美麗的顏色

前言：想要寫(xiě)出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇美麗的顏色范文，相信會(huì)為您的寫(xiě)作帶來(lái)幫助，發(fā)現(xiàn)更多的寫(xiě)作思路和靈感。

美麗的顏色范文第1篇

當(dāng)我踩在青草地上　 呼吸著來(lái)自森林的鮮美空氣　 我感到大自然的芬芳　 充滿了我的脆腔　 我的肺葉　 一定也像闊大的貝葉一樣　 布滿了美麗而健康的　 生命色素　 而我的雙臂　 也像一雙迎風(fēng)擴(kuò)展的　 向著大森林飛去的鳥(niǎo)的翅膀

綠色!綠色!綠色!　 它是我們這個(gè)世界最美麗的顏色　 綠色的大森林　 它是我們碧綠的生命之水　 是我們?nèi)祟?lèi)的搖籃　 是我們美麗星體的盛裝

熱愛(ài)我們的森林　 熱愛(ài)我們綠色的大自然吧　 像熱愛(ài)我們自己的生命一樣　 保護(hù)我們的森林　 保護(hù)我們的每一株綠色植物吧　 像保護(hù)我們每個(gè)人的肺葉一樣

給每一只小鳥(niǎo)一座綠色的樓房　 給每一頭小鹿一片幽深的密林　 給每一棵小樹(shù)一方純凈的天空　 給每一叢小花一塊濕潤(rùn)的土壤　 讓一切濫伐者都醒來(lái)　 放下?tīng)旑^和鋸子　 讓一切制造污染和火災(zāi)者　 幡然悔語(yǔ)

那時(shí)候,請(qǐng)相信吧　 整個(gè)人類(lèi)都將與大自然相親相愛(ài)　 即使是高樓林立的城市　 也將緊緊地依偎在大森林的身旁　 美麗的綠蔭　 將在世界的每一處輕輕搖蕩

美麗的顏色范文第2篇

1、鎂離子在溶液里是沒(méi)有顏色的，比如氯化鎂、硫酸鎂都是無(wú)色溶液。

2、在固體里一般是白色，氧化鎂、氫氧化鎂都是白色固體。

3、在植物的葉綠體中鎂離子呈現(xiàn)綠色。

鎂離子是由鎂原子失去最外層的兩個(gè)電子得到的，是人體必需的礦物元素，被稱為為常量元素。正常成人身體總鎂含量約25克，其中百分之60至65存在于骨、齒。百分之27分布于軟組織。鎂主要分布于人體細(xì)胞內(nèi)，它的主要生理功能是：激活人體多種酶的活性；維護(hù)骨骼生長(zhǎng)和神經(jīng)肌肉的興奮性；維護(hù)胃腸道和激素的功能。

（來(lái)源：文章屋網(wǎng) ）

美麗的顏色范文第3篇

濱崎步、張韶涵……細(xì)細(xì)數(shù)來(lái)，當(dāng)紅的偶像明星們個(gè)個(gè)都擁有一雙電力十足的水靈大眼！怎樣才能讓自己的眼睛也變得又大又漂亮呢？無(wú)論你是單眼皮女生，還是肉肉眼美女，我們都擁有一個(gè)相同的目標(biāo)，就是能讓眼睛大一點(diǎn)，再大一點(diǎn)。美眉們，一起加入電“眼”女王速成班，讓你的雙眸電力四射，魅力無(wú)法阻擋！

流暢粗眼線

1、不要用眼線液來(lái)勾下眼線，這會(huì)讓你看起來(lái)像埃及艷后般俗氣。如果你是一個(gè)初學(xué)者，那么還是建議你使用眼線筆。眼線液雖然很好，但不容易控制，還是留給高級(jí)班的美眉吧。

2、除了黑色，藍(lán)色、紫色和棕色都是很適合亞洲人使用的顏色。一切淺色和高光色都不能讓你的眼睛變大，只會(huì)讓你的眼睛變得比原來(lái)更小。所以一定要慎重。但是當(dāng)你把白色眼線和黑色眼線搭配使用時(shí)，將會(huì)達(dá)到意想不到的效果呢。

