發酵乳食品乙醛等的形成與調控

前言：本站為你精心整理了發酵乳食品乙醛等的形成與調控范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

本文作者：丹彤包秋華孟和畢力格王俊國張和平作者單位：內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室

乳酸細菌廣泛分布于自然界中，是一類利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌通稱。傳統發酵乳食品中分離的乳酸菌一般被認為是安全的細菌，早在人們認識乳酸菌之前，就已將其廣泛應用于發酵酸乳、制作奶酪、食品防腐、保藏等方面。這些乳酸菌在酸奶發酵過程中產生多種代謝產物，包括乳酸、胞外多糖、風味物質以及人體營養所必需的多種維生素等。這些菌體及其代謝產物具有改善乳制品的風味，提高制品營養價值，調節腸道菌群平衡，維持和保證腸道菌群最佳優勢組合及穩定性，抑制腫瘤和免疫賦活等生理功能[1]。酸奶是以新鮮的牛奶為原料，經過2種或2種以上的乳酸菌發酵制成的產品。目前，主要應用于酸奶制造的乳酸菌發酵劑有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。這2種發酵劑在酸奶發酵過程中相互作用，產生的代謝產物賦予發酵乳特有的風味、質地、口感和營養價値。發酵乳中風味物質的成分及含量受諸多因素的影響，其風味物質的形成主要受原料中成分、加工過程中條件變化及發酵劑種類的影響。為了提高乳酸菌在發酵過程中生產主要風味物質乙醛、雙乙酰的能力，國內外一些學者對乳酸菌合成乙醛、雙乙酰的代謝途徑及其代謝調控方式開展了大量的研究工作。這篇綜述主要描述了乳酸菌在酸奶發酵過程中產生的風味物質，以及主要風味物質乙醛、雙乙酰的代謝途徑和其調控機制。

1酸奶發酵劑生產的風味物質

乳酸菌在碳水化合物的代謝過程中能生產乙醛、丙酮、乙偶姻、雙乙酰等多種揮發性芳香化合物[2]。這些風味物質主要由揮發性、非揮發性酸以及羰基化合物組成，其中，羰基化合物對發酵乳的風味有顯著影響。在單一乳酸菌發酵的發酵乳中，主要羰基化合物的含量為乙醛(2.0~41.0μg/mL)、雙乙酰(0.2~2.3μg/mL)、乙偶姻(2.2~28.2μg/mL)、乙醇(0.2~9.9μg/mL)以及丙酮(1.8~3.4μg/mL)[2]。這些羰基化合物在發酵乳中的含量和種類決定著產品的風味。在酸奶的發酵過程中乳酸菌生產的風味物質種類繁多，除上述風味物質之外，還有很多生產量很低的芳香化合物。這些芳香化合物因為嗅覺閾值的差異，很難評價它們在形成酸奶風味中的作用。Ott等[3]在酸奶中首次發現了有強烈氣味的1-辛烯-3-酮、1-壬烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基四氫噻吩-3-酮、2E-壬烯醛以及愈瘡木酚等6種化合物。在這項研究中，作者首次使用光譜分析法鑒定了1-壬烯-3-酮。1-壬烯-3-酮在酸奶中的含量很低，但由于1-壬烯-3-酮在酸乳中很低的香氣閾值并不影響該化合物在形成酸奶風味中的作用。乙醛是乳酸菌在酸奶發酵過程中產生的特征風味物質，在酸奶中的含量要遠遠高于其他揮發性芳香化合物。目前，國內生產的酸奶主要是以乙醛風味為主的醛香性酸奶。在形成發酵乳制品的滋味與香味的風味物質中，雙乙酰(又名丁二酮)也被認為是起關鍵作用的重要芳香化合物之一，是奶油、干酪、奶酪、酸奶以及很多需要奶油味的非乳產品中的一種重要風味物質。一般認為，酸奶中主要風味物質乙醛由保加利亞乳桿菌發酵產生，雙乙酰由嗜熱鏈球菌發酵產生[4]。當酸奶中乙醛含量低時，雙乙酰在發酵乳中占主導地位，形成具有獨特奶香味的發酵乳[5]。Rysstad等[6]發現在山羊乳酸奶中乙醛含量明顯低于普通酸奶，而雙乙酰的含量和普通酸奶中的雙乙酰的含量基本相同，說明在山羊乳酸奶的風味物質中，雙乙酰是起關鍵作用的重要芳香化合物。目前，關于酸奶風味物質的代謝調控研究主要集中在乙醛、雙乙酰等主要的風味物質上。

