探研水稻相關基因的克隆技術

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1不定根和主根相關基因

OsIAA23第II結構域發生突變后,純合突變體Osiaa23表現為無不定根、無側根和無根冠,并且該基因在發育過程中特異性在主根、不定根和側根根尖的靜止中心表達,推測是生長素信號在根尖靜止中心被中斷導致突變表型,說明生長素信號傳導對于靜止中心細胞維持功能是必需的,且OsIAA23基因介導了靜止中心的生長素信號傳導.與擬南芥GNOM1同源的水稻基因CRL4/OsGNOM1編碼鳥嘌呤核苷酸交換因子,它作用于二磷酸腺苷-核糖基化因子,該基因突變后影響水稻體內的生長素的極性運輸,從而影響不定根原基的起始,導致突變體不定根缺失,并且側根的發生也受到嚴重的抑制,同時向地性缺失.水稻的主根在苗期對水稻生長發育有所貢獻,但根系的主干,成熟水稻的數目可以達到幾百條.水稻的構造與主根幾乎完全相同,但其屬于胚后發育的器官,發生的位點一般在莖基部未伸長的低節位上.原基起始于鄰近維管束的中柱鞘最內層的分生細胞,通過1~2次的平周分裂形成不定根原基的原始細胞,其中,外層原始細胞發育成根冠的原始細胞,內層細胞發育為表皮－內皮層、中柱原始細胞,最終形成根冠、表皮、內皮層、皮層和維管組織等.不定根的整個發生與發育過程可以分為原始細胞的建立、表皮－內皮層、中柱和根冠原始細胞的建立、表皮和內皮層的分化、皮層的形成、不定根基本組織的建立、細胞開始伸長及液泡化和不定根原基出現等7個連續的階段.目前克隆到的水稻不定根基因大多與生長素信號傳遞通道相關,主要調控不定根的起始和發生.第1個被克隆的控制不定根發育基因是ARL1/CRL1.不定根缺失突變體在不定根原基形成原始細胞的第1次平周分裂中受到抑制,從而不能形成不定根原基,導致不定根缺失.ARL1/CRL1基因編碼1個植物特異的結構域的轉錄因子,CRL1啟動子上的1個蛋白的直接靶子,其基因表達受AUX/IAA正調控,說明CRL1通過生長素信號途徑調控不定根原基的起始.OsPIN1是水稻的一個生長素輸出載體,該基因的RNAi轉基因植株的不定根數量呈現大幅下降,說明不定根的發生與發育受生長素的影響和調控.突變體的不定根原基能正常形成,但不定根形態建成后不能突破表皮,且呈不定根缺失表型,外源生長素能夠部分回復突變體不定根,推測OsCAND1可能通過影響生長素信號調控不定根形態建成后的G2到M期細胞分裂過程有些與生長素信號傳遞相關的根系基因的作用呈多效性,不但調控不定根起始和發生,同時也會影響到主根和側根等性狀.將水稻OsIAA3第II結構域的Pro突變為Leu后的Osiaa3突變體表現為主根變短,不定根與側根數目顯著減少,對生長素不敏感和重力反應遲鈍.超表達OsIAA1基因在外加生長素處理時,主根伸長增加,側根數目增多,但不定根的數量減少.生長素響應因子OsARF16是調控生長素響應基因表達的轉錄因子,基因被敲除后的突變體Osarf16對生長素不敏感,削弱主根、側根和根毛對外源生長素和缺磷的響應.不定根的起始與發生不但受生長素調控,細胞分裂素和其它激素也共同參與這個調控過程基因發生突變后表現不定根缺失或稀少,而超表達該基因的轉基因水稻產生大量的不定根,并在異位產生不定根.WOX11同時受到生長素和細胞分裂素的誘導,細胞分裂素雙元信號系統中A型的基因直接受WOX11負調控,表明該基因可能是生長素和細胞分裂素信號傳導的整合器,并通過RR2調節不定根發育過程中的細胞增殖.突變體因不定根原基起始的缺陷,呈不定根稀少的表型,CLR5基因編碼的蛋白屬于P2/ERF轉錄因子家族,雖然它與CRL1一樣均是ARF蛋白的直接靶子受生長素的調控,但遺傳學證據證明它們對不定根起始的作用是屬于不同的信號途徑,CLR5基因受生長素誘導后,通過正向調控OsRR1基因抑制細胞分裂素的信號通道,從而促進不定根的發生,表明它參與了水稻體內生長素信號對細胞分裂素信號的作用.

