腦傷寧對(duì)大鼠腦缺血保護(hù)作用

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【摘要】目的觀察腦傷寧對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用。方法凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈4～5h后，夾閉頸總動(dòng)脈30min，再灌注90min，造成大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察腦傷寧對(duì)腦組織中生化指標(biāo)及腦電圖的影響。結(jié)果缺血再灌注造成腦組織嚴(yán)重?fù)p傷，腦組織中水、Na+、Ca2+含量及丙二醛(MDA)含量較對(duì)照組明顯增高，而超氧化物歧化酶(SOD)活力較對(duì)照組降低，并伴有腦電圖異常和腦組織結(jié)構(gòu)病理性改變。夾閉頸總動(dòng)脈前30min腹腔注射腦傷寧能降低腦組織中水、Na+、Ca2+含量及MDA含量，并提高SOD活力，對(duì)組織學(xué)檢查及腦電圖也有所改善。結(jié)論腦傷寧對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】腦傷寧；腦缺血；再灌注損傷；Ca2+超載

Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofNaoshangningrecipeonbraininjuryinrats.MethodsThebilateralvertebralarteriesofratswereoccluded,and4～5hlater,thecarotidarteriesofratsintheconsciousconditionwereoccludedfor30minfollowedbyreperfusionfor90min.TheeffectsofNaoshangningrecipeonthecontentsofwater,Na+,andCa2+incortex,malondialdehyde(MDA)contentandsuperoxidedismutase(SOD)activityinbrainhemispheres,aswellastheEEGactivitieswereobserved.Results30minischemiaand90minafterreperfusion,thecontentsofwater,Na+,Ca2+,andMDAwereincreased,andtheSODactivitywasreducedwithabnormalEEGactivityandischemicinjuryinthebraintissues.Naoshangningrecipedecreasedtheelevatedwater,Na+,Ca2+,andMDAcontents,increasedtheSODactivity,reducedtheischemicinjuryofbraintissue,andpromotedtherecoveryofEEGactivities.ConclusionNaoshangninghasprotectiveeffectsoncerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.

Keywords:Naoshangningrecipe;cerebralischemia;reperfusioninjury;Ca2+overloading

腦傷寧是武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)科王安國(guó)教授之經(jīng)驗(yàn)方，由川芎、當(dāng)歸、白芍、琥珀、鉤藤、遠(yuǎn)志、茯苓、夜交藤等中藥組成，具有活血化瘀、寧心安神、平肝熄風(fēng)、健脾除濕之功效。早期藥理學(xué)研究［1］表明腦傷寧可使高血黏模型大鼠的全血黏度、血漿黏度及紅細(xì)胞壓積明顯降低，為其臨床應(yīng)用提供初步理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究腦傷寧對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1材料和儀器

1.1藥材

實(shí)驗(yàn)所需中藥材均購(gòu)自湖北省中藥材公司,由武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部質(zhì)檢科鑒定。

1.2藥物與試劑

丁咯地爾注射液，批號(hào)01754，法國(guó)施維雅藥廠生產(chǎn)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號(hào)20031004；丙二醛(MDA)試劑盒，批號(hào)20030811，均購(gòu)自南京建成生物制劑研究所。

1.3動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量300～350g，10～12月齡，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2003-0004。

1.4儀器

AA-670原子分光光度計(jì)（日本島津公司），RM-6200型多道生理記錄儀（日本島津公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1腦傷寧湯劑的制備

參照文獻(xiàn)［1］的方法制備。

2.2模型的建立與給藥

大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：即假手術(shù)（sham）組及單純?nèi)毖俟嘧?IR)組，腦傷寧2個(gè)劑量組及丁咯地爾組。四血管結(jié)扎全腦缺血模型的制備參考文獻(xiàn)［2］。大鼠腹腔注射水合氯醛400mg·kg-1后，固定于立體定位儀，電燒灼凝閉兩側(cè)椎動(dòng)脈，然后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并置套扣待用。置電極于大鼠額頂，描記腦電圖(EEG)。手術(shù)后4～5h，待大鼠完全清醒后，試驗(yàn)動(dòng)物分別腹腔注射25、100mg·kg-1腦傷寧，或5mg·kg-1丁咯地爾注射液，30min后扣閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈達(dá)30min，松扣后再灌注90min。sham組同樣手術(shù)，但不阻斷動(dòng)脈。

2.3檢測(cè)指標(biāo)

