mRNA差異顯示方法

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哺乳動(dòng)物細(xì)胞約有100?000個(gè)不同的基因，在一定時(shí)間、空間中僅有10％～15％的基因表達(dá)，這種表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控［1］。運(yùn)用mrna差異顯示（differentialdisplay,DD）方法［2］，可將不同細(xì)胞類型或同一細(xì)胞在不同環(huán)境下表達(dá)的基因進(jìn)行比較，從分子生物學(xué)水平上提供信息，這對(duì)理解細(xì)胞的生命過程極有幫助。該技術(shù)一經(jīng)問世，立即得到廣泛應(yīng)用，但同時(shí)也遇到許多問題，所以Debouck［3］曾對(duì)該方法提出質(zhì)疑。現(xiàn)將DD的研究進(jìn)展簡(jiǎn)要綜述如下。

一、DD方法基本原理

DD的基本原理是將具有可比性的細(xì)胞在某一條件下可表達(dá)的mRNA群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的cDNA群體，以此為模板，利用一對(duì)特殊引物，即3anchor引物和5arbitrary引物，在一定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與mRNA相對(duì)應(yīng)的“標(biāo)簽”（tags），然后用變性聚丙烯酰胺測(cè)序膠分析其差別，將有差別的基因克隆化，進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)與功能。DD依賴三種技術(shù)：（1）mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)；（2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)；（3）DNA測(cè)序膠電泳技術(shù)。

二、DD方法的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用

用某一方法來尋找mRNA表達(dá)的差異，至少要滿足下列要求：（1）在一定時(shí)間、空間里，每一個(gè)細(xì)胞約有15000種mRNA表達(dá)，其中除少數(shù)屬高豐度表達(dá)外，大量的屬于低豐度表達(dá)，即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA；（2）重復(fù)性要好；（3）實(shí)驗(yàn)過程中能夠步步驗(yàn)證比較（side-by-sidecomparison）；（4）得到的產(chǎn)物能代表相應(yīng)的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相應(yīng)的cDNA序列；（5）省時(shí)，簡(jiǎn)便易行。

既往對(duì)mRNA的比較研究中多用減數(shù)雜交方法［4］（subtractionhybridization），該方法靈敏，可顯示低豐度RNA，但是步驟復(fù)雜，需時(shí)較長(zhǎng)，而且在得到最終結(jié)果前無法步步驗(yàn)證對(duì)照比較，故不易重復(fù)，并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點(diǎn)對(duì)RNA來源不易者（如手術(shù)活檢標(biāo)本）極不利［5，6］。

DD的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）僅需0.2μg總RNA作為起始材料；（2）可同時(shí)分析多組樣品；（3）敏感性高，可檢出低豐度mRNA；（4）實(shí)驗(yàn)周期短，約8天即可完成［7］，便于重復(fù)；（5）最突出的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過程中可步步驗(yàn)證比較。可簡(jiǎn)單地將DD的特點(diǎn)概括為“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。

DD方法因有上述優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。例如：Musholt等［8］應(yīng)用DD方法對(duì)手術(shù)切下的髓樣甲狀腺癌標(biāo)本與局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的表達(dá)基因MDF-1和MDF-2，并認(rèn)為這兩個(gè)基因在髓樣甲狀腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中起了重要作用；Zuo等［9］研究潰瘍性結(jié)腸炎的粘膜細(xì)胞，以正常結(jié)腸粘膜細(xì)胞作對(duì)照，找到了25個(gè)表達(dá)基因，其中有些與甲狀旁腺瘤、T細(xì)胞受體-β、卵巢癌等表達(dá)的基因同源。

關(guān)于神經(jīng)再生問題，Livesey等［10］發(fā)現(xiàn)了Reg-2基因，并認(rèn)為該基因是哺乳類動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生的關(guān)鍵基因。

在骨科領(lǐng)域，也有許多用DD方法的研究，Ryoo等［11］找到了一個(gè)與成骨細(xì)胞表型發(fā)育有關(guān)的細(xì)胞增殖標(biāo)志基因PROM-1（proliferatingcellmarker）。更令人鼓舞的是，Boden等［12］用一種新的骨形成蛋白LMP-1基因轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞，再作局部基因治療，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中成功地進(jìn)行了脊柱融合，LMP-1基因就是用DD方法克隆出來的。