3、通過(guò)眼線來(lái)改變眼型的方法還有很多：如果你是眼角下垂的下垂眼，那么建議你在畫(huà)上眼線的時(shí)候稍稍挑起，并且將眼尾加粗；如果你是細(xì)長(zhǎng)眼美眉，你可以通過(guò)加粗上眼線中部的方法，讓眼睛變得又圓又亮；如果你想給自己增加一點(diǎn)性感女人味，那么試著從上眼皮1/2處向眼尾畫(huà)一條上挑的眼線，就能擁有像李■那樣性感的鳳眼了。

濃睫芭比眼

1、任何買(mǎi)來(lái)的假睫毛都要經(jīng)過(guò)剪裁，直到適合你的眼睛輪廓才可以用。因?yàn)榧俳廾某叽缡枪潭ǖ模俏覀兠總€(gè)人的眼睛都不盡相同，所以啦，想要有好的效果就不要偷懶啦！

2、假睫毛貼在不同的部位會(huì)有不同的效果，比如貼在上眼皮中部，會(huì)讓眼睛看起來(lái)像圓圓的天真眼，如果是貼一兩簇在眼尾，又會(huì)變成高貴優(yōu)雅的魅惑眼，貼一整簾再加上雙重濃密睫毛膏，即使是蕭亞軒的迷蒙眼也變得電力四射了！

3、假睫毛雖然精美，同時(shí)也很脆弱，在每次使用時(shí)都要小心。不要用力拉扯它的邊緣，要順著睫毛的方向，用兩只手輕輕地取出來(lái)；從眼皮取下時(shí)，要捏住假睫毛的一頭，“刷”的一下子拉下，動(dòng)作干脆利索，不要拉著二三根睫毛往下揪。用過(guò)的假睫毛要徹底清除上面的粘合膠，整整齊齊地收進(jìn)盒里晾干后才能繼續(xù)使用。

漸層式小煙熏

1、煙熏妝開(kāi)始于2006年的秋冬，從此便一發(fā)不可收拾，今年秋冬的彩妝趨勢(shì)中依然“煙霧繚繞”！在生活中過(guò)于夸張的煙熏妝不但不美，還會(huì)讓你看起來(lái)像個(gè)臟兮兮的熊貓寶寶。

2、在暈染眼影的時(shí)候一定要有耐心，眼頭的色彩較輕柔，眼影范圍也不必暈染太大，但一定要有層次感。如果你是一個(gè)清秀的單眼皮美眉或者是個(gè)眼袋美眉，你也可以嘗試比較生活化的煙熏妝，眼影的范圍要小，可以省去下眼瞼的眼影暈染。用軟質(zhì)的眼線筆描繪眼線后，將眼線上下范圍暈染開(kāi)來(lái)，再與相近色的眼影融合即可。

3、建議你在眼頭和眉弓，還有鼻梁的部位用白色珠光眼影提亮，可以改善亞洲人平板的面孔，加強(qiáng)面部立體感！

睫毛篇 ■

愛(ài)美的美眉們誰(shuí)不想擁有一對(duì)濃密而卷翹的纖長(zhǎng)睫毛，顧盼流轉(zhuǎn)之間風(fēng)情萬(wàn)種，或純真可愛(ài)，或迷離誘惑，將女人的嬌媚體現(xiàn)得淋漓盡致？許多圖省事的MM就想到了去美容院做“睫毛嫁接”。這項(xiàng)美容服務(wù)如今已經(jīng)風(fēng)靡大江南北，只需用些許特殊膠水粘上漂亮的假睫毛，幾十分鐘后眼睛上就生出了兩排濃密的小扇子，忽閃忽閃的眼睛神采飛揚(yáng)。可最近曝光的“劣等假睫毛”導(dǎo)致的美容風(fēng)波又讓好多人為之卻步。其實(shí)只需正確使用睫毛膏，不用“嫁接”你也可以擁有奧黛麗?赫本那般如夢(mèng)如幻的雙眼。

步驟一：彎彎上翹的睫毛讓人看起來(lái)明媚可愛(ài)，我們首先要做的就是夾睫毛。夾睫毛時(shí)眼睛往下看，睫毛夾要放到接近睫毛根部的位置，手由眼尾往眼頭方向分三段把睫毛夾翹，夾的時(shí)候要輕輕用力往上提拉，可以讓睫毛自然上翹，不過(guò)注意不要用力過(guò)大，睫毛是很嬌貴的，不小心愛(ài)護(hù)就會(huì)掉下來(lái)。夾下睫毛時(shí)眼睛往上看，反手用睫毛夾輕輕夾住，下睫毛比較稀疏，動(dòng)作更要小心哦。

