略談克隆細(xì)胞的醫(yī)學(xué)作用

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一、資料

純化產(chǎn)物的鑒定純化產(chǎn)物經(jīng)Westernblot分析，無雜帶（圖略）。純化的重組MSP1α和MSP1β蛋白純度分別可達(dá)93%和91%。重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定以重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見774和2300bp的目的基因條帶，大小與預(yù)期相符；重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β的雙酶切產(chǎn)物可見774和2300bp的目的基因片段，大小與預(yù)期相符。MSP1α與MSP1β基因測序結(jié)果與GenBank上登錄的基因序列核苷酸同源性均達(dá)95.5%，氨基酸同源性分別達(dá)89.5%和90.0%。表達(dá)產(chǎn)物的鑒定重組菌的最佳誘導(dǎo)時間均是4h，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，可見相對分子質(zhì)量約58000的MSP1α蛋白條帶及107000的MSP1β蛋白條帶，大小與預(yù)期相符。表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式存在，MSP1α和MSP1β表達(dá)量分別占菌體總蛋白的31%和14%。

二、重組蛋白免疫原性的鑒定

在相對分子質(zhì)量約58000和107000處可見特異性反應(yīng)條帶，而陰性對照（MSP1α蛋白加入兔抗MSP1β血清或MSP1β蛋白加入免抗MSP1α血清）無此條帶重組蛋白在大腸埃希菌外膜的表達(dá)IFA法檢測結(jié)果顯示，免疫前的IgY抗體不能與表達(dá)MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發(fā)生反應(yīng)，而1∶800稀釋度以上的抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可與表達(dá)MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發(fā)生反應(yīng)。。重組蛋白對牛紅細(xì)胞的黏附作用HA檢測結(jié)果顯示，重組MSP1α和MSP1β蛋白可黏附至牛紅細(xì)胞上，表達(dá)MSP1α蛋白的重組菌對紅細(xì)胞的吸附率為56.4%，表達(dá)MSP1β蛋白的重組菌對紅細(xì)胞的吸附率為52.7%，空菌體對紅細(xì)胞的吸附率僅為9.6%，見圖7。HI檢測結(jié)果顯示，經(jīng)抗MSP1α和MSP1β的IgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細(xì)胞的吸附率分別為6.8%和9.4%，經(jīng)PBS處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細(xì)胞吸附率分別為53.2%和49.3%3討論Viseshakul等于2000年從佛羅里達(dá)分離株中分離的A.marginale對MSP1β基因的測序明確了兩個編碼MSP1β1和MSP1β2全長基因。Camacho-Nuez等也于2000年從佛羅里達(dá)分離株中發(fā)現(xiàn)另外3條MSP1β全長基因。MSP1α細(xì)胞外氨基末端區(qū)域包含串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列與A.marginale對牛紅細(xì)胞和蜱細(xì)胞的黏附密切相關(guān)。MSP1α與A.marginale通過蜱的感染及傳播有關(guān)。本實驗中表達(dá)的重組MSP1α和MSP1β蛋白可誘導(dǎo)兔和雞產(chǎn)生特異性的抗體，該抗體可與重組MSP1α和MSP1β蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；MSP1α和MSP1β蛋白可在大腸埃希菌細(xì)胞外膜上表達(dá)，無表達(dá)時采用IFA檢測，熒光強(qiáng)度減弱，表明MSP1α和MSP1β蛋白可能是A.marginale對蜱和牛紅細(xì)胞黏附力的基礎(chǔ)。重組MSP1α和MSP1β蛋白在大腸埃希菌表面可凝集牛紅細(xì)胞，而抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可抑制該凝集，提示MSP1α和MSP1β蛋白對紅細(xì)胞有黏附功能。HA試驗結(jié)果顯示，重組MSP1α蛋白對紅細(xì)胞的吸附率為56.4%，而重組MSP1β蛋白對紅細(xì)胞的吸附率為52.7%。經(jīng)抗MSP1α和MSP1βIgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白，對紅細(xì)胞的吸附率分別僅有6.8%和9.4%，與Tamekuni等的研究結(jié)果相似，Tamekuni等認(rèn)為A.mar-ginale能識別牛紅細(xì)胞的表面受體，并可相互作用，表明MSP1α和MSP1β蛋白對紅細(xì)胞有黏附功能。

三、總結(jié)

綜上所述，本實驗闡明了A.marginale中MSP1α和MSP1β重組蛋白菌外膜上獲得有效表達(dá)，并確認(rèn)了MSP1α和MSP1β蛋白在侵入紅血球過程中起到黏附素的作用，表明這2種蛋白在控制牛A.marginale感染方面具有重要作用。以其為研究對象進(jìn)行A.marginale亞單位疫苗的研制也取得了相應(yīng)的成果。隨著對牛邊緣無漿體病認(rèn)識的不斷深入，與其相關(guān)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究必將得到進(jìn)一步開展，尤其在該病的防控、致病機(jī)理及新型疫苗研制等方面將取得突破性的進(jìn)展。

作者：胡林森單位：新疆國防大學(xué)