淺談糖尿病的并發(fā)癥研究性論文
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【摘要】目的觀察δ-連環(huán)素在大鼠糖尿病模型海馬神經(jīng)元中的表達(dá)特征。方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將大鼠隨機(jī)分成糖尿病組、正常對(duì)照組和緩沖劑組。按45mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(溶于0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液)誘發(fā)糖尿病,緩沖劑組只給予等量的緩沖液。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)δ-連環(huán)素在各組中的定量表達(dá)。結(jié)果糖尿病組大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組和緩沖劑組，在海馬齒狀回減少尤為明顯。結(jié)論糖尿病可下調(diào)大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】δ-連環(huán)素;糖尿病;海馬;大鼠;免疫組織化學(xué)
糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，可引起認(rèn)知功能障礙及大腦的神經(jīng)生理和結(jié)構(gòu)改變[1-2]。海馬是與腦高級(jí)功能相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，在糖尿病患者中易受到損害，表現(xiàn)為更易發(fā)生中風(fēng)、癡呆和認(rèn)知減退[3]。
δ-連環(huán)素屬于P120-catenin蛋白家族，特異性地表達(dá)在神經(jīng)元[4]。研究發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素過表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞形成樹突狀突起，并增加原代海馬細(xì)胞中樹突的形成[5]。已有報(bào)道δ-連環(huán)素基因變異小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的學(xué)習(xí)障礙、突觸可塑性降低和突觸成分的改變。糖尿病患者認(rèn)知功能減退的機(jī)制至今不明，在糖尿病動(dòng)物海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達(dá)變化也鮮有報(bào)道。
1材料和方法
1.1動(dòng)物分組及模型制備SD雄性大鼠，體重260～300g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成正常對(duì)照組、緩沖劑組和糖尿病組(n=9)。按文獻(xiàn)[6]方法，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素45mg/kg(溶于0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液),緩沖劑組只給予等量的緩沖液。3天后測(cè)血糖，血糖>16.7mmol/L,飲水及尿量明顯增多為造模成功。造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)60天，中間不進(jìn)行胰島素干預(yù)，也不進(jìn)行糖尿病飲食控制，造模后每周監(jiān)測(cè)血糖。每組取9只大鼠5%茂巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟先灌注100ml的生理鹽水后灌注4%多聚甲醛〔0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.3配制〕固定30min。動(dòng)物靜置于4℃冰箱3h后取大腦，用上述固定液后固定約6h(4℃)。并修取含海馬腦段，經(jīng)20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片機(jī)切片，片厚20μm。每個(gè)動(dòng)物均依次等距離間隔選取切片,貼片。
1.2血糖測(cè)定造模3天和取材前內(nèi)眥靜脈取血測(cè)血糖,血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法血糖試劑盒。
1.3SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)切片經(jīng)：①300mg/LH2O220min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封閉，37℃30min;③δ-連環(huán)素1∶200，4℃18h后，室溫孵育6h;④生物素標(biāo)記IgG1∶300，室溫孵育2h;⑤SABC復(fù)合物1∶300，室溫孵育1h;⑥3mg/LH2O2和5mg/LDAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)陽性顆粒后終止反應(yīng)。反應(yīng)步驟③～⑥過程中，每步后均用0.01mol/LPBS，pH7.3漂洗3次，每次10min。切片經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。
1.4海馬齒狀回DG區(qū)δ-連環(huán)素陽性反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測(cè)定分析每只動(dòng)物各取進(jìn)行過SABC反應(yīng)的不相鄰切片6張(間隔20μm)。400倍的高倍鏡下，在海馬DG區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image-ProPlus5.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組δ-連環(huán)素反應(yīng)陽性的細(xì)胞進(jìn)行吸光度的半定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果用SPSS12.0分析。各組之間差異用單因素方差分析檢驗(yàn)。再用Student-Newman-Keuls進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果用±s表示。P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
2結(jié)果
2.1大鼠海馬區(qū)δ-連環(huán)素的表達(dá)結(jié)果顯示δ-連環(huán)素免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，在海馬各亞區(qū)的神經(jīng)元胞質(zhì)和胞膜中均有表達(dá)。顯微鏡下觀察到，正常對(duì)照組(圖1B，E)和緩沖劑組(圖1C、F)大鼠海馬神經(jīng)元中的δ-連環(huán)素免疫反應(yīng)的陽性顆粒色深密集，均明顯高于糖尿病組(圖1A、1D)。在海馬齒狀回(DG區(qū))δ-連環(huán)素主要表達(dá)于顆粒層和顆粒下層，少量表達(dá)于門區(qū)。大鼠海馬齒狀回δ-連環(huán)素的表達(dá)在糖尿病組減少更加明顯。正常對(duì)照組和緩沖劑組間大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的免疫反應(yīng)差異不明顯。
圖1δ-連環(huán)素catenin在各組大鼠海馬神經(jīng)元中表達(dá)
其中A(×40)和D(×400)為糖尿病組，B(×40)和E(×400)為正常對(duì)照組，C(×40)和F(×400)為緩沖劑組
2.2海馬齒狀回(DG)δ-連環(huán)素陽性反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測(cè)定分析正常組和緩沖劑組海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素吸光度(absorbance)(A)無明顯差異，但分別高于糖尿病組304%和291%，其差別具有顯著性意義。見表1。表1各組大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達(dá)的定量分析結(jié)果3討論
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素在糖尿病組海馬神經(jīng)元中的表達(dá)低于正常對(duì)照組和緩沖劑組，提示大鼠糖尿病的神經(jīng)性損害對(duì)海馬神經(jīng)元δ-連環(huán)素的表達(dá)產(chǎn)生了下調(diào)作用。超級(jí)秘書網(wǎng)
文獻(xiàn)報(bào)道在糖尿病小鼠大腦中海馬神經(jīng)元的發(fā)生不足，數(shù)量降低。DG區(qū)海馬神經(jīng)元的發(fā)生可能與一定的記憶相關(guān)[7]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠海馬各亞區(qū)神經(jīng)元變大腫脹，空泡樣變，胞膜破損，及δ-連環(huán)素在DG區(qū)表達(dá)明顯減少，表明δ-連環(huán)素表達(dá)的減少在糖尿病大鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶功能減退方面可能發(fā)揮一定作用。
δ-連環(huán)素參與鈣黏連蛋白-連環(huán)素復(fù)合體的構(gòu)成，在突觸后膜與包括PSD95在內(nèi)的PSD蛋白組分相互作用，并且在C末端包含1個(gè)PZD結(jié)合序列[8]。信號(hào)復(fù)合體(signalosome)是近年發(fā)現(xiàn)的激素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)的一種組合模式。已有文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素與PSD95對(duì)神經(jīng)元突起和突觸的結(jié)構(gòu)調(diào)控，正是通過信號(hào)復(fù)合體的模式進(jìn)行的[9]，在這一過程中，雌激素與PSD95形成signalosome。當(dāng)雌激素與PSD95形成signalosome后能夠?qū)ι窠?jīng)元突起和樹突棘生長產(chǎn)生調(diào)控作用。推測(cè)由糖尿病胰島素降低而產(chǎn)生上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能也是通過這種方式。另外在突觸后膜δ-連環(huán)素也可能通過PZD結(jié)構(gòu)域在不同的亞細(xì)胞區(qū)域與其他的蛋白相互作用[8，10]，而胰島素的降低可能促進(jìn)了δ-連環(huán)素與其他的蛋白的相互作用，從而改變突觸塑型，進(jìn)而引起認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶功能減退。關(guān)于δ-連環(huán)素在糖尿病神經(jīng)損傷過程中的分子生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。
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