電化學(xué)DNA傳感器的運(yùn)用

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1電化學(xué)dna傳感器的工作原理

電化學(xué)DNA傳感器主要由表面固定了ssD-NA(單鏈DNA)[4]探針的電極金電極、玻璃電極和碳糊電極等)和檢測(cè)用的電化學(xué)雜交指示劑(即標(biāo)識(shí)物)兩部分構(gòu)成(如圖1所示)。為了提高雜交的專一性,ssDN段長(zhǎng)度范圍一般從十幾個(gè)堿基到幾十個(gè)堿基,通常采用人工合成的短鏈寡聚脫氧核苷酸,其堿基序列與樣品中的靶序列互補(bǔ)。在適當(dāng)?shù)臏囟取H和離子強(qiáng)度條件下,固定在電極上的ssDNA與雜交緩沖溶液中的靶基因發(fā)生選擇性雜交反應(yīng)。如果樣品中含有完全互補(bǔ)的DN段則在電極表面形成dsDNA(雙鏈DNA),從而引起電極上電流值的變化,利用微分脈沖或循環(huán)伏安法可檢測(cè)出dsDNA雜交信號(hào)。電化學(xué)雜交指示劑是一類能與ssDNA和dsDNA以不同方式相互作用的電活性化合物,其電活性可使檢測(cè)時(shí)的測(cè)量電流增大,提高檢測(cè)靈敏度,但電化學(xué)雜交指示劑的加入使電化學(xué)信號(hào)的本底加大,使檢測(cè)的分辨率降低。提高電極上ssDNA探針的靈敏度,一方面與雜交指示劑對(duì)dsDNA和ssDNA的選擇性結(jié)合能力的差異有關(guān),另一方面與電極表面特異性吸附有關(guān)[5]。目前選用的嵌合劑均為單嵌合劑,可以考慮選用雙嵌合劑和三嵌合劑。利用其“分子剪刀”的功能,改善其靈敏度和選擇性。選用磷酸緩沖底液進(jìn)行檢測(cè),可避免對(duì)指示劑的非特性吸附[6]。在基因檢測(cè)方面采用計(jì)時(shí)電勢(shì)信號(hào)轉(zhuǎn)換模式(PSA)檢測(cè),比伏安法靈敏度高,并能獲得有效的背景補(bǔ)償,可在5~20min短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)納克(ng)的目標(biāo)DNA序列[7]。采用光刻沉積技術(shù)制備的金膜作為傳感電極[8],與巰基修飾的寡核苷酸探針自組裝成的電化學(xué)核酸傳感器,濃度檢測(cè)線性范圍為1.5~50nmol/L。以肽核酸[9](PNA)代替ssDNA作為探針分子修飾到電極表面,電極表面上的PNA仍能保持其在溶液中專一和有效的雜交特性,PNA識(shí)別層使傳感器具有更高的靈敏度和專一性,雜交速度快,并且不受離子強(qiáng)度的影響。

2電化學(xué)DNA傳感器的分類

DNA修飾電極是電化學(xué)DNA傳感器的重要部分,該類傳感器也多以此進(jìn)行分類。ssDNA修飾(或固定)到電極上的方法,現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在自組裝膜法、吸附結(jié)合法、表面富集法、共價(jià)鍵結(jié)合法、化學(xué)免疫法、組合法、生物素-親和素反應(yīng)法和LB膜法等。本文主要敘述以下幾種:

2.1吸附結(jié)合法

該方法是將碳糊電極放到含DNA探針分子的乙酸緩沖溶液中在一定電位下活化電極,然后在控制電位下吸附富集探針分子,最后用磷酸緩沖溶液淋洗后便可使用。其特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、靈活,但穩(wěn)定性不夠。Pang[3,10]等研究證明,ssDNA在汞電極上的吸附性質(zhì)為化學(xué)吸附,生成吸附化學(xué)鍵,質(zhì)子化的ssDNA分子通過嘌呤和嘧啶堿基上芳香雜環(huán)的π鍵鍵合而吸附到汞電極上。Hashimoto[11,12]等采用吸附法在平面熱解石墨電極上固定了DN段。他們[12]還通過化學(xué)吸附在金電極表面修飾了20mer的DNA探針,該探針與v-myc基因部分互補(bǔ)。Wang等[13]利用電化學(xué)富集方法將DNA修飾到碳糊電極(CPE)上,制成DNA探針修飾電極。