步驟二：許多美眉都抱怨自己的睫毛稀疏，用纖長(zhǎng)型睫毛膏拉長(zhǎng)了也不好看，感覺(jué)睫毛就跟營(yíng)養(yǎng)不良似的。其實(shí)只需在上睫毛膏之前，先用蜜粉輕輕刷在睫毛上，就可以增加睫毛的濃密感。也可以先刷一層睫毛底膏，再刷普通的睫毛膏，也會(huì)使睫毛的濃密超過(guò)一般程度，濱崎步的眼妝就是這樣化的哦。沒(méi)有睫毛底膏的美眉可以等刷的第一層睫毛膏干了之后，再刷一層，同樣可以達(dá)到增加睫毛濃密度的效果。

步驟三：用睫毛膏的時(shí)候，先從上睫毛刷起，用Z字形的刷牙方式刷，這樣可以防止睫毛打結(jié)，將睫毛膏刷在睫毛的根處稍微用力壓一下，這樣可以增加睫毛根部的支撐力，上翹的效果會(huì)比較好看，再由上往下將睫毛刷翹。然后用螺旋狀的睫毛刷將睫毛輕輕梳開(kāi)，就可以擁有絲絲分明、濃密卷翹的迷人俏睫毛了。刷下睫毛要用睫毛刷的尖端，可以讓眼睛變得更大，顯得明亮有神，不過(guò)經(jīng)常熬夜有黑眼圈或眼袋比較大的MM就不要刷下睫毛了，否則會(huì)讓缺點(diǎn)更加暴露，反而顯得眼睛沒(méi)有神采。

步驟四：東方人的膚色較黑，直接使用彩色睫毛膏并不好看，用黑色睫毛膏刷出的兩把小黑扇子反而更加動(dòng)人，每一次眨眼時(shí)睫毛微微的顫動(dòng)都會(huì)勾起人心底的一份憐愛(ài)。

喜歡新潮炫色的美眉可以先刷一層深色的睫毛膏，睫毛變得分明、濃黑之后，在睫毛尖端再刷上一層淺色的睫毛膏，就可以擁有多層次感的絢麗睫毛，同樣前衛(wèi)，效果卻好得多。也可在上下睫毛刷上不同色系的睫毛膏，展現(xiàn)絢麗迷人的眼妝效果。

睫毛修護(hù)錦囊 ■

雖然睫毛膏可以讓你的睫毛迅速變得彎翹迷人，但是晚上卸妝的時(shí)候一定要清除干凈，讓睫毛美美地睡上一覺(jué)，第二天才能繼續(xù)讓你神采飛揚(yáng)。卸妝的時(shí)候用力一定要恰當(dāng)，用力過(guò)大很容易弄掉睫毛。

美麗的顏色范文第4篇

關(guān)鍵詞：農(nóng)村小學(xué)；美術(shù)教育；現(xiàn)狀；對(duì)策

一、農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育的價(jià)值空間

當(dāng)前農(nóng)村基礎(chǔ)教育階段中的美術(shù)教育，是提高整個(gè)國(guó)民文化素養(yǎng)的重要組成部分。因此，加強(qiáng)地方特色在農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育中的應(yīng)用顯得非常必要。

上美術(shù)課是學(xué)生深感快樂(lè)的事，小學(xué)生學(xué)習(xí)美術(shù)，有利于開(kāi)發(fā)智力，提高其審美能力和想象力，促進(jìn)其綜合素質(zhì)的全面發(fā)展。當(dāng)然，美術(shù)教育的育人是潛移默化的，不可能有立竿見(jiàn)影的功效。這就說(shuō)明小學(xué)美術(shù)教育提升空間很大。

