以粗甘油發酵制備EPA研究

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本文作者：孔秀梅吳蕾作者單位：天津市食品生物技術重點實驗室

由于人體不能自行合成EPA，只能從食物中攝取。魚油特別是深海魚油是EPA的主要來源，但從魚油中提取的EPA膽固醇含量高，帶有腥味，極大地影響了產品的品質。并且魚油中EPA的構成和含量隨著魚的種類、季節、地理位置等不同而變化，以魚油為原料具有不穩定的弊端[1]。因此，EPA的生產逐漸向利用微生物發酵合成方向發展。研究表明，利用真菌合成的EPA含量高，脂肪酸組成簡單，純化容易，并且沒有魚的腥味，合成周期短，有利于進行大規模生產，滿足人類日益增長的需求。另外，利用生物柴油副產物粗甘油發酵生產EPA[2]，可以解決其生產過剩問題[3-5]，合理利用資源，降低生物柴油的生產成本，提高其在行業的競爭力，為生物柴油行業的可持續發展提供了保障[6]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

畸雌腐霉(Pythiumirregulare)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；生物柴油副產物粗甘油(自制)葡萄糖、酵母膏；瓊脂；甲醇；濃硫酸；氯仿；十七烷酸(C17:0)(內標物)等。HIRAYAMA高溫蒸汽滅菌鍋、哈雅瑪高壓滅菌鍋；振蕩培養箱：上海博迅實業有限公司；Scientz-50n冷凍干燥；SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；高速冷凍離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；磁力加熱攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；GC-9A氣相色譜儀：日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1粗甘油制備

(1)稱取催化劑0.64gNaOH，將其緩慢溶解到90mL無水甲醇中，由于甲醇有毒，所以在通風櫥內攪拌均勻，形成醇鉀或醇鈉溶液，將醇鉀或醇鈉活性溶液倒入到500mL三口燒瓶中。(2)稱取200g大豆油，倒入到500mL三口燒瓶中，控制在80℃，反應時間2h，反應過程中采用電機攪拌，并通冷凝水[7]。(3)反應完成后冷卻靜置分層，上層淺黃色半透明狀液體為粗生物柴油，下層棕色液體即為生物柴油副產物粗甘油。(4)將粗甘油與蒸餾水按1:4的比例混勻，以降低粗甘油的黏性；用鹽酸調pH至3，使甘油中的皂化物轉變為游離脂肪酸；靜置分層將游離脂肪酸從粗甘油溶液中分離出來。甲醇是低沸點物質，培養基在121℃、15min的滅菌條件下能將甲醇從中去除，因此不需要采用額外處理方法對甲醇進行去除。

1.2.2發酵生產epa

1.2.2.1接種液制備

瓊脂板的制備：在水中加入20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏并充分溶解，再加入1.5%(w/w)瓊脂，調pH至6。將菌種涂布在瓊脂板上，在25℃下培養5d，用蒸餾水清洗瓊脂板，可用玻璃珠使孢子脫落，孢子的懸浮液即接種液[8]。

1.2.2.2培養基制備

(1)固體培養基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母膏、15g/L瓊脂糖，調pH至5.8~5.9，121℃下高溫滅菌15min。(2)液體培養基：30~70g/L粗甘油，10g/L酵母膏，調pH至6.0~6.5，121℃下高溫滅菌15min。

1.2.2.3菌種活化及搖瓶培養

(1)菌種活化：將菌種接種到滅菌后的裝有100mL固體培養基的250mL錐形瓶中，25℃培養5d，待有菌絲長出后加入50mL無菌去離子水和若干滅菌玻璃珠，震蕩搖勻，目的是為了將菌團中形成的孢子分散均勻利于下一步均勻接種。(2)發酵培養：50mL液體培養基裝入到250mL錐形瓶中，接種量為1mL，于25℃下170r/min振蕩培養[8]。

1.2.3分析方法

1.2.3.1生物量測定

冷凍干燥法測菌體干重，具體操作是將不同發酵時間的發酵液將菌體轉移到預先稱量的冷凍干燥管中，進行冷凍干燥。

1.3.3.2EPA含量測定

(1)脂肪酸甲酯化：稱取20mg冷凍干燥菌體于具蓋玻璃試管中，加入4mL甲醇、濃硫酸、氯仿(體積比：1.7:0.3:2.0)混合溶液，并加入1mg內標物，擰緊試管蓋，90℃條件下水浴40min，放置冷卻后加入1mL蒸餾水，搖晃30s，兩相生成，下相即為脂肪酸甲酯，將其加入離心管中，加入適量無水Na2SO4，1000r/min離心8min，用移液管將液體取出置于試管中用于氣相色譜分析。(2)氣相色譜分析①氣相色譜條件：色譜柱采用程序升溫：100℃升至220℃，每秒升10℃，220℃時保留5min。②EPA的定性分析：以十七烷酸(C17:0)為內標[10]，在同一色譜條件下，以標準品色譜峰的保留時間與樣品色譜峰的保留時間對照進行分析。③EPA的產量分析EPAyield(mg/L)=ms/(Vs×1000)(1)式中：ms為樣品中EPA甲酯質量，g；Vs為取樣體積，L。

2結果與討論

2.1發酵時間對菌體生長的影響

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，在25℃，pH6.0條件下測定培養基中細胞干重，得到菌體生長曲線如圖1所示。Vs為取樣體積，L。