2.2自組裝膜法

即基于分子的自組作用,在固體表面自然形成高度有序的單分子層膜的方法。在DNA技術(shù)中,一般是利用帶巰基(—SH)的化合物在金電極表面上可以形成自組裝單分子膜的特性來固定核酸。其特點(diǎn)是表面結(jié)構(gòu)高度有序,穩(wěn)定性好,有利于雜交;但對(duì)巰基化合物修飾的DNA的純度要求較高,分離提純操作較煩瑣。白燕[14]等人利用自組裝單分子膜技術(shù),考察了ssDNA/Au電極、dsDNA/Au電極的指示劑氧化峰電流。研究表明,ssDNA/Au電極、dsDNA/Au電極的指示劑氧化峰電流響應(yīng)值之差與互補(bǔ)DNA濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,據(jù)此可以識(shí)別特定序列的DNA,并對(duì)其進(jìn)行定量。陸琪[15]等人采用先進(jìn)行—SH化合物自組裝,得到自組裝單分子層,再在其上共價(jià)鍵合或吸附固定DNA的方法,制備DNA修飾電極,克服了由于—SH修飾的DNA難以合成,并且需要分離提純,操作繁瑣的缺點(diǎn)。Xu[16]等先將4_巰基丁基膦酸(MBPA)在純乙醇中固定到硅晶片的金膜上,然后再與Al3+反應(yīng),形成一層包含Al3+的膜,再通過Al3+與DNA之間的靜電作用將ssDNA固定到電極上。

2.3共價(jià)鍵結(jié)合法

該法首先對(duì)電極進(jìn)行活化預(yù)處理,以引入活性鍵合基團(tuán),然后進(jìn)行表面的有機(jī)合成,通過共價(jià)鍵合反應(yīng)把探針分子修飾到電極表面。如在氧化的玻碳電極表面,以一種水溶液的乙基_(3_二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸和N_羥基磺基琥珀酰亞胺作為偶聯(lián)活化劑,小牛胸腺DNA和多聚脫氧鳥苷酸、多聚脫氧胞苷酸片段通過與活化的電極表面(O_酰基異脲)形成磷酰胺鍵共價(jià)結(jié)合到電極表面。其特點(diǎn)是修飾層穩(wěn)定,易進(jìn)行分子雜交,但由于電極表面活性位點(diǎn)有限,表面合成又是異相反應(yīng),因而固定的DNA量有限,響應(yīng)信號(hào)小。S.Lin[17~19]采用共價(jià)鍵法,成功地在石墨電極上固定了DNA探針。趙元弟等[20]采用巰基化合物自組裝/共價(jià)鍵合反應(yīng)的逐層固定方法,將雙鏈DNA固定到金電極表面,得到DNA修飾電極,并對(duì)該電極表面進(jìn)行了電化學(xué)和X射線光電子能譜表征,研究了電極表面固定化小牛胸腺DNA和一種具有10堿基長(zhǎng)度的寡聚核苷酸探針分別與溶液中DNA的表面分子雜交情況。

2.4化學(xué)免疫法

在免疫傳感器的研究及應(yīng)用方面,本課題組研究了多種Nafion膜修飾微鉑電極對(duì)溶液中NO的電化學(xué)行為進(jìn)行了研究[21~24],并用自行設(shè)計(jì)合成的大環(huán)鎳制成了Nafion膜修飾電極,實(shí)現(xiàn)了對(duì)多巴胺和腎上腺素這兩種哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)測(cè)定[25];用PVC膜修飾的免疫電極采用流動(dòng)注射分析了乙肝抗原[26];通過戊二醛偶聯(lián)乙肝表面抗體(抗-HBs),用自組裝的硫脲單分子層金免疫電極,檢測(cè)了乙肝表面抗原[27]。采用了溶膠-凝膠(sol-gel)技術(shù),成功將乙肝表面抗體(HBsAb)包埋于sol-gel中,此方法可用于檢測(cè)乙肝表面抗原HBsAg[28]。同時(shí)結(jié)合溶膠-凝膠(sol-gel)和交聯(lián)技術(shù),將乳腺癌抗體固定在鉑盤電極表面的氨基化sol-gel功能膜上,用于檢測(cè)乳腺癌抗原(CA15-3)的免疫傳感器[29]等。利用化學(xué)免疫法固定DNA首先在電極表面鍵合抗生蛋白(avidin),然后利用抗生蛋白與生物素之間的親和作用,使其與5′端標(biāo)記有生物素(biotin)的DNA結(jié)合,因而將DNA固定于電極表面。Yoshio[30]利用avidin與biotin的基本反應(yīng)通過多層分子組裝將dsDN段固定化,用以測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量小的有機(jī)物質(zhì)和氯代聯(lián)苯、氯代酚、雙酚A、溴化乙啶等。

