細胞技術范文精選

一、資料與方法

1、挑選本院2010年6月至2012年12月送檢病理科支氣管鏡刷檢細胞學標本252例。所有的患者最后均確診為肺癌。男184例，女68例，年齡44～85歲，(平均66．3歲)。所有的患者行支氣管鏡刷檢，同時薄層液基細胞學涂片與傳統涂片。

2、儀器:美國SurPathTMPrepstain全自動液基薄層細胞制片染片機(BDTriPath，BurlingtonNC，USA)及相關耗材。采用奧林巴斯電子支氣管鏡(BF-260或1T260工作鏡)進行檢查。鏡下發現肺癌的直接征象或間接征象者，根據胸部CT提示的病變行透視下支氣管鏡肺活檢。所有患者均在活檢部位采用南京微創一次性保護型細胞刷刷檢，將毛刷頭直接在玻片上常規涂片1張。再將毛刷頭置于盛有10mlCyteRichRed固定液的50ml離心管中充分震蕩漂洗收集細胞。

3、制片方法

3.1傳統涂片方法:纖維支氣管鏡刷頭直接涂抹于載玻片上，涂片1張，干燥，95%乙醇固定10min，常規HE染色鏡檢。

3.2BDTriPath制片方法:標本加入專用50ml離心管中，使用程控離心機以Hettich3#程序600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，加入CyteRichRed固定液20ml，靜置30min，Hettich的3#程序以600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩均勻，加入10mlTris緩沖液，混均，移至12ml的離心管，Hettich的4#程序以600r/min離心5min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩(15±5)s。管架放在PrePStain系統上，靜置10min，等待上機自動制片染色。

1PD的環境及職業致病因素

1.1金屬元素

有研究發現，某些重金屬，比如錳的慢性中毒可損害中樞神經系統，特別是紋狀體和蒼白球等部位，產生類似PD的錐體外系神經功能障礙。Guilarte等及Huang的研究也發現錳中毒與PD有著密切的聯系。Park發現電焊工及其他長期暴露于錳的工人存在著出現神經癥狀和罹患PD的危險性。Moberly等的研究還表明，錳可以通過作用于嗅球和基底神經節的多巴胺能神經元來影響神經介質的釋放，從而導致PD等錐體外系疾病的發生。Coon等利用K-XRF技術測量了慢性暴露條件下鉛在人體內的沉積量，并表明長期的鉛暴露與PD發病風險成正相關。Komatsu等證實了錳、鐵、鉛、鎘、鋁等金屬在體內的沉積會導致氧化應激的增加，從而引起PD的發生。

1.2農藥百草枯

對多巴胺系統具有神經毒性作用，從而導致PD樣癥狀和改變。Betarbet等利用魚藤酮復制出了類似PD的大鼠模型，其癥狀包括出現震顫、步態不穩等。某些PD患者的腦組織中所含有機氯農藥，如林丹、狄氏劑的水平明顯高于對照組。代森錳（一種殺真菌劑）也被報道與PD的發生相關。還有研究發現，有機磷農藥同樣與PD的發病相關。

1.3環境毒素

一、材料與方法

1實驗對象及樣品制備本實驗對象為半年內未接受過輸血的健康中國人12名，抽取靜脈血5ml，使用ABO血型檢測試劑檢測其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均為陽性。樣品制備人員將A、B、O血型相同且測定的8種血型抗原至少有2種不相同的單一血樣制備成體外混合血樣。混合血樣依據紅細胞數按一定比例混合，混合比例分別為95％／5％、97％／3％、98．5％／1．5％、99．5％／0．5％，各比例混合血樣的例數分別為8例，8例，8例，10例。樣品制備人員將所有單一和混合血樣編號后發放給檢測人員進行檢測分析。

2儀器和試劑本實驗所用檢測儀器為美國BeckmanCoulter公司生產的FC500型號流式細胞儀。使用抗體為瑞士DiaMed公司生產的單克隆抗體產品，以及SEROTEC公司生產的FITC熒光標記的羊抗人免疫球蛋白。

3實驗方法用細胞穩定液將EDTA抗凝的新鮮血稀釋后，加入單克隆抗體，使之與相應的紅細胞表面抗原結合，并用熒光素標記的示蹤抗體標記紅細胞表面抗原抗體復合物。使用流式細胞儀對紅細胞表面特定血型抗原的表達情況進行數據采集和分析。通過對此方法檢測的特異性和靈敏度、信噪比和污染攜帶率、檢測樣品穩定性和操作穩定性等方面的檢測，驗證流式細胞儀檢測異體血液回輸方法的準確性和可操作性。