二、農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育現(xiàn)狀分析

1.美術(shù)教育地位低微

目前，很多農(nóng)村學(xué)校的學(xué)生家長(zhǎng)認(rèn)識(shí)不到美術(shù)教育是對(duì)創(chuàng)造性思維和創(chuàng)造力培養(yǎng)最具成效的學(xué)科之一。家長(zhǎng)不重視，學(xué)生應(yīng)付，有學(xué)生說(shuō)：“只要語(yǔ)、數(shù)、英覺(jué)得好就可以，因?yàn)榘謰層X(jué)得美術(shù)工具浪費(fèi)錢(qián)，不給買(mǎi)美術(shù)工具。”然而，面對(duì)內(nèi)容豐富的美術(shù)教材，基本的繪畫(huà)工具還有手工材料，卻由于工具不齊全而大大影響了美術(shù)課的教學(xué)質(zhì)量。其他學(xué)科的教師覺(jué)得美術(shù)教師很輕松，沒(méi)有語(yǔ)文課的之乎者也；沒(méi)有數(shù)學(xué)課的數(shù)字游戲；更沒(méi)有英語(yǔ)課的ABCD，無(wú)非是畫(huà)畫(huà)，學(xué)生吵鬧也是正常，若有需要思想教育，學(xué)習(xí)輔導(dǎo)的，更被視為剝奪學(xué)生的美術(shù)課。其實(shí)不然，美術(shù)學(xué)科是在夾縫里求生存、難度極大。

2.對(duì)學(xué)生安全的局限

學(xué)生的安全是第一，這是毋庸置疑的，但如今安全變得讓教師在某些學(xué)習(xí)活動(dòng)上畏手畏腳，要帶出校園寫(xiě)生，幾乎沒(méi)有教師敢去承擔(dān)這份風(fēng)險(xiǎn)，而在農(nóng)村小小的校園發(fā)揮的余地甚少。因?yàn)榘踩珕?wèn)題，教師又不敢放開(kāi)手腳大膽地把學(xué)生帶到農(nóng)村特色的周邊環(huán)境進(jìn)行寫(xiě)生教育、觀察教育，如此一來(lái)，直觀感受受到極大的限制，必然大大打擊教師的熱情，降低學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。

3.師資力量匱乏

很多農(nóng)村學(xué)校的專業(yè)美術(shù)教師非常缺乏，都是由其他科目的教師兼職上課。本人的經(jīng)歷是，我所在的學(xué)校11個(gè)班級(jí)，就我一個(gè)專職的美術(shù)教師，本校的課程都承擔(dān)不完，卻要配合教育局的“三校綁定資源共享”奔走于另一個(gè)更偏僻的農(nóng)村學(xué)校，花一個(gè)上午去上兩節(jié)課，下午再回本學(xué)校上三節(jié)課，而結(jié)果就是，本來(lái)可以從一年級(jí)抓起的本校學(xué)生讓兼職教師教，所教的班級(jí)在美術(shù)素養(yǎng)上是有所提高，但這不是多此一舉嗎？缺的還是缺，拆東墻補(bǔ)西墻，累的是靠?jī)蓷l腿奔走的教師。

三、農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育融入地方特色的途徑

雖然農(nóng)村教學(xué)設(shè)施落后于城市，但是農(nóng)村本身就是一個(gè)蘊(yùn)含美術(shù)創(chuàng)作美的地方。教師應(yīng)當(dāng)積極引導(dǎo)學(xué)生從質(zhì)樸可愛(ài)的土地上發(fā)掘出靈感，讓他們時(shí)刻注意身邊的人和事，去盡情地描繪生活，豐富他們的內(nèi)心世界。

1.以地方資源，展示農(nóng)村印象

農(nóng)村是一本五彩斑斕的教材，它展示著不同風(fēng)景的四季，擁有著遼闊的田野，秀氣的山峰，清澈的溪流，獨(dú)特的古建筑等。買(mǎi)不起彩色橡皮泥，可用田里的泥巴代替，校園外面各種各樣的樹(shù)葉也是入手的材料，葉子貼畫(huà)，葉子拓印畫(huà)，還有山上的松果也可以是手工課的材料，還有瓦片，更不用說(shuō)光滑的鵝卵石，花叢里多彩的蝴蝶等，這無(wú)疑是大自然對(duì)農(nóng)村學(xué)生的恩賜，教師應(yīng)當(dāng)鼓勵(lì)學(xué)生從家鄉(xiāng)挖掘美，在美術(shù)作品中展現(xiàn)美。通過(guò)對(duì)生活的觀察，描繪自然，學(xué)生對(duì)家鄉(xiāng)的熱愛(ài)會(huì)更加濃烈。

