大鼠脊柱種植性腫瘤模型

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【摘要】目的采用瘤塊種植法制備脊柱腫瘤動物模型。方法將SHZ-88大鼠乳腺癌細胞株接種雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎內,制成大鼠脊柱種植性腫瘤的動物模型。結果瘤塊植入術后15d病變節段大體標本見椎體表面有明顯隆起的軟組織腫塊形成,包裹部分椎體表面;矢狀面見椎體骨質凹陷,為腫瘤組織呈魚肉樣,腫瘤組織向周圍骨質浸潤;病理切片證實腫瘤形成。模型組成瘤率80%。結論瘤塊種植法可構建大鼠脊柱種植性腫瘤模型。

【關鍵詞】脊柱疾病;脊椎腫瘤;疾病模型,動物

ABSTRACT:ObjectiveToestablishaspinaltumormodelwiththetumorsegmentplantmethod.MethodsSHZ-88mammarycancercelloftheratwasasubcutaneousinjectedintofemalenewbornrattoproducesubcutaneouslump.Thentumorsegmentswereplantedintothelumbarvertebralofthefemalethymectomizesrats,toestablishratspinaltumormodel.ResultsTheinvolvedvertebralbodieswasobservedencapsulatepartsofthevertebralbody,at15daysafterthesurgery.Bonedefectcanbeseeninthesagittalplane,tumortissueappearsgray-whiteincolorandinfiltrationintothevertebralbody.Themodelofspinaltumorwasestablishedin80%rats.ConclusionSpinaltumormodelinratsimulatedthemalignanttumorcharacter,whichhasgreatsignificationinthestudythecharacterofthemetastasisspinalneoplasms,andcomparisonsofthecurativeeffectsofdifferenttherapies.

KEYWORDS:spinaldisease;spinalneoplasms;diseasemodels,animal

良好的腫瘤動物模型要具備以下特點:相似性、可重復性、可靠性、適用性、可控性、易行性及經濟性等［1］。目前常用的骨腫瘤動物模型方法有誘導法和移植法［2］,其中通過移植法建立骨腫瘤模型具有特性明確、生長一致性好、實驗周期短,可反復復制等特點,因此廣為采用。在臨床上脊柱腫瘤多為轉移性,且病期較晚［3］。建立脊柱轉移性腫瘤的動物模型,有助于研究脊柱轉移性腫瘤的相關特性,比較各種治療方法的療效。筆者采用SHZ-88大鼠乳腺癌細胞株接種雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎內,初步建立大鼠脊柱種植性腫瘤模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與動物

SHZ-88大鼠乳腺癌細胞(中國科學院上海生命科學研究所生物化學與細胞生物學研究所)。SD大鼠(清潔級)由福建醫科大學實驗動物中心提供［許可證號SCXK(滬)2007-300-5］,體質量(420±20)g。

1.1.2主要試劑

PBS緩沖液(美國Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),FCS-1640培養液(美國Gibco公司),0.25%胰蛋白酶Trypsin(美國Gibco公司),水合氯醛(上海山浦化工有限公司)。

1.1.3主要儀器

生物潔凈工作臺(AIR-TECHBCM-1000A型,蘇州安泰空氣技術有限公司)。CO2培養箱(3111型,美國ThermoForma公司)。1×70熒光倒置式相差顯微鏡(日本Olympus公司)。光學顯微鏡(BH-2型,日本Olympus公司)。顯微外科手術器械、玻璃培養瓶、培養皿、X線攝片機(美國Kodak公司)。

1.2方法

1.2.1乳腺癌細胞培養

SHZ-88大鼠乳腺癌細胞培養于含10%胎牛血清的FCS1640培養液,隔天換液,2~3d傳1代。

1.2.2建立脊柱腫瘤動物模型

1.2.2.1皮下腫瘤模型

取處于對數生長期的細胞消化后,用無血清的培養液稀釋成1×107mL,各取0.3mL注入8只7日齡雌性SD大鼠右腋皮下,并用棉簽局部壓迫1min,防止懸液漏出。每日觀察腫瘤生長情況。瘤塊增大至約1.5cm×1.0cm,取腫瘤組織用10%福爾馬林溶液固定,作病理切片,H-E染色。

