老年大鼠術后認知功能障礙分析論文

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摘要：目的探討腹部手術操作對老年大鼠學習認知能力和海馬CA1區膽堿乙酰轉移酶(ChAT)陽性神經元的影響以及石杉堿甲干預的結果。方法20月齡Wistar大鼠32只，隨機分為對照組、麻醉組、手術組和石杉堿甲組，石杉堿甲組手術前給予石杉堿甲灌胃3w，3w后手術組與石杉堿甲組行脾切除術。術后1、3、7d進行水迷宮測試，術后7d取腦使用免疫組織化學法觀測海馬CA1區ChAT的表達。結果術后1d進行水迷宮測試，與對照組比較，麻醉組、手術組潛伏期和游泳距離均延長(P<0.05);術后3d，與對照組比較，手術組、石杉堿甲組潛伏期和游泳距離進一步延長，而石杉堿甲組與手術組比較,潛伏期和游泳距離均縮短(P<0.05);術后7d，手術組與對照組比較,潛伏期和游泳距離延長程度縮小。術后7d，與對照組、石杉堿甲組比較，手術組的平臺象限停滯時間百分比以及在平臺象限游泳距離占總游泳距離百分比均減小(P<0.05)。術后7d，手術組海馬CA1區ChAT陽性細胞數較對照組和石杉堿甲組增多(P<0.05)。結論老年大鼠脾切除術后早期可出現認知功能障礙(POCD)，海馬CA1區ChAT表達上調，預先給予石杉堿甲0.15mg/kg(連續3w)可以改善POCD模型大鼠學習記憶的功能。

關鍵詞：老年大鼠;術后認知功能障礙;膽堿乙酰轉移酶;海馬;石杉堿甲

術后認知功能障礙(POCD)現在臨床上廣泛關注，老年人由于機體退行性變導致術后早期POCD的發生率大大增加，但其發生機制不甚清楚。腦內膽堿能系統在高級動物的學習記憶中起著重要作用〔1〕，但在POCD發生機制中的作用并不清楚。我們選擇反應膽堿能神經的膽堿乙酰轉移酶(ChAT)作為觀察指標，旨在研究其與POCD發生發展的關系，探討POCD的發生機制。另一方面，目前對POCD預防和治療的有效性研究較少，為探討對POCD的治療策略，我們對脾切除術后大鼠POCD進行藥物干預研究。以往研究表明石杉堿甲(HuperzineA,HupA)具有很好的抗衰老和改善學習記憶功能作用〔2〕，本文從神經生理學和組織細胞學兩方面研究該藥對大鼠脾切除POCD的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑石杉堿甲(河南竹林眾生制藥公司)，氯胺酮(福建古田藥業公司),山羊抗ChAT多克隆抗體(Cemicon)。

1.2動物分組及模型制備20月齡雄性Wistar大鼠(甘肅中醫學院實驗動物中心提供)經篩選剔除體重過大或過輕及在水中不游動的，共選出動物32只，體重500～550g。按體重分級，隨機分成4組：對照組,麻醉組,手術組，石杉堿甲組(n=8)。其中石杉堿甲組給石杉堿甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水中，連續灌3w，對照組、麻醉組、手術組均按體重給與同容量的生理鹽水灌胃3w，3w后手術組和石杉堿甲組在氯胺酮腹腔注射(25mg/kg)麻醉下行脾切除手術;麻醉組僅給與氯胺酮麻醉，不行手術;對照組僅腹腔注射同容量的生理鹽水。

1.3學習、記憶功能的行為學測試通過Morris水迷宮測試,將圓池內壁和平臺漆成黑色，將其分為4個象限，平臺置于第4象限沒入水下約2cm，選擇一個象限的固定位置作為大鼠入水點，通過自動圖像拍攝系統記錄游泳軌跡，入水至找到平臺為潛伏期,其總行程為游泳距離〔3〕。術前學習5d，每天測試4次，取其平均值，術后1、3、7d分別進行測試，并于術后7d撤掉平臺，記錄60s內大鼠在每個象限的停滯時間和在每個象限游泳的距離。

1.4免疫組化染色

1.4.1灌注和切片大鼠行為學觀察結束后，氯胺酮(25mg/kg)腹腔麻醉動物，暴露心臟，以0.9%生理鹽水經升主動脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛(pH7.4)900ml，持續2h后取腦，將腦置于20%蔗糖的PBS溶液中浸置24～48h(4℃)，冰凍冠狀連續切片(厚度30μm)，海馬組織每5張取1張。

1.4.2免疫組化染色步驟切片置于0.3%Triton中浸30min，PBS液洗3次，每次15min;在稀釋濃度為1∶2000的山羊抗ChAT多克隆抗體中孵育72h(4℃);PBS液漂洗后在生物素標記二抗(1∶100)中,室溫下孵育1h;辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素(1∶100)中,室溫下孵育1h;二氨基聯苯氨(DAB)反應液中成色,室溫下10～20min;常規明膠裱片、脫水、DPX封片。為了計算ChAT細胞數目，采用標準網格的技術方法，在100倍的光鏡下做ChAT細胞計數，以“500×400μm”為單位，結果取3個視野的平均值。

1.5統計學方法計量資料以x±s表示，用SPSS12.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2結果