此外，DD還應(yīng)用于心血管病［13］、糖尿病［14］、胚胎發(fā)育［15］、先天性疾病［16］以及藥理學(xué)［17］和眼科學(xué)［18］等。不僅用于動(dòng)物和人類，還應(yīng)用于植物分子生物學(xué)研究［19］。

三、存在的問題與對(duì)策

DD方法存在的問題概括起來有兩方面：一是假陽性多（約50％～70％），二是得到的有差異cDN段短（約為110～500bp）。因?yàn)檫@兩個(gè)問題，使許多研究者踟躕不前，這也是Debouk［3］提出質(zhì)疑的原因之一。

產(chǎn)生假陽性的原因，在于以下4個(gè)環(huán)節(jié)：（1）提取總RNA時(shí)，有染色體DNA污染，此DNA作為模板在PCR過程中被擴(kuò)增；（2）從聚丙烯酰胺膠上挑選有差異條帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間信號(hào)對(duì)比不夠顯著；（3）在克隆階段挑選陽性菌落時(shí)，未能排除基因克隆中的假陽性；（4）研究中多次使用PCR技術(shù)，很難避免實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的交叉污染。

解決這一問題的對(duì)策是：（1）提取RNA操作嚴(yán)格，得到的RNA必須經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化，去除染色體DNA污染。（2）從聚丙烯酰胺膠上切取有差異條帶時(shí)，首選實(shí)驗(yàn)與對(duì)照間信號(hào)差異顯者，最好是互為有或無的關(guān)系；如果僅僅是強(qiáng)與弱的關(guān)系，放在次選位置上。（3）即使是差異顯著地顯現(xiàn)為一條帶，也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳動(dòng)而成，有可能是結(jié)構(gòu)不同而分子量相同的cDNA共泳動(dòng)（Co-migrat）的結(jié)果。對(duì)此，可用mSSCP方法區(qū)別開來［7］。也可在基因克隆挑選時(shí)，用Reversenorthern原理作菌落原位雜交進(jìn)行篩選［20］。（4）關(guān)于交叉污染問題的克服應(yīng)服從分子生物學(xué)一般原則。（5）有差異基因的最終確認(rèn)是用Northern雜交，如果選取了十幾或幾十條差異條帶，用Northern雜交工作量太大，若用Reversenorthern雜交則比較簡(jiǎn)便［20］。

DD擴(kuò)增片段較短(≤500bp)，且擴(kuò)增片段多位于3UTR（3untranslatedregion）范圍內(nèi)，很少能擴(kuò)增到ORF（openreadingframe）范圍內(nèi)。這一缺點(diǎn)是由使用的特殊引物所決定的，因此DD得到的是mRNA的標(biāo)簽（tags）；由此帶來另一個(gè)問題，即這一位于3UTR范圍的標(biāo)簽與Genebank數(shù)據(jù)庫比較時(shí)，多數(shù)情況是與EST（expressionseguencetags）比較，常不能滿足研究者的要求。

解決這一問題的對(duì)策是：（1）應(yīng)用TargetedDD方法，基本原理是將5端引物延長(zhǎng)，增加擴(kuò)增片段的特異性［21，22］；或者用Stone和Wharton［23］報(bào)道的“targetedrNAfingerprinting”方法。這樣有可能使擴(kuò)增片段特異性高，減少假陽性率，同時(shí)可能在Genebank數(shù)據(jù)庫中得到更多結(jié)構(gòu)與功能方面的信息；（2）用得到的cDN段作probe篩選相應(yīng)cDNA文庫，得到cDNA全序列，以便于基因結(jié)構(gòu)與功能研究。

四、展望

了解細(xì)胞在某一條件下的基因表達(dá)，對(duì)闡明生命過程(如生長(zhǎng)發(fā)育與分化、細(xì)胞凋亡與衰老等生理過程)以及炎癥、腫瘤、心腦血管疾病等病理過程極為重要。DD方法在應(yīng)用中被不斷完善，同時(shí)也有更新的技術(shù)問世，如DNAmicroarrays［24］，把大量寡核苷酸片段排列在相似于一種大規(guī)模集成電路式的生物芯片上，一次可完成數(shù)量相當(dāng)可觀的反應(yīng)，提供的信息是目前所有基因表達(dá)研究技術(shù)不可比擬的。但是，該方法在反應(yīng)信號(hào)檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理等方面需要昂貴設(shè)備，比較起來，DD方法還是有其優(yōu)越性，如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，技術(shù)應(yīng)用得當(dāng)，相信對(duì)分子生物學(xué)研究有幫助。

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