2.從農(nóng)村鄉(xiāng)俗入手，彰顯淳樸民風(fēng)

農(nóng)村具備著城市所沒(méi)有的農(nóng)家文化。這些民俗風(fēng)情都是經(jīng)歷了千百年才逐漸形成的，形成了獨(dú)特的風(fēng)格。尤其是我國(guó)的傳統(tǒng)節(jié)日，在農(nóng)村的地位更加明顯，節(jié)日氛圍也更加濃厚。比如，端午節(jié)、中秋節(jié)、春節(jié)、元宵節(jié)等，都被農(nóng)村的風(fēng)土人情闡釋得非常完美。粽子、月餅、年糕、元宵、燈籠，年畫(huà)、剪紙這些都是代表傳統(tǒng)節(jié)日的重要意象。所以，小學(xué)美術(shù)教師應(yīng)當(dāng)督促學(xué)生將這些美好的民俗風(fēng)情融入美術(shù)作品里，讓他們懂得農(nóng)村的美，農(nóng)村的熱鬧，使他們的美術(shù)作品不再空洞，變得更加富有色彩。

3.關(guān)注家鄉(xiāng)變化，充分展示新農(nóng)村面貌

隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，如今的農(nóng)村已經(jīng)發(fā)生了翻天覆地的變化。很多小洋樓拔地而起，村里也鋪上了公路，這些都是社會(huì)主義新農(nóng)村的變化。這是一道亮麗的風(fēng)景線，老師可讓學(xué)生在將過(guò)去與現(xiàn)在進(jìn)行對(duì)比后，感受家鄉(xiāng)的變遷，通過(guò)手中的筆滲透出歡喜的心情，激發(fā)起他們熱愛(ài)家鄉(xiāng)的良好品質(zhì)，讓學(xué)生更加珍惜來(lái)之不易的生活，從而更加刻苦地學(xué)習(xí)，在學(xué)成之后努力回報(bào)家鄉(xiāng)，這也是美術(shù)做為人文學(xué)科的一項(xiàng)重要作用。

4.認(rèn)真體驗(yàn)農(nóng)村人的樸實(shí)，描繪出勞動(dòng)的苦甜

農(nóng)村小學(xué)生的父母多數(shù)都是通過(guò)辛勤的勞動(dòng)為子女提供學(xué)習(xí)條件，他們身上普遍散發(fā)著樸實(shí)的農(nóng)村氣息。這種刻骨銘心的體驗(yàn)將使學(xué)生的繪畫(huà)更加到位豐滿。例如，以“父親或母親”為題完成繪畫(huà)，學(xué)生可以將父母干農(nóng)活時(shí)的場(chǎng)景描繪出來(lái)，增強(qiáng)感染力，引起大家的共鳴。

5.改善小學(xué)美術(shù)教學(xué)條件，加強(qiáng)師資素質(zhì)建設(shè)

首先，應(yīng)當(dāng)對(duì)現(xiàn)有的美術(shù)教師進(jìn)行專科的培訓(xùn)，教師應(yīng)不斷提高自己的能力；不斷提高自己的業(yè)務(wù)水平。其次，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)化學(xué)校設(shè)施，增添教具，配備專職美術(shù)教師強(qiáng)化校園文化建設(shè)，培養(yǎng)特長(zhǎng)生。讓一部分學(xué)生“富”起來(lái)，讓學(xué)校的美術(shù)教學(xué)向更高水平邁進(jìn)，為農(nóng)村地方特色的融入提供更多的契機(jī)。

農(nóng)村小學(xué)教育應(yīng)當(dāng)受到社會(huì)各界更多的重視和關(guān)愛(ài)。當(dāng)然，農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育更得益于農(nóng)村固有的地方特色，只有合理利用地方特色，農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育水平才會(huì)擁有顯著的提升，從而改變農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育的落后面貌。民族的才是世界的，農(nóng)村學(xué)校獨(dú)特的美術(shù)教育資源是廣大農(nóng)村美術(shù)教師特有的舞臺(tái)，讓我們一起為農(nóng)村藝術(shù)教育事業(yè)貢獻(xiàn)出應(yīng)有的一份力，讓農(nóng)村學(xué)生的這片天空更加絢麗多姿！

參考文獻(xiàn)：

[1]喬麗珍.農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教學(xué)中存在的問(wèn)題及對(duì)策[J].教育實(shí)踐與研究：小學(xué)版，2008（1）.

