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本文作者:李莉莉王復興王義鵬秦松作者單位:中國科學院煙臺海岸帶研究所
菊芋是一種多年生草本植物,俗稱洋姜、鬼子姜。菊芋抗鹽、旱、寒等能力使它具有較強的生態適應能力,可以在荒山野嶺、鹽堿灘涂等非耕地種植的特性使其成為一種極具開發潛力的半野生資源。菊芋生物量極大,地下塊莖每公頃高達90t[1]。同時塊莖干物質中70%以上都是菊粉,該多聚果糖可以在酶的作用下分解而產生大量的果糖和少量的葡萄糖,為生物基化學品的生產提供了良好的碳源。此外,菊芋塊莖除含菊粉外,還含有一定數量的蛋白質、脂肪、纖維素、果膠及微量元素等營養成分[2],這些物質的存在不但使菊芋塊莖具有較高的營養價值,也為其在工業應用中提供了養分。相比于咸菜腌制及動物飼料等低附加值的應用,作為能源作物的菊芋,能夠被微生物發酵得到高附加值的生物基化學品如燃料乙醇、丁酸等的各類生物基化學品[3-6]。而菊芋發酵過程中總糖含量的測定對發酵過程的評價具有重要的意義。建立菊芋發酵過程中總糖的測定方法是監控菊芋發酵過程的必要步驟之一,同時發酵過程中的主要代謝物可能對糖類的測定有一定的影響。本實驗首先建立了一種穩定的總糖測定方法,其次考察了乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇等代謝物對總糖測定的影響。
1材料與方法
1.1材料與儀器
硫酸、蒽酮、硫脲、乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇、葡萄糖:AR級;菊粉wedin-P97:菊粉含量≥97,青海威德生物技術有限公司。TU-1901雙光束紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限公司;CP214電子天平:奧豪斯儀器有限公司。
1.2實驗方法
1.2.1溶液的配制
配制0.1g/L的葡萄糖標準液和0.1g/L的菊粉標準液。
1.2.2糖-蒽酮反應及吸光度的測定
將待測樣品放于具塞試管后,將具塞管置于冰浴中,加入蒽酮溶液4mL,混勻,沸水浴加熱反應(反應時間為后面結果得到的最佳反應時間12min),流水冷卻,室溫放置10min,用紫外分光光度計于最大吸收波長處(620nm)測定吸光度。每個樣品均為3個平行樣,吸光度為3個樣品的平均值。
1.2.3最大吸收波長的選擇
取1mL葡萄糖標準液于具塞管中。蒽酮反應后用紫外分光光度計于450~800nm進行吸光度的掃描。
1.2.4總糖-蒽酮反應時間的確定
取1mL葡萄糖標準液于具塞管中。其中沸水浴的反應時間選擇為3、5、7、8、10、12、14min。
1.2.5葡萄糖標準曲線的繪制
取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖標準液于具塞管中,分別用移液器補水至1mL。
1.2.6穩定性試驗
取0.5mL葡萄糖標準液于具塞管中,用移液器補水至1mL。與蒽酮反應完畢,流水冷卻放置0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h時分別測定吸光度。
1.2.7回收率實驗
取0.25mL葡萄糖標準液和0.25mL菊粉標準液于具塞管中,分別用移液器補水至1mL;對照樣加蒸餾水1mL。1.2.8乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇對總糖測定的影響配置含乙醇(或丁酸、乳酸、1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的0.05g/L的菊粉溶液,取1mL放于具塞試管中。每個樣品重復3管。配制含乳酸(或1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的溶液,取1mL放于具塞試管中。每個樣品重復3管。
2結果與討論
2.1最大吸收波長的選擇
用分光光度計在450~800nm波長下對菊粉溶液進行掃描,由圖1可知,菊粉最大吸收波長為620nm。本最大吸收波長與以前報道的波長是一致的[7],說明本物質的最大吸收波長是非常穩定的,總糖測定波長選擇620nm。
2.2糖與蒽酮反應時間的確定
對糖-蒽酮的反應時間進行考察發現,反應時間3、5、7、8、10、12min時吸光度逐漸增加(圖2),而反應12min時吸光度開始降低,故選擇12min作為兩者的最佳反應時間。反應容器及反應體積的差異會導致最佳反應時間的差異,總糖測定之前需要依照本身的實驗容器和體系確定最佳反應時間。
2.3葡萄糖標準曲線的繪制
葡萄糖標準曲線的回歸方程為:A=0.0278x-0.0047(其中x為葡萄糖濃度μg/mL),回歸系數:R2=0.9998,在0~20μg/mL范圍內線性關系良好,可用于糖含量的測定。