2.5組合法

該法是將化學(xué)修飾劑與電極材料混合以制備組合修飾電極。Millan[31]將18_烷基胺或18_烷基酸混入碳糊中,得到修飾的碳糊電極。在DEC存在下,18_烷基胺的氨基與ssDNA5′末端的磷酸基形成磷酰氨鍵,并將其固定在電極上。

3電化學(xué)DNA傳感器中的標(biāo)示物

DNA傳感器對(duì)目標(biāo)基因的選擇性識(shí)別是靠核酸的雜交來完成的。為了檢測(cè)所發(fā)生的雜交信息,必須采用一種電活性物質(zhì)來指示,即電化學(xué)DNA傳感器的標(biāo)示物。本文主要介紹以下3種標(biāo)示物。

3.1具有電化學(xué)活性的雜交指示劑作為標(biāo)示物

許多具有電化學(xué)活性的小分子物質(zhì)能與DNA分子發(fā)生可逆性相互作用,其中一些物質(zhì)能夠?qū)Ｒ恍缘厍度雂sDNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)之間,這一類物質(zhì)稱為雜交指示劑。在雜交過程中雜交指示劑與電極表面的dsDNA形成復(fù)合物,根據(jù)雜交指示劑與ssDNA和dsDNA結(jié)合方式和結(jié)合能力的差異,通過測(cè)定其氧化還原峰電流和峰電位可以識(shí)別和測(cè)定DNA分子。能夠選擇性識(shí)別ssDNA和dsDNA而又不與DNA鏈發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合,同時(shí)又能給出電流或電勢(shì)識(shí)別信號(hào)的雜交指示劑是該類電化學(xué)DNA生物傳感器的關(guān)鍵。指示劑與DNA的結(jié)合方式主要有:(1)與DNA分子的帶負(fù)電荷的核糖/磷酸骨架之間的靜電作用;(2)與DNA溝槽的嵌入作用。雜交指示劑對(duì)dsDNA比對(duì)ssDNA有更高的特異性結(jié)合能力,這樣才能指示靈敏。一般地說,dsDNA與指示劑的相互作用為靜電作用和內(nèi)部疏水性作用,而ssDNA主要是靜電作用,可以從其電化學(xué)峰電位的移動(dòng)來判斷,前者峰電位正移,后者峰電位負(fù)移[32]。Wang[33,34]等用肌苷代替DNA探針中的鳥嘌呤來消除探針中鳥嘌呤的氧化峰,然后利用探針和靶序列,對(duì)雜交后出現(xiàn)的鳥嘌呤的氧化峰進(jìn)行檢測(cè)。Hashimoto[35]等利用多種雜交指示劑進(jìn)行電化學(xué)基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)電活性小分子道諾霉素(daunomycine)可以通過峰電位的移動(dòng),很好地區(qū)分dsDNA和ssDNA,并且其電流密度相當(dāng)高,在10μmol/L的溶液中達(dá)到6.5μA/c,可檢測(cè)到10-8g/mL的靶基因序列。Hoechst33258能專一性地作用于雙螺旋DNA的小溝槽的A-T堿基對(duì),可以通過其陽極峰電流的變化來指示。而其它的指示劑,如丫啶黃(acridineorange)、米諾霉素(minocycline)、普匹碘銨(propidiumiodide)等,效果就不如前二者。

3.2寡聚核苷酸上修飾電化學(xué)活性的官能團(tuán)作為標(biāo)示物[2,3]

合成帶有電化學(xué)活性基團(tuán)的寡聚核苷酸與電極表面的靶基因選擇性地進(jìn)行雜交反應(yīng),在電極表面形成帶有電活性官能團(tuán)的雜交分子,通過測(cè)定其電信號(hào)可以識(shí)別和測(cè)定DNA分子。Takenka等人[2]成功地在寡聚核苷酸的5′端磷酸基上標(biāo)記具有電化學(xué)活性的羧基二茂鐵制成二茂鐵寡聚核苷酸,合成的二茂鐵寡聚核苷酸選擇性地與互補(bǔ)單鏈DNA形成復(fù)合物,采用電流檢測(cè),檢測(cè)信號(hào)與復(fù)合物的量呈線性關(guān)系。

3.3利用酶的化學(xué)放大功能在DNA分子上標(biāo)記酶作為標(biāo)示物[2,3]