[2]楊文春.淺談農(nóng)村小學(xué)美術(shù)教育教學(xué)現(xiàn)狀分析及策略[J].現(xiàn)代教育教研，2011（6）.

美麗的顏色范文第5篇

inhibition of green fluorescent protein expression by short hairpin rna expression vector in human breast cancer cells（mcf7/adrr）

gan huizhu, zhang guizhen, zhang fengchun, bu lisha, yang shaojuan, gao shen, zheng deming. 

department of hematology, chinajapan union hospital, jilin university, changchun 130031, china

［abstract］  objective:to investigate whether short hairpin rna expression vector targeting enhanced green fluo in multidrug resistance human breast cancer cells(mcf7/adrr).methods:the shrna expression vector targeting egfp gene was constructed, and cotransfected into mcf7 cells and mcf7/adrr cells with pcdna3.0 egfp. the rnai effects were assessed by laser confocal scanning microscope and flow cytometry.results:in mcf7/adrr cells transient cotransfected with psilencertm 3.1h1 neo shrna and pcdna3.0 egfp expression vectors,lcsm showed that positive percentage of egfp expression was reduced,and fluorescence intensity was depressed significantly.fcm assay showed that positive percentage was significantly reduced to 35.6%(p<0.05).conclusion:shrna expression vector targeting egfp gene could inhibit enhanced green fluorescent protein expression in mcf7/adrr cells effectively and specifically, rna interference exists in mcf7/adrr cell line, which will provide a new strategy for researching the reversal of multidrug resistance by rnai in breast cancer cells.

   

［key words］  rnai；green fluorescent protein；breast neoplasm；shrna expression vector

   

rna干擾（rna interference，rnai）是近年來(lái)興起的分子生物學(xué)技術(shù)，是在研究反義rna作用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，首先在華麗新小桿線蟲(chóng)（c.elegans）中證實(shí)［1］；是由dsrna（doublestranded rna）介導(dǎo)的基因阻抑現(xiàn)象，由于這是一種在rna水平的基因表達(dá)抑制，故稱為rna干擾，簡(jiǎn)稱rnai。rnai技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為人類(lèi)研究基因功能、抗病毒、治療惡性腫瘤的一種新方法［26］。綠色熒光蛋白（gfp）可作為報(bào)告基因、定位標(biāo)志，并可用于基因轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定［7］。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（egfp）是綠色熒光蛋白的突變型，所發(fā)熒光強(qiáng)度高，通過(guò)顯微鏡可直接觀測(cè)、快速、簡(jiǎn)便。本研究構(gòu)建了針對(duì)egfp基因的shrna表達(dá)載體，觀察其在耐阿霉素的人乳腺癌細(xì)胞中對(duì)egfp表達(dá)的抑制作用。

1  材料與方法

1.1  質(zhì)粒和細(xì)胞株  pcdna3.0 egfp質(zhì)粒由中日聯(lián)誼醫(yī)院基本外科曹宏惠贈(zèng)；psilencertm 3.1h1 neo sirna表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó)ambion公司。敏感的和耐阿霉素的人乳腺癌細(xì)胞株mcf7/s、mcf7/adrr由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院張鳳春教授惠贈(zèng)。

1.2  試劑  t4dna連接酶購(gòu)自美國(guó)promega公司；bamh ⅰ和hind ⅲ內(nèi)切酶購(gòu)于日本takara公司；質(zhì)粒抽提試劑盒dna purification system wizardplus sv minipreps購(gòu)自美國(guó)promega公司；siporttm xp1轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)ambion公司；rpmi1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)gibco brl公司；阿霉素（adm）購(gòu)自法瑪西亞普強(qiáng)公司；g418購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

1.3  方法

1.3.1  egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建  根據(jù)shrna 的設(shè)計(jì)原則和genebank egfp編碼基因的已知序列(genebank nm_001970)，選擇特異性shrna靶位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)egfp基因shrna插入模板寡核苷酸。合成egfp基因shrna插入模板寡核苷酸，退火后形成雙鏈的shrna插入模板寡核苷酸，克隆到psilencertm 3.1h1 neo sirna表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定，純化。