1.2.2.2去胸腺模型

參照文獻［4］方法去除SD大鼠的胸腺。

1.2.2.3脊柱腫瘤模型

將去胸腺SD大鼠20只,隨機分為模型組與對照組,每組10只。10%水合氯醛麻醉、固定、消毒。取腹部正中切口,逐層進入腹腔,暴露腹腔后壁。以旋髂深動脈為定位標志,打開后腹膜,顯露第6腰椎,用磨鉆在椎體上開口,并在椎體中磨造出一個口小底大的空腔(圖1)。取皮下腫瘤瘤體,置于無血清培養液中,剪成直徑約0.5mm瘤塊。將瘤塊填入模型組椎體空腔內,對照組不填入瘤塊,用骨蠟封閉開口,逐層縫合。每日觀察大鼠生長情況,第2周X線攝片檢查腫瘤生長情況,處死后取出椎體標本,病理切片,H-E染色檢查。

2結果

2.1大鼠乳腺癌細胞

SHZ-88大鼠乳腺癌細胞呈單層貼壁樣生長,光鏡下見細胞為多邊形,少數梭形,樹枝樣突起,細胞大小不一,可見多倍體細胞,核分裂相易見,并出現病理性核分裂。SHZ-88大鼠乳腺癌細胞培養于含10%胎牛血清的FCS1640培養液中,細胞增殖迅速,2~3d即可貼滿瓶壁。

2.2皮下腫瘤模型

細胞接種當天局部可見由細胞懸液形成的液泡,第2日液泡吸收,局部變平整。接種5d后可觸及皮下結節,其后瘤塊生長迅速,接種12d左右后瘤塊可增大至約1.5cm×1.0cm,成瘤率100%。腫瘤組織呈魚肉樣,并可見壞死,病理切片H-E染色見腫瘤細胞交織排列,大小不一,形態不規則,異形性明顯,細胞核大小不一,深染,病理性核分裂像易見。

2.3去胸腺模型

為提高成年SD大鼠的成瘤率,先行胸腺摘除,破壞其自身免疫系統。分離胸腺兩葉下極時,切口即與胸腔相通,出現氣胸癥狀,應迅速游離下極摘除胸腺,收緊縫線,關閉切口,并立即對右胸腔穿刺抽氣,癥狀可迅速緩解。大鼠胸腺分為左右兩葉,應仔細檢查取出的胸腺組織是否完整,若不完整,則不能作為去胸腺鼠模型。脊柱腫瘤植入手術在術后5d后進行,以恢復大鼠對后續手術的耐受力。

2.4脊柱乳腺癌種植瘤模型

術中、術后均無死亡。術后3d內,在飲水中加入適量抗生素,預防切口感染。2組切口愈合較好,未見明顯感染者。部分出現左下肢跛行,可能系術中剝離腰大肌時神經牽拉引起,于術后5~10d內均恢復正常。術后15d時X線檢查見植入部位椎體前緣凹陷,瘤塊植入組椎體骨質密度較對照組略有改變,但不明顯(圖2)。處死后,顯露腫瘤植入椎體,模型組8只見椎體表面有隆起的軟組織腫塊,其余未見腫瘤生長。對照組均未見腫瘤生長。15d2組均未見明顯神經功能改變。暴露病變節段的椎體,模型組8見椎體表面有軟組織腫塊形成,成瘤率為80%,而對照組中未見腫瘤形成。

2.5腫瘤病理學

病變節段大體標本見椎體表面有明顯隆起的軟組織腫塊形成,包裹部分椎體表面,矢狀面上見椎體骨質凹陷,為腫瘤組織呈魚肉樣,已填滿空腔。鏡下見腫瘤周圍骨質吸收,形成的骨質缺損較原有的空腔大,腫瘤組織向周圍骨質浸潤,形成一半環形浸潤帶。椎體中央見一腫瘤組織,并向周圍骨小梁中浸潤生長(圖3),但未突破椎體后壁。

3討論

3.1本脊柱腫瘤動物模型的特點

SHZ-88大鼠乳腺癌細胞株是南京鐵道醫學院于1987年用7,12-二甲基苯蒽(DMBA)在雌性SD大鼠上誘導形成后,將癌組織體外培養傳代后形成［5］。SHZ-88細胞生物學特性穩定,具備快速生長的惡性腫瘤細胞特點,在同種動物體內具有致瘤性,是研究腫瘤特性的良好體外實驗模型［6］。在本實驗以SHZ-88細胞接種于雌性SD乳鼠中,成瘤率達100%。乳腺癌是最容易發生脊柱轉移的癌癥之一,因此采用乳腺癌細胞作為種子細胞制備脊柱轉移性腫瘤動物模型能提高模型制備的成功率,及臨床生物學特性的相似性。本實驗中為進一步提高實驗的成功率,所有待移植乳腺癌瘤塊的SD大鼠均先期行胸腺摘除術,降低大鼠的自身免疫力,提高模型成功率。