2乙醛的合成途徑及其基因調控

發酵乳中乙醛的含量是評價酸奶質量的重要指標之一。早在1950年Pette等[7]就提出了乙醛是形成酸奶風味物質的主要成分。Hamdan等[8]也得出了類似結論，指出高濃度的乙醛是形成酸奶良好風味的重要前提。Sandine等[9]報道了在發酵乳中乙醛的濃度只有高于8mg/L時，才能產生具有良好風味的發酵乳。發酵劑菌株的質量和活力對酸奶質量及酸奶中風味物質的含量起著關鍵性的作用。利用基因工程和代謝工程技術改良現有的發酵劑菌株，構建高產乙醛的菌株，是國內外研究學者關注的焦點之一。

2.1乙醛的合成途徑

在乳酸菌生產乳酸的發酵過程中，乙醛可由氨基酸、核酸及丙酮酸代謝產生(圖1)。在乳酸菌的碳代謝過程中，丙酮酸是重要的代謝中間產物。乳糖經糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(PDC)的催化作用下合成乙醛。丙酮酸還可在甲酸裂解酶(PFI)和丙酮酸脫氫酶(PDH)的催化作用下，轉化成乙酰輔酶A，生成的乙酰輔酶A在乙醛脫氫酶(ADH)的催化作用下，生成乙醛。在酸奶發酵過程中乳酸菌生產乙醛的代謝途徑和菌體自身的酶有關。例如丙酮酸脫羧酶多發現于釀酒酵母和運動發酵單胞菌中，在酸奶發酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中幾乎沒有關于丙酮酸脫羧酶的報道。Raya等[10]在2株保加利亞乳桿菌和2株嗜熱鏈球菌中，都沒有檢測出丙酮酸脫羧酶活性。說明在酸奶發酵過程中，丙酮酸生成乙醛或丙酮酸經由乙酰輔酶A生成乙醛的代謝途徑可能不存在。脫氧核糖5-磷酸在脫氧核糖醛縮酶(DERA)的催化作用下生成乙醛和3-磷酸甘油醛，并且這個催化過程是可逆的。很多菌種都有關于具有脫氧核糖醛縮酶的報道。Kim等[11]對來源于類芽孢桿菌的脫氧核糖醛縮酶做了詳細研究。該酶和來源于地芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的脫氧核糖醛縮酶有很高的同源性。酶學性質測定的結果表明，當培養基中乙醛濃度為100mmol/L時，脫氧核糖5-磷酸的產量達到最高，說明脫氧核糖醛縮酶能催化脫氧核糖5-磷酸和乙醛之間的轉化。Raya等[10]也報道了在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發酵過程中檢測出明顯的脫氧核糖醛縮酶活性，說明在酸奶發酵過程中，脫氧核糖5-磷酸生成乙醛的代謝途徑可能存在。在酸奶發酵過程中有些氨基酸先轉化成中間體代謝產物丙酮酸然后合成乙醛，但也有些氨基酸如蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶(TA)酶的催化作用下可直接降解生成乙醛。其中，蘇氨酸生成乙醛被認為是乳酸菌生產乙醛的主要代謝途徑。蘇氨酸醛縮酶廣泛存在于自然界生物體內，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中均有關于具有蘇氨酸醛縮酶活性的報道。國內外一些研究學者把研究乙醛代謝途徑的焦點集中在蘇氨酸醛縮酶上，對蘇氨酸醛縮酶的調控做了大量的研究工作。在乙醛的代謝途徑中，乙醛在乙醛還原酶(ALDH)催化作用下生成乙醇，降低酸奶中乙醛的含量。Koo等[12]對腸膜明串珠菌的乙醛還原酶和乙醛脫氫酶做了詳細的研究。認為在腸膜明串珠菌中，乙醛還原酶和乙醛脫氫酶醛是一個多功能酶(醛醇脫氫酶，ADHE)，編碼醛醇脫氫酶的adhE基因全長2685bp，編碼886個氨基酸，序列分析的結果表明該酶的氨基酸序列和其他已發表的氨基酸序列有很高的相似性。在推導出的醛醇脫氫酶氨基酸序列上發現2個保守區域，分別編碼乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛還原酶(ALDH)。Koo等[12]還將adhE基因克隆到表達質粒中，然后轉入到EscherichiacoliBL21，構建了醛醇脫氫酶基因工程菌。酶活檢測結果表明，醛醇脫氫酶具有乙醇脫氫酶和乙醛還原酶的活性。在其他乳酸菌中也有很多關于乙醛還原酶和乙醛脫氫酶活性的報道。Raya等[10]在2株保加利亞乳桿菌和2株嗜熱鏈球菌的發酵過程中都沒有發現明顯的乙醛脫氫酶活性，但從其他2株嗜熱鏈球菌中卻檢測出明顯的乙醛還原酶活性。說明在一些嗜熱鏈球菌中，生產的乙醛有可能作為中間產物在乙醛還原酶的催化作用下被還原成乙醇，從而降低發酵乳中風味物質的含量。

