探究昆蟲的克隆基因的制備方法

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1材料與方法

4～6周齡的清潔級家兔由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物場提供。莫氏巴貝斯蟲裂殖子的純化與總RNA的提取莫氏巴貝斯蟲臨潭株單克隆株G7由蘭州獸醫(yī)研究所蟲媒與蟲媒傳播病課題組提供。莫氏巴貝斯蟲的體外培養(yǎng)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，當(dāng)染蟲率達(dá)到8％～10％時，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，利用滲透壓差法進(jìn)行裂殖子的純化［15］。向100μL裂殖子中加入反復(fù)吹打以破碎細(xì)胞，加入200μL氯仿，12000×g離心10min。上層水相轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置10min，4℃12000×g離心10min。棄去上清，總RNA沉淀用750mL／L的乙醇洗滌1次，置于超凈臺內(nèi)吹干。最后用20μL無RNA酶的去離子水溶解，用微量核酸蛋白檢測儀測定濃度，并對其進(jìn)行凝膠電泳分析。1．3全長基因的RACE擴(kuò)增根據(jù)GenBank中公布的頂復(fù)門原蟲相關(guān)基因序列，在基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物，進(jìn)行基因的5′RACE和3′RACE擴(kuò)增，引物序列。RACE操作按照說明進(jìn)行。擴(kuò)增的RACE產(chǎn)物插入到pGEM－TEasy載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定為陽性的菌落，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。獲得的測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接和開放閱讀框預(yù)測。全長CDS的PCR擴(kuò)增與基因結(jié)構(gòu)分析actin，aldolase和trap基因全長的擴(kuò)增引物根據(jù)RACE的測序結(jié)果，在預(yù)測的開放閱讀框外側(cè)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，引物序列。分別以莫氏巴貝斯蟲cDNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后，克隆至pGEM－TEasy載體，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。原核表達(dá)載體的構(gòu)建與融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)全長基因的測序結(jié)果，利用PrimerPre－mier5．0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見，下劃線處為酶切位點(diǎn)。以莫氏巴貝斯蟲臨潭株G7cD－NA為模板，進(jìn)行基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，酶切產(chǎn)生具有黏性末端的基因分別與pGEX－4T－1載體的酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E．coilJM109感受態(tài)細(xì)胞中。用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落。經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組原核表達(dá)載體，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證正確的原核表達(dá)載體分別命名為，重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，37℃、200r／min培養(yǎng)至D600nm達(dá)到0．6～0．8時，加入IPTG使其終濃度為0．8mmol／L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h。4℃、3900×g離心10min，收集細(xì)菌沉淀，純化融合蛋白，操作步驟按說明書進(jìn)行。分析表達(dá)的重組蛋白，用微量核酸測定儀測定蛋白的質(zhì)量濃度。抗血清的制備、特異性檢測及效價測定融合蛋白免疫家兔前耳緣靜脈采血作為陰性血清。純化的融合蛋白和分別與等量的佐劑乳化后，以皮下多點(diǎn)注射法免疫家兔制備多克隆抗體。初次免疫時，每只家兔注射200μg，此后以100μg／只注射；每2周免疫1次，共免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑。末次免疫10d后，耳緣靜脈采血，分離抗血清進(jìn)行抗體效價與反應(yīng)性測定。用ELISA方法測定抗體效價，分別以純化的融．1RACE擴(kuò)增RACE擴(kuò)增獲得的和trap基因片段，經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上述基因5′和3′末端序列的測序結(jié)果進(jìn)行裝配、BLAST分析，

2結(jié)果

基因結(jié)構(gòu)分析擴(kuò)增的基因全長分別為1110、1199和2254bp，開放閱讀框大小分別為。將獲得的基因用BLAST／P軟件進(jìn)行同源性分析、開放閱讀框預(yù)測及基因特性分析，結(jié)基因沒有內(nèi)含子。trap基因由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，內(nèi)含子長度分別為39、36、38和37bp。并將所獲的aldolase基因序列登錄GenBank／NCBI，獲取登錄號。融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量大小約為，與預(yù)期融合蛋白的大小基本一致。利用純化融合蛋白，結(jié)果見圖4。經(jīng)微量核酸蛋白測定儀測得蛋白的質(zhì)量濃度分別為。純化的融合蛋白經(jīng)GST標(biāo)簽抗體識別，在預(yù)期大小的目的蛋白處出現(xiàn)單一條帶。結(jié)果表明，純化獲得了正確的融合蛋白，可以用于后續(xù)的家兔免疫制備多克隆抗體。多克隆抗體的鑒定及效價測定分別以純化的融合蛋白樣品GST－Actin、GST－Aldolase、GST－TRAP為抗原，獲得的家兔免疫血清為一抗（血清用大腸桿菌裂解物和GST蛋白中和處理后，經(jīng)ELISA驗(yàn)證該血清與大腸桿菌菌體蛋白和GST不發(fā)生反應(yīng)），分別用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AP標(biāo)記的鼠抗兔IgG為二抗，進(jìn)行ELISA和Western－blot鑒定。結(jié)果分別出現(xiàn)了分子質(zhì)量大小約74ku、76ku和118ku的單一條帶（見圖6），說明獲得的多克隆抗體具有良好的特異性。用免疫前的家兔血清作為對照，陽性血清用間接ELISA測定抗體效價。結(jié)果顯示免疫后抗血清的效價均高于1∶12800。

3討論

頂復(fù)門原蟲的醛縮酶具有雙重功能；一是催化糖酵解和糖異生，二是介導(dǎo)肌動蛋白絲與跨膜蛋白的相互作用，即把參與細(xì)胞黏附、滑行運(yùn)動和入侵相關(guān)的微線體蛋白（MIC）錨定在肌動蛋白馬達(dá)上，從而使微線體蛋白可以與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用。因此醛縮酶被認(rèn)為是抗寄生蟲感染藥物設(shè)計(jì)的分子靶位，此外醛縮酶還可以作為瘧疾的潛在診斷抗原。在瘧原蟲、弓形蟲的子孢子、牛巴貝斯蟲、吉氏巴貝斯蟲、隱孢子蟲和艾美耳球蟲中都發(fā)現(xiàn)了TRAP家族蛋白。TRAP在多種頂復(fù)門原蟲的入侵中起重要作用。大多數(shù)TRAP家族蛋白都具有整合素A樣結(jié)構(gòu)域和TSR結(jié)構(gòu)域；寄生蟲利用該結(jié)構(gòu)域結(jié)合紅細(xì)胞表面受體、多糖和磷脂樣分子。瘧原蟲子孢子TRAP蛋白的TSR和A結(jié)構(gòu)域結(jié)合肝細(xì)胞表面的硫酸肝素糖蛋白，當(dāng)TSR或A結(jié)構(gòu)域失活后，子孢子的入侵受阻，但不影響其滑行運(yùn)動。因此，trap可能是疫苗設(shè)計(jì)的靶基因。在瘧原蟲中可以作為候選診斷抗原。本研究中所克隆的基因和制備的多克隆抗體，為開展莫氏巴貝斯蟲的滑行運(yùn)動和細(xì)胞入侵方面的研究奠定了基礎(chǔ)，為巴貝斯蟲病血清學(xué)診斷技術(shù)的建立提供了候選抗原，同時也為預(yù)防和治療抗巴貝斯蟲病藥物的設(shè)計(jì)提供了候選靶位。

作者：王錦明楊吉飛李安巖單位:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院