二、實驗結果

1抗原檢測特異性和靈敏度經檢測，這46例血樣的檢測判定結果為：12例單一血樣全部被檢出單峰并被準確判為陰性。8例95％／5％和8例97％／3％比例混合的血樣均被檢測出兩個以上雙峰，所有應為混合雙峰的樣品均被準確檢出；8例98．5％／1．5％比例混合的血樣在應出現雙峰的樣品圖中能被識別為雙峰，但個別抗體雙峰分離效果不佳，需進行抗體優化程序后方能被判定為雙峰；10例99．5％／0．5％比例混合的血樣中，只有4例樣品被判斷為含2個以上雙峰，其他混合樣品由于混合比例低于抗體檢測限而無法判定。

1資料與方法

1.1一般資料

患者的入選是根據美國胸科協會制定的診斷指南，存在大于3周以上的咳嗽癥狀，有至少一條哮喘癥狀，并且體格檢查出現相應體征的兒童患者隨機納入研究，研究時間從2012年1月～2014年6月。

1.2方法采用

流式細胞術。所收集樣本冷凍保存，統一檢測，末梢血樣采集于肝素鈉抗凝管中，取100μL血樣加入中含有20μL白介素-3的緩沖液中，室溫孵育10min，然后加入100μL兒童哮喘患者或健康對照組的血清，室溫孵育20min，其中緩沖液包含0.12MNaCI，0.005MKCI，0.025MTris，pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP0.4mmol/L）（Sigma-Aldrich公司，圣路易，MO，USA），一種非特異性細胞活化劑，被用于陽性對照，洗滌緩沖液（0.01M磷酸緩沖鹽水包括0.01M的磷酸二氫鈉，0.01M磷酸氫二鈉，pH為7.2～7.4）被用于陰性對照。孵育結束后將樣品置于冷卻的冰上防止嗜堿性粒細胞活化和降解，繼而與熒光FITC結合的抗CD63抗體孵育BectonDickinson，FranklinLakes，NJ，USA），與熒光PE結合的抗IgE抗體（Pharmacia，Uppsala，Sweden），以及PerCP結合的抗CD45抗體（BectonDickinson）避光孵育20min，加入紅細胞溶解液。2500rpm離心10min，將沉淀用緩沖液懸浮，BDFACSCantoⅡ流式細胞儀進行分析。在采集過程中，紅色熒光（FL2）和前向散射（FSC）和側向角散射（SSC）的特點是采用至少1000嗜堿性粒細胞的表達高IgE介導的面密度的選框進行分析，使用FSC/SSC特性淋巴細胞的定義。然后，從這些細胞，FL3/FL2圖上嗜堿性粒細胞的認定為CD45低/IgE的高表達。

1.3統計學方法

1iPSC技術

經典的iPSC技術路線主要包括以下步驟:①選擇宿主細胞;②選擇外源重組因子;③重組因子導入宿主細胞;④重編程產生iPSC;⑤iPSC的鑒定及分化。

1．1宿主細胞來源Yamanaka將小鼠體細胞誘導為iPSC開啟了該技術的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊，甚至一些瀕危動物的iPSC系紛紛建立。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細胞、角質成形細胞、羊水、神經前體細胞、外周血細胞，甚至尿液中獲得iPSC。不同組織來源細胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩定性和癌基因的表達方面也存在男女有別現象。使得iPSC技術應用于臨床個體治療更具挑戰性。

1．2重組因子的選擇及導入方式經典的Yamanaka因子在癌細胞中存在超表達、整合型載體可導致插入突變，且誘導效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡單、有效的誘導策略。Anokye-Danso等應用微RNA調控技術，不使用轉錄因子高效誘導iPSC。Zhou等和Kim等分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導受體細胞為iPSC，但效率較低。一些學者利用腺病毒、質粒載體瞬時轉染靶細胞，或利用Cre/LoxP系統、oriP/EBNAI系統及piggyBac轉座系統將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應用可顯著提高iPSC的產生效率。

1．3iPSC的誘導分化Zhao等利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導分化為神經細胞、造血細胞、胰腺細胞、肝細胞、血管內皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、耳蝸毛細胞、色素細胞等類型細胞。

1．4iPSC機制相關研究突破研究人員長期受困于體細胞重編程的具體機制。Polo等繪制出體細胞重編程為iPSC的分子線路圖，證實誘導過程引起了兩次轉錄波，分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅動，并確定了重編程過程中路障基因。基于iPSC技術已證明細胞的分化過程并非不可逆轉，研究人員利用細胞直接重編程技術將已分化細胞直接轉化成特定譜系的細胞，利用間接譜系轉化技術部分去分化生成多潛能祖細胞，為干細胞研究開辟了新思路。