淺談痘病毒克隆技術(shù)的研究

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1材料與方法

下游引物P，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。L基因的克隆與鑒定以綿羊痘病毒基因組DNA為模板，采用50μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化的PCR產(chǎn)物與mple克隆載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序。綿羊痘病毒E3蛋白的生物信息學(xué)分析將測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)ORFfinder程序推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，并應(yīng)用Weblab服務(wù)器中法對(duì)SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)柔性區(qū)域分析分別使用軟件的法和法進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白中氨基末端和羧基末端2個(gè)功能域的三級(jí)結(jié)構(gòu)使用SWI服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)。重組載體的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化E3L重組載體和表達(dá)載體pGEX4T－1分別用酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。毒株綿羊痘病毒古浪株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子免疫與環(huán)境控制課題組分離、鑒定和保存。主要試劑TaqDNA聚合酶、載體、大腸桿菌菌株連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；pGEX4T－1表達(dá)載體表達(dá)菌、GST結(jié)合樹脂和硝酸纖維素膜購(gòu)自公司；氨芐青霉素、IPTG、弗氏佐劑和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自公司；化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自公司；X光底片、顯影及定影液均購(gòu)自柯達(dá)公司；其他試劑均為進(jìn)口分析純。引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄號(hào)為的基因組序列，利用軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為534bp。上游引物P，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序。將鑒定正確的重組載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞，37℃振蕩培養(yǎng)至?xí)r，加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導(dǎo)培養(yǎng)離心10min收集菌體，處理后進(jìn)行檢測(cè)。用裂解緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（超聲5s，停8s）至溶液澄清，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE，分析重組蛋白SPPVE3的可溶性。重組蛋白使用Novagen公司的GST結(jié)合樹脂進(jìn)行純化。重組蛋白鼠抗血清的制備及分析選取周齡的BALB／c小鼠進(jìn)行免疫：初次免疫時(shí)，用純化后的重組蛋白SPPVE3與等量弗氏完全佐劑混合，經(jīng)乳化后皮下多點(diǎn)注射；第14天，用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，乳化后加強(qiáng)免疫。二免后第14天采血，分離血清，用純化的重組蛋白SPPVE3包被ELISA板，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定血清效價(jià)。

2SPPVE3L基因的序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)經(jīng)測(cè)序分析

SPPVE3L基因全長(zhǎng)534bp，編碼177位氨基酸，分子質(zhì)量約為。使用法分析，基因與VVE3L基因的核苷酸序列具有50．8％的一致性，在氨基酸水平上具有34．9％的一致性（50．0％的相似性。從功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列與E3蛋白ZDBD相比具有28．2％的一致性（47．4％的相似性），而羧基末端與DRBD相比具有41．9％的一致性（52．7％的相似性）使用法預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)α－螺旋主要存在于位氨基酸；β－折疊主要分布于位氨基酸；利用法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)柔性，結(jié)果表明較大的柔性區(qū)域分布于位氨基酸。根蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器，對(duì)SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2個(gè)潛在的功能結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模。構(gòu)建的氨基酸區(qū)域分別為3～71和102～173位氨基酸，參考模板分別為E3蛋白的Z－DNA結(jié)合域和PKR的dsRNA結(jié)合域。序列一致性分別為40．58％和26．027％，E值分別為E－21和1．8E－16，表明模型構(gòu)建可靠。重組質(zhì)粒的鑒定及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化經(jīng)酶切鑒定（見圖6）及測(cè)序鑒定，表明E3L重組載體構(gòu)建正確。含有重組載體的BL21（DE3）pLysS重組菌在濃度為1mmol／L條件下誘導(dǎo)4h后，經(jīng)E電泳分析，顯示在46ku處表達(dá)出一條明顯的條帶，分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。經(jīng)可溶性分析，表明重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體中，經(jīng)GST結(jié)合瓊脂可純化出目的條帶重組蛋白SPPVE3鼠抗血清的制備分析用綿羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和制備的鼠抗血清對(duì)SPPVE3蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示所制備的鼠抗血清可以與重組蛋白發(fā)生反應(yīng)。對(duì)制備的重組蛋白SPPVE3鼠抗血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，其效價(jià)為。

3討論

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子，主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD兩個(gè)關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域組成。其中，E3蛋白的羧基末端能夠通過其dsRNA結(jié)合域阻斷病毒復(fù)制周期中產(chǎn)生的dsRNA，抑制了Toll樣受體、人視黃酸誘導(dǎo)基因／RIG樣受體以及細(xì)胞內(nèi)PKR和OAS等各類抗病毒信號(hào)通路和抗病毒分子的活性，病毒得以正常復(fù)制。目前，除了VV外，E3蛋白的同源蛋白在羊口瘡病毒（ORFV）中已進(jìn)行了較為深入的研究，結(jié)果顯示在體外細(xì)胞試驗(yàn)中，ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后構(gòu)建的重組病毒VV／ORFVE3與野生型VV致病性并無(wú)明顯差別，但在動(dòng)物試驗(yàn)中，的致病性顯著降低。等報(bào)道SPPV基因組的第34號(hào)開放閱讀框編碼VVE3蛋白的同源蛋白，表明SPPV可能編碼類似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染綿羊全身皮膚（特別是身體無(wú)毛部分）出現(xiàn)典型的痘瘡，造成家畜產(chǎn)奶量下降、體重減輕、流產(chǎn)率增加以及對(duì)肺炎和皮毛蠅蛆病的易感性增加，同時(shí)也會(huì)造成直接死亡。本試驗(yàn)中，筆者以綿羊痘病毒甘肅古浪株為模板克隆出綿羊痘病毒E3L同源基因，基因全長(zhǎng)534bp，編碼177個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列比對(duì)，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白核苷酸序列的一致性達(dá)到50．8％，而氨基酸序列一致性為34．9％（相似性為50．0％）。從功能結(jié)構(gòu)域角度分析，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28．2％（相似性為47．4％）；而DRBD一致性雖然高達(dá)41．9％（相似性為52．7％），但在決定dsRNA結(jié)合活性的和A174氨基酸殘基中，第174位氨基酸殘基中A→S的突變可能使其dsRNA結(jié)合活性大大降低，推測(cè)SPPVE3蛋白對(duì)干擾素的抑制效應(yīng)將會(huì)減弱。在本研究中，以pGEX4T－1為載體，表達(dá)出大小為46ku左右的重組蛋白。利用純化后的重組蛋白免疫BALB／c小鼠獲得鼠抗血清，經(jīng)間接ELISA測(cè)定效價(jià)為。利用制備的抗體能夠分析SPPV在感染細(xì)胞后E3蛋白的表達(dá)情況以及對(duì)PKR等抗病毒分子的影響，為闡明羊痘病毒的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

作者：于少雄顏新敏吳國(guó)華趙志荀單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院