1.3.2  細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染  mcf7/s、mcf7/adrr細(xì)胞用含有10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%co2條件下常規(guī)培養(yǎng)。mcf7/adrr細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1.0 μg/ml的阿霉素維持耐藥亞型，試驗(yàn)前2周換用無(wú)阿霉素的培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf7/adrr細(xì)胞，以2×105/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后達(dá)到30%～60%充滿，將6 μl siporttm xp1轉(zhuǎn)染試劑加入94 μl無(wú)血清rpmi1640培養(yǎng)基，終體積為100 μl，混勻，室溫孵化5～20分鐘；分別將2 μg共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒dna(pcdna3.0 egfp質(zhì)粒1 μg，干擾質(zhì)粒1 μg)加入上述稀釋物，室溫孵化5～20分鐘；換用2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基，加入質(zhì)粒dna/siporttm xp1復(fù)合物；5小時(shí)后換用含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)同時(shí)只加入pcdna3.0 egfp質(zhì)粒對(duì)照組和只加入siporttm xp1轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組以及陰性對(duì)照質(zhì)粒組。陰性對(duì)照質(zhì)粒是一個(gè)編碼shrna的環(huán)形質(zhì)粒，其序列與小鼠、人、大鼠基因組序列無(wú)同源性。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24～48小時(shí)后，檢測(cè)rna干擾效果。

1.3.3  激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)  將無(wú)菌處理的蓋玻片放到12孔培養(yǎng)板中，加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的mcf7/adrr細(xì)胞，37℃、5%co2孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞自然貼附于蓋玻片上。然后，將上述制備好的玻片浸入0.01 mmol/l(ph 7.4)pbs中洗3×5分鐘，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)的激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光的表達(dá)變化。

1.3.4  轉(zhuǎn)染效率的判定  在激光掃描共聚焦顯微鏡下沿垂直與水平經(jīng)過(guò)連續(xù)視野計(jì)數(shù)egfp陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，如果轉(zhuǎn)染效率極低，如低于1%，則計(jì)數(shù)各孔所有egfp表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，共觀察約20個(gè)視野，按如下公式計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

   

轉(zhuǎn)染效率＝egfp表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5  流式細(xì)胞儀檢測(cè)  將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的mcf7/adrr細(xì)胞用pbs洗滌2次，加入600 μl pbs，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.3.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spss 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2  結(jié)果

2.1  egfp基因shrna表達(dá)質(zhì)粒的鑒定  重組質(zhì)粒分別用bamh ⅰ和hind ⅲ雙酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果出現(xiàn)66 bp和4.3 kb條帶，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的egfp基因模板寡核苷酸長(zhǎng)度相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行dna序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的模板寡核苷酸序列相符，進(jìn)一步證實(shí)egfp基因shrna表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2  lcsm檢測(cè)pcdna3.0 egfp和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況  mcf7/adrr細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcdna3.0 egfp質(zhì)粒后，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后4小時(shí)即可見(jiàn)到部分細(xì)胞表達(dá)egfp，在4～48小時(shí)內(nèi)表達(dá)egfp的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在48小時(shí)達(dá)到高峰，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光。共轉(zhuǎn)染空載體與pcdna3.0 egfp質(zhì)粒細(xì)胞中egfp的表達(dá)不受影響，同時(shí)共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)egfp的表達(dá)不受影響。而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，熒光強(qiáng)度也明顯降低，亮度減弱。mcf7/adrr細(xì)胞熒光強(qiáng)度為38.34±6.35，陽(yáng)性細(xì)胞百分率為58.53%±0.55%；而同時(shí)轉(zhuǎn)染pcdna3.0 egfp質(zhì)粒和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生明顯減少，細(xì)胞熒光強(qiáng)度為15.85±4.93，陽(yáng)性細(xì)胞百分率為30.13%±0.26%，結(jié)果見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染mcf7/adrr細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒dna與轉(zhuǎn)染試劑siporttm xp1 比例為12時(shí)egfp表達(dá)最強(qiáng)，故采用該優(yōu)化條件進(jìn)行egfp干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組egfp表達(dá)最強(qiáng)時(shí)，測(cè)定的轉(zhuǎn)染效率大致為70%～80%。

圖1  egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定（略）

fig.1  identification of psilencertm 3.1h1 neo egfp shrna expression plasmid by restriction enzyme digestion

note:m.dl2000 dna marker;1.egfp shrna expression plasmid;2.egfp shrna expression plasmid digested by bamh ⅰ and hind ⅲ.