2.2乙醛的基因調控

蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶的催化作用下生成乙醛的代謝通路被認為是乳酸菌生成乙醛的主要代謝途徑，受到國內外一些研究學者的廣泛關注。Chaves等[13]報道了在嗜熱鏈球菌中，具有蘇氨酸醛縮酶活性的絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)能催化蘇氨酸和甘氨酸、乙醛之間的相互轉化。Chaves等在培養基中補充適量的L-蘇氨酸，發酵后乙醛的含量明顯增加，說明在這項研究中使用的嗜熱鏈球菌具有蘇氨酸醛縮酶的活性，在發酵過程中能過分解過量的L-蘇氨酸生成乙醛。在這項研究中作者還構建了編碼SHMT的glyA基因缺陷菌株，發現glyA基因缺陷菌株在酸奶發酵過程中乙醛生成量明顯低于野生菌株，說明蘇氨酸生成乙醛的代謝途徑是乳酸菌生產乙醛的主要代謝途徑。蘇氨酸醛縮酶的活性很不穩定，容易受外界條件的影響。Lees等[14]報道了當培養溫度從30℃上升到37℃或42℃時，嗜熱鏈球菌蘇氨酸醛縮酶的活力明顯下降，而保加利亞乳桿菌蘇氨酸醛縮酶具有耐熱性，在42℃的培養條件下，依然能保持很高的活力。酸奶的發酵一般是在43℃培養溫度下進行，在這個培養溫度下，保加利亞乳桿菌蘇氨酸醛縮酶的活力要高于嗜熱鏈球菌蘇氨酸醛縮酶的活力，一般認為酸奶發酵過程中生產的乙醛主要來源于保加利亞乳桿菌。在乙醛代謝途徑中，還有一些關鍵酶在乙醛代謝過程中起著調控作用。Bongers等[15]在乳酸乳球菌中成功地表達了來源于運動發酵單胞菌中的pdc基因(編碼丙酮酸脫羧酶)和來源于乳酸乳球菌的nox基因(編碼NADH氧化酶)，大幅度提高了發酵乳中乙醛的產量。目前，對乙醛基因工程方面的研究主要集中在glyA、pdc、nox等幾個主要基因的調控上。在一些乳制品中，在發酵過程中產生的乙醛容易被乙醛還原酶還原成乙醇，降低了乳制品中乙醛的含量。因此，利用現代生物技術改變乳酸菌中乙醛的代謝通路，在篩選、構建乙醛還原酶缺陷型菌株的基礎上，過量表達一些關鍵基因，可以提高乳制品中乙醛的產量。當然，這些嘗試也為酸奶、奶酪等乳制品的開發提供廣闊前景。

3雙乙酰的合成途徑及其基因調控

雙乙酰作為酸奶中主要風味物質，在形成酸奶風味中起著重要作用。雙乙酰一般由嗜溫乳酸球菌生產，包括乳酸乳球菌丁二酮亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、鏈球菌和熱鏈球菌等[4]。但也有學者認為在酸奶發酵過程中保加利亞乳桿菌是生產雙乙酰的主要菌株[8]。目前，關于乳酸菌風味物質雙乙酰的研究工作大多集中于雙乙酰的合成途徑及其產量調控上。

