌群多樣性及結(jié)構(gòu)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外比較常見的研究方法。如林海龍等[19]對(duì)中藥廢水污泥中的菌群結(jié)構(gòu)的分析，Rasolofo等[10]、Raats等[9]對(duì)生奶中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)以及冷藏過(guò)程中的菌群結(jié)構(gòu)的變化情況的分析。幾乎所有這些研究都基于基本的培養(yǎng)法獲得生牛奶（即原料奶）中細(xì)菌的單克隆，再通過(guò)大量培養(yǎng)后提取細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。然而市售牛奶，尤其是高溫滅菌的市售牛奶，細(xì)菌DNA在牛奶中已經(jīng)成游離狀態(tài)，對(duì)DNA提取的要求比較高。所以如何從市售牛奶中提取到可以用于PCR擴(kuò)增的DNA成為整個(gè)研究成功的關(guān)鍵。本研究通過(guò)增加牛奶的使用量，利用提取糞便中細(xì)菌DNA的試劑盒成功的從市售牛奶中提取到細(xì)菌DNA，并對(duì)這些DNA進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA-V3區(qū)的PCR擴(kuò)增，成功獲得了目的產(chǎn)物（圖1）。通過(guò)T-A克隆和測(cè)序分析，得到了不同品牌的5種市售牛奶中菌群的16SrRNA-V3序列信息，并對(duì)其進(jìn)行比對(duì)、鑒定。所得結(jié)果表明，用該方法可以提取到市售牛奶中的細(xì)菌DNA，所提基因組DNA可以用來(lái)進(jìn)行下游的實(shí)驗(yàn)研究。
3.2各品牌牛奶中的細(xì)菌總數(shù)均處于相對(duì)較高水平牛奶中細(xì)菌總數(shù)是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。雖然牛奶中不可避免的存在一些細(xì)菌[1-3]，但是各種細(xì)菌的大量存在勢(shì)必影響牛奶的品質(zhì)[25]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各個(gè)品牌牛奶中細(xì)菌總數(shù)均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，然而相比較于乳業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的105個(gè)/mL細(xì)菌數(shù)量，各牛奶樣品中細(xì)菌總數(shù)均處于相對(duì)較高水平（圖2）。這與我國(guó)部分奶源依賴散戶養(yǎng)殖，飼料質(zhì)量和衛(wèi)生狀況都不佳造成細(xì)菌總數(shù)不易控制，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存導(dǎo)致的細(xì)菌繁殖，以及規(guī)模化養(yǎng)殖管理不善不無(wú)關(guān)系[21]。因此，監(jiān)督部門應(yīng)加強(qiáng)管理，促使國(guó)內(nèi)奶制品產(chǎn)業(yè)環(huán)境進(jìn)一步得到改善。
3.3不同品牌牛奶中的菌群結(jié)構(gòu)不同Tatsuro等[22]用通用引物擴(kuò)增16SrRNA-V3區(qū)的結(jié)果顯示Lactobacillus和Staphylococcus是牛奶中的主要菌群，Lafarge等[12]也得到的相同的結(jié)果；與此不同，Delbes等[11]的結(jié)果則表明牛奶中的優(yōu)勢(shì)菌群是Clostridium和Lactobacillus；我們?cè)谑惺叟Ｄ讨袡z測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌群是Acinetobacter和Pseudomonas，這與部分研究者的檢測(cè)結(jié)果一致[9,10]。即使同為優(yōu)勢(shì)菌群，我們發(fā)現(xiàn)它們?cè)?個(gè)樣品中所占比例也不盡相同（圖3）。然而在E樣本中，Acinetobacter和Pseudomonas已非優(yōu)勢(shì)菌群,進(jìn)化樹的聚類分析顯示同一屬的細(xì)菌中，來(lái)自同一樣本的細(xì)菌序列具有更高的相似性，其親緣關(guān)系更近（圖4）。各個(gè)樣本中的非優(yōu)勢(shì)菌的種類也不同，如Serratia存在于樣品A和B中，在樣品C、D檢測(cè)到了Janthinobacterium，只在樣品E中檢測(cè)到了Streptococcusagalactiae（表1）。Vacheyrou等[23]的研究表明大量的微生物菌群轉(zhuǎn)移是從牛棚到擠奶室，然后到牛奶中，而且牛奶中存在的大部分細(xì)菌都能在乳頭表面發(fā)現(xiàn)。因此我們推測(cè)不同品牌牛奶中菌群結(jié)構(gòu)的差異是由于奶源不同所造成的，而奶源環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。