2實驗

Anti-OsCK1的轉基因植株的根系主根變短、不定根和側根數目減少,但外加IAA培養時根系呈正常的發育,推測OsCK1參與生長素的代謝從而調控根系的生長發育,此外,anti-OsCK1的轉基因植株對脫落酸和油菜素內酯不敏感,說明它有可能參與不同的激素信號途徑.基因編碼一種金屬硫蛋白,在水稻中表達被細胞分裂素下調,該基因的RNAi植株根系中細胞分裂素濃度顯著上升,主根變短,不定根和側根數量減少,超表達的轉基因植株根系中細胞分裂素濃度略有下降,不定根數目增多,并且有很多粗側根產生.說明在根系生長發育過程中存在OsMT2b基因對內源細胞分裂素濃度的反饋調節機制.相對來說,造成主根、不定根甚至側根變短的短根突變基因涉及機理比較廣泛,與離子通道型谷氨酸受體基因、糖基化、細胞壁多糖和纖維素合成、蔗糖代謝、金屬離子等相關.水稻短根突變體glr在苗期主根和不定根變短,不定根、側根和根毛的發生不受到影響,GLR3.1基因編碼與植物離子通道型谷氨酸受體的基因,它與根系的生長發育相關,參與調控根尖分生組織細胞的分裂和凋亡,該基因突變后呈短根表型.OsGNA1基因參與糖基化供體UDP-GlcNAc合成途徑,OsGNA1基因突變后,內源UDP-GlcNAc水平顯著降低,導致N或O連接的GlcNAc糖基化水平相應降低,同時細胞代謝細胞形狀和微管穩定性出現異常,產生短根表型.突變體Osdgl1因主根、不定根與側根生長受阻呈短根表型,但不定根和側根的數量及根毛與野生型沒有顯著差異,細胞學實驗發現是因為細胞分裂與細胞伸長二個方面的原因導致短根,并伴有細胞死亡和活性氧的改變.OsDGL1基因編碼多萜長醇二磷酸寡糖蛋白環糊精糖基轉移酶亞基前體,當基因突變時導致根部組織的N-糖基化(N-glycosylation)缺陷,從而改變了根細胞壁的多糖合成.突變體Osglu3的主根和不定根長度變短,OsGLU3基因編碼水解纖維素β-1,4-糖苷鍵的β-1,4-葡聚糖內切酶,參與根細胞壁纖維素合成,通過影響根細胞的分裂及細胞的伸長來調控根系的發育.OsCyt-inv1基因編碼堿性/中性蔗糖轉化酶,其突變體Oscyt-inv1的主根、不定根和側根變短成短根表型,細胞學實驗發現細胞伸長受阻是造成短根的主要原因,在提供外源葡萄糖培養時,突變體的短根表型能恢復正常,說明OsCyt-inv1基因在根系生長發育中起著重要的作用.突變體Osspr1的主根、不定根和側根的伸長受到嚴重的抑制,呈短根系表型.OsSPR1基因編碼一個含有Armadillo重復域的線粒體蛋白,該基因突變造成植株對二價金屬離子錳、鐵、鋅的吸收受到抑制,說明OsSPR1基因參與根系的伸長和金屬離子的平衡.

3側根相關基因

突變體蛋白結構域II序列中的脯氨酸被亮氨酸所替代,且體內的基因表達減弱,表現為無側根表型,與Osiaa13突變體一樣其不定根發生與發育正常,說明OsIAA13和OsIAA11基因均特異調控側根原基的起始和發生.擬南芥等雙子葉植物側根起源于木質部極的中柱鞘細胞,水稻等單子葉植物側根起源于韌皮部極的中柱鞘和內皮層.除了上述與側根相關的水稻多效根系基因外,有2個特異調控側根原基起始發生的基因得到克隆,并且這2個基因編碼的蛋白都屬于Aux/IAA蛋白家族,且突變都發生在結構域II核心序列,導致Aux/IAA蛋白不能被泛素化后降解,而與ARF長久結合,阻斷生長素的信號傳導,進而影響與側根原基起始發生相關基因的表達.突變體Osiaa13的OsIAA13蛋白結構域II核心序列中的甘氨酸被絲氨酸所替代,表型為側根數目顯著減少,但不定根數目沒有減少.根毛相關基植物根表皮細胞可分為根毛細胞和非根毛細胞,根毛是表皮細胞外伸形成的管狀突出物.根表皮細胞分化成根毛細胞有三種類型:隨機模式(如水稻)、位置依賴性模式(如擬南芥)和不對稱分裂模式(如卷柏).根毛發育可分為表皮細胞特異化、起始、伸長和成熟四個階段[26].在根尖分生區根毛細胞與非根毛細胞開始出現形態差異,到了伸長區根毛開始發生,在成熟區根毛細胞成熟并完全分化.至今已有4個水稻根毛相關基因被克隆,并都與根毛的伸長相關.OsCSLD1與擬南芥KOJAK/AtCSLD3同源,編碼為1個纖維素合成酶基因.突變體csld1根毛只有野生型長度的30%左右,且形態異常,但密度與野生型沒有差異,因此OsCSLD1基因功能與根毛起始無關,主要調控根毛伸長.并發現OsCSLD1基因只在根毛中特異表達,超表達時會導致根毛比野生型更長.但隨后篩選到與csld1等位的突變體,呈無根毛表型,但根毛細胞有凸起,并發現OsCSLD1基因不只特異在根毛中表達,而是可以在包括地上部的多個組織中表達.OsAPY基因編碼了1個水解NTPs的三磷酸雙磷酸酶,該基因突變時,突變體rth1呈無根毛表型,但根毛細胞仍有凸起,說明OsAPY基因功能與OsCSLD1相似都參與根毛伸長,而與根毛起始無關.此外,OsAPY基因具有多效性,還調控了根的伸長和植株地上部的發育.是1個bHLH轉錄因子,當OsRHL1突變后,2個等位Osrhl1和Osrhl2的根毛性狀與突變體csld1和rth1相似,根毛伸長受到抑制后呈無根毛表型,但根毛起始正常.超表達OsRHL1能使根毛比野生型長1倍多,而且根毛數量變多,說明OsRHL1除調控根毛伸長外,可能還與表皮細胞特異化相關.OsEXPA17基因屬于EXPANSIN家族一員,發生突變后,水稻呈現短根毛,說明OsEXPA17參與調控根毛的伸長.互補實驗發現,EXPANSIN家族的OsEXPA30基因能回復OsexpA17突變體短根毛表型,擬南芥中同源的AtEXPA7基因能部分回復OsexpA17突變體短根毛表型.

作者:丁沃娜朱世華單位：寧波大學