2.4穩定性實驗
分別在0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h于621nm處測樣品的吸光度。結果顯示RSD為1.80%,表明在3.75h內吸光度無明顯變化,顯色穩定。
2.5回收率實驗
在已知含量的菊粉樣品中分別加入一定量的葡萄糖標準品,測定吸光度,計算回收率,其平均值為100.2%,RSD=4.25%。
2.6乙醇、丁酸對糖類測定的影響
由表1可知,含乙醇2%~10%的菊粉溶液與不含乙醇的菊粉對照樣相比吸光度變化不大,同時表2的t檢驗結果顯示P值均大于0.05,含乙醇的菊粉液與無乙醇的對照樣相比吸光度無顯著性差異,結果表明菊粉溶液中乙醇含量小于10%時對總糖含量的測定無影響。丁酸的結果與乙醇的類似,吸光度(表1)與t檢驗(表2)的結果顯示,菊粉溶液中丁酸含量小于10%時對總糖含量的測定無影響。
2.7乳酸、1,4-丁二醇對糖類測定的影響
由表3可知,含乳酸2%~10%的菊粉溶液與不含乳酸的菊粉對照樣相比吸光度差異很大,同時表4的t檢驗結果顯示P值均小于0.01,即含乳酸的菊粉溶液與無乳酸的對照樣相比吸光度差異極顯著,結果表明乳酸對菊粉溶液總糖含量的影響很大。1,4-丁二醇的結果與乳酸的類似,吸光度(表3)與t檢驗(表4)的結果顯示,1,4-丁二醇對菊粉溶液總糖含量的影響很大。為了進一步考察乳酸和1,4-丁二醇對總糖測定影響的規律,對無菊粉添加的不同濃度的乳酸和1,4-丁二醇溶液經過硫酸-蒽酮反應對其吸光度進行測定,結果見表5。無菊粉的乳酸蒽酮反應的吸光度結果顯示(表5),含乳酸的菊粉溶液的吸光度≈菊粉蒽酮反應后的吸光度+乳酸蒽酮反應后的吸光度;以含2%的乳酸菊粉溶液為例,無乳酸的菊粉蒽酮反應后的吸光度為0.332(表3),2%乳酸蒽酮反應后的吸光度為0.555(表3),兩者之和為0.886,而含2%乳酸的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度為0.868(表5)。對含2%、6%、10%乳酸的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度和菊粉蒽酮反應后的吸光度與乳酸蒽酮反應后的吸光度之和的t檢驗分析顯示,P值為0.937>0.05,故兩者無顯著性差異,所以我們認為含乳酸的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度=菊粉蒽酮反應后的吸光度+乳酸蒽酮反應后的吸光度。上述乳酸影響總糖測定的規律同樣適用于1,4-丁二醇,以含2%的1,4-丁二醇菊粉溶液為例,無1,4-丁二醇的菊粉蒽酮反應后的吸光度為0.327(表3),2%1,4-丁二醇蒽酮反應后的吸光度為0.018(表3),兩者之和為0.345,而含2%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度為0.338(表5)。對含2%、6%、10%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度和菊粉蒽酮反應后的吸光度與1,4-丁二醇蒽酮反應后的吸光度之和的t檢驗分析顯示,P值為0.131>0.05,故兩者無顯著性差異。所以我們認為含1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度=菊粉蒽酮反應后的吸光度+1,4-丁二醇蒽酮反應后的吸光度。為何乙醇和丁酸對總糖測定無影響,而乳酸和1,4-丁二醇對總糖測定的影響非常大呢?推測應該是后兩者在濃硫酸的作用下,可經脫水反應進一步與蒽酮反應產生藍綠色的衍生物而貢獻了部分吸光度。此外,實驗中只是列舉了菊芋代謝產生的幾種典型代謝物對總糖測定的影響,菊芋還能發酵產生2,3-丁二醇[8]、丁二酸[9]、油脂類[10]等一些生物基化學品,在進行總糖測定時首先應先排除自身的代謝物對測定的干擾。
3結論
采用蒽酮-硫酸法對總糖進行測定,測得最大吸收波長為620nm。糖-蒽酮的最佳反應比例為1:4,最佳反應時間為12min。葡萄糖在0~20μg/mL范圍內線性關系良好。結果表明,建立的總糖測定方法具有良好的穩定性和回收率,適合對菊芋總糖進行監測。此外,乙醇和丁酸(小于10%,v/v)對總糖的測定無影響,但乳酸和1,4-丁二醇(小于10%,v/v)對總糖測定結果影響很大,且規律為含一定濃度乳酸或1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度為菊粉溶液蒽酮反應后的吸光度與等濃度乳酸或1,4-丁二醇溶液蒽酮反應后的吸光度之和。建立菊芋發酵過程中總糖的測定方法對于監控菊芋發酵過程、測定代謝速率是必要的,同時發酵過程中的主要代謝物可能對糖類的測定有一定的影響,所以測定總糖之前應先排除其他物質對于總糖測定的影響,以保證總糖測定準確性。