再灌注結(jié)束時(shí)迅速斷頭取出腦組織，去腦干和小腦，將腦組織劃“+”分為4個(gè)部分，3份立即低溫(-20℃)保存用于MDA含量、SOD活性和病理組織學(xué)檢查，1份用于測(cè)定腦組織水、Na+、Ca2+含量。其中腦水分用干濕重法，Na+、Ca2+含量用火焰原子吸收分光光度法［3］,鄰苯三酚改良法［4］測(cè)定SOD活性，硫代巴比妥酸法［5］測(cè)定MDA含量。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，對(duì)EEG的影響采用Ridit分析，其它采用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有顯著性。

3結(jié)果

3.1對(duì)腦缺血再灌注動(dòng)物死亡率及EEG的影響

在整個(gè)缺血及再灌注期間，IR組、腦傷寧25mg·kg-1組及丁咯地爾組分別有3、1、1只動(dòng)物因缺血損傷引起動(dòng)物死亡。四血管結(jié)扎后大鼠EEG電壓波幅變小，腦電很快抑制變平，按EEG變化程度分為5級(jí)［6］，即達(dá)到缺血前波幅100%屬1級(jí)，75%以上為2級(jí)，75%～25%為3級(jí)，25%以下為4級(jí)，幾乎呈等電位的為5級(jí)。sham組在整個(gè)缺血及再灌注期間，EEG變化均以Ⅰ級(jí)為主。而缺血再灌注組缺血期EEG變化Ⅳ級(jí)有3只，Ⅴ級(jí)有3只；再灌注期EEG變化Ⅳ級(jí)有2只，Ⅴ級(jí)有4只，經(jīng)Ridit分析，與sham組比較差異顯著，P<0.05。腦傷寧組EEG改變以Ⅲ級(jí)及Ⅳ級(jí)為主，經(jīng)Ridit分析，與IR組比較差異顯著，P<0.05或P<0.01，說(shuō)明腦傷寧可顯著改善EEG的恢復(fù)程度(見(jiàn)表1)。

表1對(duì)大鼠腦缺血再灌注后EEG幅度變化的影響（略）

Tab.1EffectonEEGinratsinducedbycerebralischemiareperfusion

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與缺血再灌注組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.2對(duì)腦組織水、Na+、Ca2+、MDA含量及SOD活性的影響

再灌注后IR組腦組織水、Na+、Ca2+以及MDA含量均明顯高于sham組(P<0.05或P<0.01)。腦傷寧組腦組織水、Na+、Ca2+，以及MDA含量明顯低于IR組(P<0.05或P<0.01)。而IR組腦組織SOD活性低于sham組(P<0.01)，腦傷寧組腦組織SOD活性明顯高于IR組(P<0.01)，與sham組接近(見(jiàn)表2)。

3.3對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)改變的影響

缺血再灌注造成神經(jīng)元錐體細(xì)胞腫脹、變形，乃至核固縮，核溶解，細(xì)胞壞死，間質(zhì)也變得疏松。腦傷寧能顯著減輕這種損傷性改變，使壞死細(xì)胞數(shù)目減少，可見(jiàn)到較為完整的錐體細(xì)胞，間質(zhì)也比較致密。

4討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)理涉及諸多方面，Ca2+超載與氧自由基的大量產(chǎn)生在其中扮演著重要的角色。本實(shí)驗(yàn)觀察到腦缺血再灌注損傷后大腦皮層Ca2+累積，MDA含量增加，與文獻(xiàn)［3］報(bào)道的結(jié)果一致，腦傷寧能明顯降低缺血再灌注后腦組織的Ca2+和MDA含量，增強(qiáng)SOD活性，顯示出抗Ca2+超載及抗氧自由基作用。

表2對(duì)大鼠腦缺血再灌注后生化指標(biāo)變化的影響（略）

Tab.2Effectonbiochemicalindexinducedbycerebralischemiareperfusioninrat

與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組比較：#P<0.05，##P<0.01

腦水腫是腦缺血的主要并發(fā)癥之一，同時(shí)又是加重腦缺血的原因。由于缺血缺氧致使腦組織能量耗竭，細(xì)胞膜Na+K+泵功能障礙，Ca2+ATP酶活性降低，導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生腦水腫。腦傷寧能劑量依賴性地減少缺血再灌注引起的鈉、水潴留，減輕腦水腫，提示腦傷寧可能阻止腦缺血造成的細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，從而防止細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載與細(xì)胞損傷。EEG的變化及形態(tài)學(xué)檢查也明確顯示了腦傷寧對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，從而在電生理及形態(tài)學(xué)方面證實(shí)了腦傷寧的腦保護(hù)作用。

綜上所述，腦傷寧通過(guò)降低腦內(nèi)Ca2+含量，減輕腦水腫，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善腦電圖，緩解錐體細(xì)胞的損傷壞死情況，從多個(gè)方面顯示了其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制與抗Ca2+超載和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)，此結(jié)果為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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