3.4牛奶中的致病菌乳腺炎是世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)病率最高、造成經(jīng)濟(jì)損失的主要疾病之一。其病因多為細(xì)菌感染。RiffonR等[24]根據(jù)感染特點(diǎn)提出環(huán)境感染和接觸感染的觀點(diǎn)。環(huán)境感染的主要病原菌為大腸桿菌（E.coli），其次有停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）、乳房鏈球菌（S.uberis）和副乳房鏈球菌（S.parauberis）等；接觸感染的主要病原菌是金黃色葡萄球菌（S.auresu）和無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）。我們?cè)跇悠稥中不僅檢測(cè)到，且檢測(cè)到近一半的序列（49%）為S.agalactiae，說(shuō)明該品牌的該批次生奶可能受到了嚴(yán)重污染。所以我們懷疑E樣品奶源已有患有乳腺炎的奶牛，盡管這些奶牛可能沒有表現(xiàn)乳腺炎的病癥。
3.5牛奶中的耐冷細(xì)菌耐冷細(xì)菌是牛奶的主要腐敗菌，它們被定義為能在7℃生長(zhǎng)的細(xì)菌[25]。許多的研究者已經(jīng)報(bào)道，在牛奶冷藏過(guò)程中耐冷細(xì)菌會(huì)大量繁殖，從而影響牛奶質(zhì)量。在農(nóng)場(chǎng)和加工廠，制冷技術(shù)在保證牛奶品質(zhì)的同時(shí)，也為耐冷細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了選擇條件[26]。所以隨著生奶低溫保存的時(shí)間延長(zhǎng)，耐冷細(xì)菌的數(shù)目就會(huì)隨之增多。Raats等[9]利用基于16SrRNA克隆測(cè)序的DGGE對(duì)生牛奶在制冷條件下細(xì)菌菌群的變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在農(nóng)場(chǎng)到乳制品加工廠的冷藏過(guò)程中，Gammaproteobacteria是主要的細(xì)菌類群，尤其是耐冷細(xì)菌Pseudomonas占總數(shù)的46%~63%。Rasolofo等[10]的結(jié)果則顯示，隨著牛奶冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，Gammaproteobacteria和Bacilli成為兩大主要的細(xì)菌類群，分別占總細(xì)菌株的40.3%和40%。我們的結(jié)果顯示，C、D樣品中Pseudomonas占全部序列的30%和41%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致。多樣性分析表明樣品A和樣品B在5個(gè)樣品中多樣性低（分別為0.61和0.65），聚類分析發(fā)現(xiàn)其不同的序列數(shù)少且集中在一起。Pseudomonas的序列數(shù)分別占A和B樣品總體的71%和75%，其中相同的序列數(shù)分別為56和54，占A和B樣品中Pseudomonas序列的86%和79%。因此我們推測(cè)生奶在加工為市售牛奶前，樣品A和B比樣品C、D、E低溫儲(chǔ)存的時(shí)間更長(zhǎng)，使得耐冷細(xì)菌Pseudomonas大量繁殖，結(jié)果降低了牛奶中細(xì)菌的菌群多樣性。本研究中，我們利用16SrRNA-V3區(qū)的序列信息分析了4個(gè)品牌市售牛奶的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果證明16SrRNA-V3區(qū)克隆測(cè)序方法可從乳品生產(chǎn)銷售的終端產(chǎn)品中檢測(cè)細(xì)菌群落，使牛奶監(jiān)測(cè)不再僅限于生奶階段；同時(shí)檢測(cè)結(jié)果也可以提供某些奶源信息。本研究表明各品牌牛奶中的細(xì)菌總數(shù)均處于相對(duì)較高水平，各品牌牛奶間菌群分布不同，菌群多樣性存在明顯差異—原因可能來(lái)自奶源環(huán)境、生奶儲(chǔ)存時(shí)間以及奶牛自身的健康狀況，要確定具體原因需進(jìn)一步驗(yàn)證。
作者：李引強(qiáng)律娜吳俊朱寶利張慶波王秋涯高可心單位：河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中科院微生物所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室清華大學(xué)附屬中學(xué)中國(guó)人民大學(xué)附屬中學(xué)