2結果與討論

2.1發酵時間對菌體生長的影響

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，在25℃，pH6.0條件下測定培養基中細胞干重，得到菌體生長曲線如圖1所示。實驗結果表明，菌體生長至80h時細胞干重達到最大值，之后細胞干重下降。因為脂質積累時間通常是在菌體生長達到最大值之后，因此在實驗中取培養5d后菌體進行測定。

2.2EPA氣相色譜定量分析結果

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，25℃，pH6.0條件下培養5d所得菌種按1.3.3所述實驗方法處理后，氣相色譜分析結果顯示，出峰時間10.0、15.5、16.5min分別為十七烷酸甲酯(內標)、二十碳四烯酸甲酯(ARA甲酯)、二十碳五烯酸甲酯(EPA甲酯)，3種脂肪酸甲酯分離良好，并且其余組分不干擾測定，根據內標物與EPA甲酯峰面積即可計算得到EPA產量。

2.3不同溫度對菌體生長及脂質積累的影響

在pH6.0，轉速170r/min，粗甘油加入濃度70g/L的條件下，對溫度在15~35℃范圍內菌體生長情況及EPA產量進行比較，發酵5d后，結果如表1所示。15、20℃菌體均形成光滑緊密的球團，且EPA含量較低，而25℃時，菌體分散成小米粥狀，且菌球直徑較小，細胞干重最大，EPA產量最高[11]；培養溫度在30、35℃時，菌體也分散生長，但細胞干重減小，EPA產量也較低。實驗表明，低溫不利于菌絲分散生長，溫度過高也不利于EPA的積累，因此，25℃是畸雌腐結果表明，在pH5.4~6.4條件下菌體生長情況及EPA產量變化不大，菌體均能較好生長，EPA積累也相差不大，但由圖可得較低pH值有利于菌絲中EPA積累。

2.5不同轉速對菌體生長及脂質積累的影響

在25℃，pH6.0條件下，對轉速在160~180r/霉培養的最適溫度，此溫度下有利于菌體生長和EPA積累。

2.4不同pH對菌體生長及脂質積累的影響

在25℃，轉速170r/min條件下，對pH在5～7范圍內菌體生長情況及EPA產量進行比較，發酵5d后，結果如表2所示。min范圍內菌體生長情況及EPA產量進行比較，發酵5d后，結果如表3所示。實驗表明，轉速對于菌體生長和EPA積累影響較大。轉速越高，菌體生長和EPA的累積越多。但是轉速上升到180r/min后，菌體和EPA的量變化不大。因為該菌體形狀為團塊狀，不利于發酵過程中的營養物質以及氧的傳遞，只靠提高轉速不能很好解決傳質問題。需要進一步改進發酵過程的混合方式。

2.6初始粗甘油濃度對菌體生長及脂質積累的影響

在25℃，pH6.0，轉速170r/min條件下，對粗甘油加入濃度在20~90g/L范圍內菌體生長情況及EPA產量進行比較，發酵5d后，結果如表4所示實驗表明，碳源濃度對于菌體生長和EPA積累影響較大，在低濃度時，由于不能滿足菌體生長所需碳源量，菌體不均勻分散，且細胞干重和EPA產量均較低。70g/L的粗甘油濃度最適宜菌體生長和EPA積累。

2.7以葡萄糖和廢甘油為碳源條件下的菌體生長及脂質積累情況根據文獻記載，葡萄糖為發酵生產EPA的較佳碳源。在25℃，pH6.0條件下，分別以70g/L濃度的葡萄糖和粗甘油為碳源，發酵5d后，結果如表5所示。實驗表明，使用粗甘油為碳源可達到與葡萄糖為碳源發酵生產相似的生物量和EPA產量。因此可以用粗甘油代替葡萄糖作為發酵畸雌腐霉生產EPA的碳源。

3結論

論文在確定了EPA提取、檢測方法后對畸雌腐霉搖瓶發酵生產EPA的過程進行了考察，確定了發酵生產EPA的較優條件。結論如下。(1)利用粗甘油為碳源可以得到與葡萄糖為碳源發酵畸雌腐霉生產EPA獲得相似的產量，可以用粗甘油代替葡萄糖作為發酵畸雌腐霉生產EPA的碳源。

(2)菌體生長情況與EPA產量的關系：由實驗結果知，畸雌腐霉屬于凝集型菌。發酵過程中能形成菌球體，而菌體是否成球除了與是否為凝聚型菌有關外，還受培養條件：起始pH值，溫度等培養條件的影響。實驗中發現，培養時通氣量也能影響菌球體形成，較低轉速時形成較大菌球體，但受時間限制，沒有能最終確認最佳轉速。在利用粗甘油為碳源發酵畸雌腐霉生產EPA中，甘油濃度較低時菌體不能均勻分散；微酸性條件(pH5~6)菌絲能均勻分散，EPA含量較高，說明酸性環境有利于EPA的積累；溫度較低時菌體形成球團，較高溫度時能均勻分散。

(3)培養條件對畸雌腐霉生產EPA的影響：通過實驗研究了以粗甘油為碳源的培養基和發酵操作條件對畸雌腐霉發酵生產EPA的影響規律。采用單因素實驗的方式考察了粗甘油濃度、pH值、溫度等因素對畸雌腐霉生長和EPA產量的影響。結果發現：最適的初始粗甘油濃度為70g/L，較好的通氧條件有利于菌體生長；發酵液初始pH為6.0；畸雌腐霉的最適生長溫度是25℃。

(4)實驗表明，粗甘油作為生物柴油工業生產過剩的副產物，可以利用于發酵畸雌腐霉生產EPA，不僅可以滿足人們對于EPA日益增長的需要，還能解決合理利用廢甘油，降低生物柴油產業生產成本，并保護環境。