當(dāng)標(biāo)記了酶的ssDNA與電極表面的互補(bǔ)ssDNA發(fā)生雜交反應(yīng)后,相當(dāng)于在電極表面修飾了一層酶,酶具有很強(qiáng)的催化功能,通過測(cè)定反應(yīng)生成物的變化量可以間接測(cè)定DNA。

4電化學(xué)DNA傳感器的醫(yī)學(xué)應(yīng)用

4.1在細(xì)茵及病毒感染類疾病診斷

細(xì)菌及病毒感染是引起人類疾病的主要原因之一。歷史上許多災(zāi)難性的瘟疫,如霍亂、天花、麻疹等,都是由相應(yīng)的病菌或病毒所引起的,因此盡早診斷出病源微生物(細(xì)菌或病毒)的感染,是預(yù)防這類疾病的關(guān)鍵[1,36]。Wang[37]等人用陽極氧化法,將與結(jié)核桿菌(Mycobateriatuberculosis)基因DR區(qū)相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)長(zhǎng)度分別為27和36堿基的DNA探針,固定在碳糊電極表面,制成電化學(xué)DNA傳感器。利用計(jì)時(shí)電位分析法,以Co(Phen)33+作指示劑,進(jìn)行了DNA傳感器用于結(jié)核桿菌診斷的最初嘗試。武漢病毒研究所用化學(xué)免疫法固定乙型肝炎病毒(HBV)的DNA探針,用來與牛腸磷酸酶(CAP)標(biāo)記的互補(bǔ)探針雜交,利用光動(dòng)力計(jì)測(cè)量雜交帶入的CAP釋放出的光強(qiáng)度,驗(yàn)證了DNA傳感器進(jìn)行HBV診斷的可行性[38]。日本的Hashimoto等人[39]將巰基標(biāo)記的HBV探針自組裝在金和鈦電極表面,用電化學(xué)方法檢測(cè)了血清HBVDNA的競(jìng)爭(zhēng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果表明用DNA傳感器HBV的臨床診斷,不受血清中其它DNA成分的干擾,具有良好的特異性。近來,吳少慧等人[40]通過陽極氧化法,將HBV的DNA探針固定在鍍金的石英晶體表面,組裝成石英晶體傳感器[41~44]。用該石英晶體傳感器去檢測(cè)HBV的DNA時(shí),作為檢測(cè)對(duì)象的DNA會(huì)與固定在石英晶體表面的DNA探針雜交,引起石英晶體的質(zhì)量改變,從而使石英晶體的振蕩頻率改變,產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。用該傳感器檢測(cè)了6個(gè)HBV血清,證明其穩(wěn)定性能滿足臨床HBV的診斷要求。

4.2基因診斷

基因遺傳病是當(dāng)前威脅人類健康的天敵,許多基因遺傳病至今還沒有根治的方法,因此,基因診斷變得越來越重要,尤其對(duì)遺傳性疾病的產(chǎn)前和病前診斷顯得更為重要,而在基因與功能的研究以及其他許多方面,DNA序列分析均是必須完成的關(guān)鍵步驟,利用電化學(xué)DNA傳感器測(cè)定DNA序列效果較好。Millan等[31]在ssDNA修飾了碳糊電極,在較高離子強(qiáng)度下與靶基因快速雜交(<10min),用該傳感器測(cè)定了18個(gè)堿基長(zhǎng)度的囊性纖維變性基因ΔF508序列,得到了令人滿意的結(jié)果。Wang等[7]報(bào)道了艾滋病人類免疫缺陷病毒型(HIV-Ⅰ)相關(guān)的短DNA序列測(cè)定的傳感器。他們將21和24個(gè)堿基與HIV-IU5LTR序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸部分修飾在碳糊電極(CPE)上,以雜交指示劑Co(Phen)33+溶出峰來檢測(cè)雜交。靶基因片段檢出限為4×l0-9mol/L。Wang等[33]提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作為探針修飾到電極表面,己證明PNA與互補(bǔ)核苷酸有很多的雜交特性,在許多方面顯示出優(yōu)于ssDNA的性能,有望被很好地用于基因診斷。