2.1水迷宮測試結果術后1d麻醉組、手術組的逃避潛伏期和游泳距離延長，與對照組相比均有統計學意義(P<0.05);術后3d僅手術組，石杉堿甲組與對照組比較有統計學意義(P<0.05)，且數值達高峰;術后7d手術組與對照組比較有差異(P<0.05),但差距已明顯縮小;術后石杉堿甲組與手術組比較均有差異(P<0.05)。石杉堿甲組術前的逃避潛伏期和游泳路程較對照組有明顯差異(P<0.05)，見表1。與對照組(26.5%)、麻醉組(26.3%)、石杉堿甲組(26.5%)比較，術后7d在60s內手術組(24.1%)的平臺象限停滯時間百分比減小(P<0.05)，與對照組(24.5%)、麻醉組(24.2%)、石杉堿甲組(24.7%)比較，術后7d在60s內手術組(22.8%)的平臺象限游泳距離占總游泳距離百分比減小(P<0.05)。這些結果說明脾切除術后大鼠在水迷宮測試中的空間認知能力受到損害，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認知減退，而石杉堿甲組減弱了脾切除術后大鼠在水迷宮測試中學習記憶能力的損害。表1各組大鼠的逃避潛伏時間、游泳路程1)與對照組比較，2)與手術組比較：P<0.05

2.2免疫組織化學結果術后7d水迷宮測試后，海馬CA1區ChAT免疫反應陽性神經元在對照組、手術組和石杉堿甲組的表達率分別是(68.17±3.02)、(80.15±2.18)和(70.31±2.56)，手術組海馬CA1區ChAT陽性細胞數較對照組、麻醉組(69.04±2.37)和石杉堿甲組都增多(P<0.05),而對照組、麻醉組和石杉堿甲組的ChAT陽性細胞數相當，見圖1。

3討論

Moller對1218例60歲以上的老年患者進行了POCD的調查研究〔4〕，發現25.8%的患者在術后1w出現了POCD，術后3個月9.9%的患者出現POCD，而相近年齡對照組患者的發生率分別為3.4%和2.8%，POCD對大多數患者來說是可逆的，但仍有少數患者存在長期甚至永久的認知功能障礙〔5〕。

脾切除手術對大鼠的機體影響較小，術后大鼠可以如期進行水迷宮測試。術前水迷宮測試成績石杉堿甲組明顯好于其他組，說明石杉堿甲可以改善大鼠的認知功能，與以往的文獻報道相符〔4〕。術后1d，麻醉組、手術組空間記憶力低于對照組，石杉堿甲組不低于對照組，但呈下降趨勢,表明手術組學習記憶功能下降;術后3d，麻醉組記憶力恢復，手術組、石杉堿甲組進一步減退，石杉堿甲組也低于對照組，但石杉堿甲組與手術組有統計學差異，提示石杉堿甲具有改善POCD模型大鼠學習記憶的功能;術后7d，僅手術組與對照組的差異明顯縮小,提示老年大鼠的學習記憶能力正在恢復。麻醉組單純應用氯胺酮，記憶力僅術后一天較低，以后恢復。文獻報道反復應用小劑量氯胺酮可引起認知功能障礙〔5〕，單次使用可能僅引起極短期的認知減退。

研究表明中樞膽堿能神經系統在學習和記憶功能中起主要作用，分布于海馬結構中的膽堿能纖維與學習和記憶密切相關〔6〕，許多年齡相關的認知障礙都有海馬膽堿能系統活力下降,ChAT是中樞神經系統合成Ach過程中重要的酶,研究中采用免疫組化技術觀測了海馬CA1區ChAT的變化,結果發現POCD模型大鼠海馬CA1區ChAT陽性細胞數目增多,而研究表明海馬ChAT陽性神經元減少與大鼠癡呆發生密切相關〔7〕。造成此結果有兩種可能因素，一是由于機體為防止輕度認知功能障礙加重并轉化為永久性癡呆而導致海馬CA1區ChAT活性上調〔8〕。另一種因素，可能是POCD大鼠的膽堿能神經進行了代償性機能上調，但這種變化與認知功能的具體關系機制還有待進一步研究。

石杉堿甲生物堿是從蛇足石杉中分離得到的一種新生物堿,是一種高效可逆的膽堿酯酶抑制劑,其改善、促進學習、記憶過程的作用已有定論〔2〕。研究〔9〕表明，石杉堿甲對成年、老年嚙齒類動物及老年猴有促智作用，石杉堿甲改善學習、記憶的作用呈典型的鐘形量效關系，劑量過大則損害記憶功能。給予石杉堿甲0.01～0.50mg·kg-1·d-1，均能明顯增強實驗動物的學習、記憶功能。因此選擇石杉堿甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1,為確保療效連續用藥3w〔10〕。超級秘書網

乙酰膽堿是腦內廣泛分布的重要神經遞質，主要參與記憶與認知功能。老年大鼠的皮層膽堿能神經網絡密度降低，在非病理性老化中都不同程度存在腦中乙酰膽堿生成和釋放的減少，因此全麻手術后早期譫妄好發于老年大鼠。本實驗結果提示石杉堿甲的干預穩定了海馬膽堿能系統，改善了POCD模型大鼠的學習記憶的功能。

綜上所述，老年大鼠脾切除手術后早期可發生認知功能障礙，并在術后3d左右達高峰，以后逐漸恢復，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認知減退，預先給予石杉堿甲能夠減輕大鼠學習記憶能力的損害。

【參考文獻】

1SchmidtRH，ScholtenKJ，〔J〕.Neurotrauma，1999;16:113947.

2TangXC.HuperzineA(shuangyiping);apromisingdrugforAlzheimer′disease〔J〕.ActaPharmacologicaSinica，1996;17(6):481.

3胡鏡清，溫澤淮，賴世隆.Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學初探〔J〕.廣州中醫藥大學學報,2000;17:1179.