表1  激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)egfp的表達(dá)（略）

tab.1  results of egfp expression assayed by lcsm

note:compare with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,1) p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.

表2  流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)egfp的表達(dá)（略）

tab.2  results of egfp expression assayed by flow cytometry

圖2  流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)egfp的表達(dá)（略）

fig.2  results of egfp expression assayed by flow cytometry

note:a.mcf7/adrr;b.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+negative plasmid;c.mcf7/adrr+pcdna3.0;d.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+shegfp.compared with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,*.p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.

2.3  流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pcdna3.0 egfp和egfp發(fā)夾shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況  流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光的表達(dá)，結(jié)果顯示單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcdna3.0 egfp質(zhì)粒mcf7/adrr細(xì)胞有egfp表達(dá)，共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)egfp的表達(dá)不受影響；但共轉(zhuǎn)染pcdna3.0 egfp質(zhì)粒和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生明顯減少，陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著降低，差異有顯著意義(p<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

3  討論

   

當(dāng)21～23 nt短鏈rna(sirna)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，引起序列特異性內(nèi)源性目的基因mrnas的降解和基因表達(dá)的有效抑制。rna干擾引發(fā)的基因沉默作用是特異的和有效的，sirna對(duì)與其同源的基因表達(dá)產(chǎn)生作用，而對(duì)與其不同源的基因表達(dá)不產(chǎn)生作用。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究顯示，sirna濃度比傳統(tǒng)的反義核酸濃度低幾個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)仍然有效，rnai技術(shù)沉默目的基因具有高效、方便而且適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

   

rnai作用機(jī)制可能為病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些雙鏈dsrna。宿主細(xì)胞胞質(zhì)中的dicer rnasel將dsrna切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段rna，即sirna。這些sirna可能與解旋酶和一些相關(guān)因子形成rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（rnainduced silencing complex，risc）。新形成的復(fù)合體與外源性基因表達(dá)的mrna進(jìn)行特異性結(jié)合，并誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mrna的降解反應(yīng)，使外源性基因的蛋白表達(dá)消失。rnai具有放大效應(yīng)。被降解的mrna片段及未被降解的完整mrna均可作為引物，在rna依賴的rna聚合酶（rnadependent rna polymerase，rdrp）作用下，合成更多的dsrna。新合成的dsrna進(jìn)入下一輪rnai循環(huán)。

  

以前報(bào)道的許多rnai載體系統(tǒng)都不含有篩選標(biāo)志，故陽(yáng)性rnai克隆的篩選非常困難［8］。本研究采用的psilencer3.1 h1 neo載體具有篩選標(biāo)志，帶有新霉素抗性基因，所以可以用g418進(jìn)行篩選；而在加入800 μg/ml g418穩(wěn)定篩選時(shí)，只有含有mdr1發(fā)夾模板序列的克隆生長(zhǎng)，并且陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)染前后生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)速度均無(wú)明顯差別。

   

利用lsfm和流式細(xì)胞儀檢測(cè)pcdna3.0 egfp和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況。mcf7/adrr細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcdna3.0 egfp質(zhì)粒后，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在4小時(shí)后即可見(jiàn)到部分細(xì)胞表達(dá)egfp，在4～48小時(shí)內(nèi)表達(dá)egfp的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在48小時(shí)達(dá)到高峰，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光，主要位于細(xì)胞核內(nèi)；而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光明顯減少、亮度減弱，熒光強(qiáng)度降低，陽(yáng)性細(xì)胞百分率減低，差異有顯著性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞比例與激光共聚焦熒光顯微鏡計(jì)算結(jié)果大致相符，mcf7/adrr細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到55%以上。陽(yáng)性對(duì)照egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染驗(yàn)證siporttm xp1轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率符合實(shí)驗(yàn)要求，可以用siporttm xp1轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行發(fā)夾shrna表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。同時(shí)pcdna3.0 egfp和egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，egfp shrna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后有效而特異地抑制egfp的表達(dá)，故可以作為rna干擾實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)一步證實(shí)基因沉默可引起序列特異性的目的基因表達(dá)的抑制。

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