瘤塊植入以后位于腹腔內,無法直接觀察腫瘤的生長,由于大鼠的脊柱骨質較少,即使有腫瘤病變,在X線下的表現也不甚明顯。判斷腫瘤的生長情況主要還是依據處死后取出的病理標本判斷。在處理組中成瘤率達80%,說明該模型有較高的成功率。大體標本顯示為腫瘤組織呈魚肉樣,已填滿空腔,周圍骨質吸收,形成的骨質缺損較原有的空腔大,腫瘤組織向周圍骨質浸潤,在椎體中形成一半環形與周圍正常骨組織不同浸潤帶,說明該腫瘤模型的生長特性與人類腫瘤相似。人類脊柱腫瘤的一個重要臨床特點是椎體骨質破壞后,椎體壓縮造成脊髓壓迫癥狀。Mantha等報道應用大鼠乳腺癌細胞株CRL-1666建立大鼠移植性脊柱轉移瘤的方法中,在瘤塊植入10~15d后,植入組出現下肢功能的障礙［7］。但在本組實驗中并未出現脊髓壓迫引起的下肢功能障礙。究其原因可能有:(1)大鼠為爬行動物,脊柱的受力與人類不同,椎體破壞后,沿椎體縱軸的壓縮力較小,尚不能引起椎體壓縮;(2)SHZ-88細胞侵襲較弱,無法在短時間內突破椎體后壁,侵入椎管內壓迫脊髓;(3)骨蠟與椎體表面骨組織的結合力差,椎體磨造的開口用骨蠟封閉后可能脫落,導致腫瘤向前方阻力小的方向生長。此不足有待日后實驗中近一步改進。

3.2制作脊柱腫瘤模型的常見并發癥及預防

瘤塊植入手術可能出現的并發癥:(1)腹部大血管損傷。瘤塊植入后需縫合兩側腰大肌防止瘤塊脫出,腹部的大血管多位于左側腰大肌前方,易損傷,在縫合時最好先將大血管適當分離,向左側牽開。(2)腰神經損傷。在分離附著于椎體表面的腰大肌時可能造成腰神經的牽拉損傷,術后出現跛行癥狀,于術后5~10d內均可恢復正常。(3)脊髓損傷。用磨鉆在椎體上磨造容納瘤塊的空腔時,應注意控制深度,以防穿出椎體后壁,損傷脊髓。術后可能出現的并發癥有切口感染,腹腔內感染等,注意手術過程中的無菌操作,術后給予適當的抗感染治療等措施,可避免。

【參考文獻】

［1］郝光榮.實驗動物學［M］.上海第二軍醫大學出版社,2002:198-199.

［2］GuoYJ,MazarAP,LebrunJJ,etal.Anantiangiogenicurokinase-derivedpeptidecombinedwithtamoxifendecreasestumorgrowthandmetastasisinasyngeneicmodelofbreastcancer［J］.CancerRes,2002,62(16):4678-4684.

［3］唐煥章,徐皓,符臣,等.病變椎體切除并重建治療脊柱轉移性腫瘤［J］.實用醫學雜志,2006,22(1):676-678.

［4］熊海波,夏穗生,溫浩.去胸腺大鼠模型的建立及改進［J］.中華器官移植雜志,2004,25(4):214.

［5］蘇寧,張曉明,韓月明,等.SHZ-88大鼠乳腺癌細胞系的建立及其生物學特性觀察［J］.癌癥,1991,10(5):378-381.

［6］蘇寧,尹科祥,黃穆涵,等.SHZ-88大鼠乳腺癌細胞系生物學特征［J］.南京鐵道醫學院學報,1995,14(3):143-147.

［7］ManthaA,LegnaniFG,BagleyCA,etal.Anovelratmodelforthestudyofintraosseousmetastaticspinecancer［J］.JNeurosurgSpine,2005,2(3):303-307.