4.3藥物分析

許多藥物與核酸之間存在可逆作用,而且核酸是當(dāng)代新藥發(fā)展的首選目標(biāo)。電化學(xué)DNA生物傳感器除了可用于特定基因的檢測(cè)外,還可用于一些DNA結(jié)合藥物的檢測(cè)以及新型藥物分子的設(shè)計(jì)[32]。Wang等人[45]將修飾dsDNA的碳糊電極插入吩噻類藥物的醋酸緩沖溶液中富集,進(jìn)行計(jì)時(shí)電位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在未修飾dsDNA的碳糊電極上,吩噻僅僅產(chǎn)生非常小的陽極峰,而在修飾電極上可以測(cè)得nmol/L級(jí)吩噻類藥物。羅濟(jì)文等人[46]研究了道諾霉素(DNM)在小牛胸腺DNA修飾石墨粉末微電極上的電化學(xué)行為,提出了測(cè)定微量DNM的方法,DNM濃度在1.0×10-7~1.0×10-5mol/L之間,其微分脈沖伏安(DPV)峰電流與濃度有良好的線性關(guān)系,檢出限為5.0×10-8mol/L,并以此為基礎(chǔ)提出了一種測(cè)定人尿中痕量DNM的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度較高。宋玉民等[47]用電化學(xué)方法和熒光方法研究了桑色素(Morin)和抗腫瘤活性較強(qiáng)的桑色素合銅(Ⅱ)、桑色素合鋅(Ⅱ)與DNA在生理?xiàng)l件下的相互作用,從分子水平探討桑色素及其配合物抗癌活性不同的存因以及DNA作用方式之間的聯(lián)系。Maeda等人[48]研究了抗瘧藥阿的平在DNA修飾電極上的電化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示,在1×10-7~5×10-7mol/L范圍內(nèi),阿的平的濃度與指示化合物鐵氰化鉀的陽極峰電流成正比,當(dāng)濃度在8×10-7mol/L時(shí)達(dá)到飽和。同時(shí),用NaCl溶液做對(duì)比實(shí)驗(yàn),證實(shí)阿的平與DNA分子發(fā)生了強(qiáng)烈的特異性相互作用。這為今后研究某些藥物與DNA的相互作用機(jī)理及建立簡(jiǎn)便的藥物篩選方法作了探索性的工作。

4.4DNA損傷研究

人類基因與其它物種基因的功能均是編碼遺傳信息從而保護(hù)其完整性[49]。DNA修復(fù)酶始終監(jiān)視染色體并修復(fù)基因和細(xì)胞化學(xué)物所致的核苷酸殘基的破壞,若沒有DNA修復(fù),那么由多種多樣的DNA損傷因素所引起的染色體不穩(wěn)定性將對(duì)細(xì)胞和生物體產(chǎn)生致命的影響[50~53]。利用電化學(xué)DNA傳感器對(duì)DNA損傷進(jìn)行測(cè)定取得了令人滿意的效果。孫星炎等[54]研究了不同致突變因素(紫外光照射、亞硝酸)的作用下,以石墨電極為基底電極,特定堿基序列的DNA在電極表面能否雜交及雜交程度的差異,對(duì)DNA突變情況及可能的突變機(jī)理進(jìn)行了探討。Wang等[55]直接固定dsDNA微型電化學(xué)傳感器,探討紫外光輻射引起的DNA中鳥嘌呤氧化峰信號(hào)的變化,來檢測(cè)DNA的損傷。Sue等[56]認(rèn)為,目前基因檢測(cè)在疾病診斷方面的原理,一般是用固定的抗原或抗體來探察和它們捆綁在一起的分子聚集時(shí)的生物流動(dòng)性,而電化學(xué)DNA生物傳感器的微排列,是由數(shù)千被合成或被克隆的能在樣品中被察覺的連續(xù)互補(bǔ)DNA序列組成,臨床上通過傳感器的檢測(cè)能夠迅速找出哪種組織患病和是否帶有耐藥因子,為疾病的快速診斷提供了可能。

5展望

電化學(xué)DNA傳感器具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。它開辟了電化學(xué)與分子生物學(xué)交叉學(xué)科的新領(lǐng)域[57,58,60]。為生命科學(xué)的研究提供了一種新技術(shù)、新方法。在臨床醫(yī)學(xué)和遺傳工程等領(lǐng)域的研究具有深遠(yuǎn)的意義和應(yīng)用價(jià)值。今后電化學(xué)DNA傳感器的研究工作將會(huì)集中在:(1)適于高靈敏度檢測(cè)的雜交指示劑的篩選研究;(2)電極結(jié)構(gòu)的優(yōu)化,穩(wěn)定的自組裝單分子層修飾電極在電化學(xué)DNA傳感器的研究;(3)電化學(xué)DNA傳感器在疾病基因診斷上的應(yīng)用;(4)將一些藥物作為雜交指示劑,研究其與DNA的相互作用。