3.1雙乙酰的合成途徑

在乳酸菌中生成雙乙酰的代謝途徑主要有檸檬酸代謝途徑和糖酵解代謝途經。一些乳酸菌特別是乳球菌能利用乳糖、檸檬酸生成丙酮酸，再合成雙乙酰(圖1)。在乳糖合成雙乙酰的代謝途徑中，過量的丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶(α-ALS)的作用下合成α-乙酰乳酸乳酸。α-乙酰乳酸在酸性條件下，化學氧化脫羧生成雙乙酰。雙乙酰很不穩定，在雙乙酰還原酶(AR)的催化作用被還原為乙偶姻。在檸檬酸生成雙乙酰的代謝途徑中，丙酮酸和α-乙酰乳酸是重要的中間產物。檸檬酸在檸檬酸裂解酶的催化作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸可直接生成α-乙酰乳酸，也可通過脫羧反應生成丙酮酸。丙酮酸進一步脫羧生成活性乙醛(乙醛-TPP)，活性乙醛與丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶作用下合成α-乙酰乳酸,通過化學氧化脫羧作用生成雙乙酰。α-乙酰乳酸也可在α-乙酰乳酸脫羧酶(α-ALDC)的作用下脫羧生成乙偶姻。由于牛奶中檸檬酸的含量很低，一般認為發酵乳中的雙乙酰主要通過糖酵解代謝途徑生成。

3.2雙乙酰的基因調控

在酸奶發酵過程中雙乙酰產量和幾個關鍵酶的活力密切相關，這些酶包括：檸檬酸裂解酶(ACLY)、草酰乙酸脫羧酶(OXAD)、α-乙酰合成酶、NADH氧化酶(NOX)、α-乙酰乳酸脫羧酶、雙乙酰還原酶等。運用分子生物學技術使這些酶失活或超量表達，能增加中間產物丙酮酸、α-乙酰乳酸的積累，能改變雙乙酰代謝途徑，提高雙乙酰的產量。其中，國內外一些學者為了改變α-乙酰乳酸流向乙偶姻的代謝通路，把研究的重點集中在篩選、構建一些α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株上。Aymes等[16]用隨機誘變的方法篩選出α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的乳酸乳球菌丁二酮亞種菌株，在厭氧條件下，雙乙酰的產量要遠遠高于野生菌株雙乙酰的產量。Monnet等[17]為提高嗜熱鏈球菌雙乙酰的產量，在添加α-酮基丁酸、亮氨酸或α-酮基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸的培養基上，用定向突變方法挑選出α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的嗜熱鏈球菌。在微氧條件下，α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株雙乙酰的產量比野生菌株提高了近3倍。一些研究學者在篩選、構建α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株的基礎上，還對上述的一些調控雙乙酰生產的關鍵基因進行超量表達，運用聯合調控等方法對提高雙乙酰的產量進行了嘗試。Hugenholtz等[18]在α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的乳酸乳球菌中，在有氧條件下超量表達調控NADH氧化酶的nox基因，大幅度提高了雙乙酰的產量。目前關于雙乙酰的基因調控的研究大多集中在糖酵解、檸檬酸代謝途徑的一些關鍵基因的調控上，隨著這些研究的深入應該能生產出更多符合消費者需求的新產品。

4存在的問題及展望

在酸奶生產過程中，發酵劑的作用非常重要，是酸奶產品產酸和產香的基礎和原因。酸奶質量的好壞主要取決于酸奶發酵劑的品質類型及活力[19]。通常使用的酸奶發酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在代謝過程中能維持良好的共生關系，使酸奶獲得良好的風味。但兩個菌種的許多菌株也存在著不同程度的拮抗作用，在代謝過程中會產生有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素等生長抑制因子，影響發酵劑的平衡生長，導致嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌間表現出非協同生長的現象，影響酸奶的風味質量。酸奶的風味不僅受發酵劑種類的影響，還受接種量、培養條件以及風味物質的種類、含量和比例的等多各種因素的影響[20]。雖然酸奶中發酵劑仍存在一些問題，但隨著人們對乳酸菌風味物質代謝途徑的深入了解及分子生物技術的發展，利用基因工程手段改良現有的發酵菌種和挖掘新的發酵菌種，選育出能適合工業化生產的優良發酵劑菌株，不斷提高酸奶的風味質量，促進乳制品工業的發展。