發(fā)酵法制備葡聚糖菌種培養(yǎng)

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右旋糖酐(Dextran)又名葡聚糖，是若干葡萄糖脫水形成的聚合物，它作為血容量補(bǔ)充藥已廣泛用于醫(yī)療臨床，不同分子量的右旋糖酐具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等活性[1]。右旋糖酐的制備方法有發(fā)酵法和酶法。右旋糖酐的產(chǎn)生菌株一般為腸膜明串珠菌[2]。代表性菌株是美國(guó)NRRL研究所分離的腸膜明串珠菌NRRLB-512F，該菌株已經(jīng)被工業(yè)化應(yīng)用。國(guó)內(nèi)右旋糖酐的制備多使用腸膜明串珠菌[3-5]。本文選用購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的腸膜明串珠菌20074，以培養(yǎng)液濁度和pH值作為考察指標(biāo)，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與材料

UV-4802H雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司。腸膜明串珠菌：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，CICC編號(hào)為20074?；A(chǔ)培養(yǎng)基組成：蔗糖13%(13g/100mL，下同)、蛋白胨0.2%、磷酸氫二鈉0.14%、磷酸二氫鉀0.03%。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制液體培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基組成稱量藥品，加水加熱煮沸溶解，冷卻到室溫之后定容，調(diào)節(jié)pH到指定值，將培養(yǎng)基分裝到錐形瓶和試管中，塞好棉塞，用牛皮紙包扎，0.1MPa壓力下滅菌20min，然后自然冷卻。固體培養(yǎng)基：在滅菌之前的液體培養(yǎng)基中加入1.5%~2%的瓊脂，煮沸溶解，分裝之后，塞好棉塞，用牛皮紙包扎，0.1MPa壓力下滅菌20min，然后自然冷卻。

1.2.2菌種活化及保存將安锫管在75%的酒精中浸泡30min，在酒精燈上方烘烤然后滴少許無(wú)菌水在瓶口，用鑷子輕輕從瓶口裂痕處敲開，加入0.4mL無(wú)菌水，搖動(dòng)至呈乳濁液，用接種環(huán)接種于斜面和平板培養(yǎng)基上，在指定溫度下恒溫活化3d。活化后選擇平板或者斜面上面生長(zhǎng)較好的菌落，接種于液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)1~2d，即可使用。以上均為無(wú)菌操作。菌種保存：活化后液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~3d的培養(yǎng)液分別接種于斜面上，指定溫度下培養(yǎng)48h，4℃冰箱中保存。菌種保存在斜面上，每1個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。首先由斜面轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10h，接種到斜面上，培養(yǎng)48h，放入冰箱，4℃保存。

1.2.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分含量?jī)?yōu)化分別改變培養(yǎng)基中的蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4和KH2PO44種基礎(chǔ)組分的含量，接種量5%，在28℃、100r/min時(shí)恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h，以起始培養(yǎng)基為空白在λ=450nm時(shí)測(cè)定濁度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。各個(gè)組分含量的變化如表1所示。

1.2.4培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮源的選擇在培養(yǎng)基中加入不同種類和含量的無(wú)機(jī)氮源，培養(yǎng)條件同1.2.3，以起始培養(yǎng)基為空白在λ=450nm時(shí)測(cè)定濁度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。無(wú)機(jī)氮源的種類和含量的變化見(jiàn)表2。

1.2.5培養(yǎng)基中添加劑的選擇在培養(yǎng)基中加入不同的添加劑，培養(yǎng)條件同1.2.3，以起始培養(yǎng)基為空白在λ=450nm時(shí)測(cè)定濁度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。

1.2.6培養(yǎng)基中金屬離子的選擇在培養(yǎng)基中加入不同的金屬離子，選用L16(45)正交表，做正交實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件同1.2.3，以起始培養(yǎng)基為空白在λ=450nm時(shí)測(cè)定濁度，考察金屬離子種類和含量對(duì)菌生長(zhǎng)的影響。各因素水平見(jiàn)表3。

1.2.7生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將斜面保存的菌接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10h之后得種子培養(yǎng)液。接種5%的種子培養(yǎng)液到新的培養(yǎng)基中，將接種后的液體培養(yǎng)基分裝于試管中，每支試管5mL。在28℃、100r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每2h取樣1支，以起始培養(yǎng)基為空白在λ=450nm時(shí)測(cè)定吸光度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。

2結(jié)果與討論

2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

2.1.1蔗糖含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響蔗糖在右旋糖酐的制備過(guò)程中，是碳源也是底物。蔗糖作為碳源在腸膜明串珠菌20074的作用下產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶將作為底物的蔗糖轉(zhuǎn)化成右旋糖酐和果糖。蔗糖含量改變對(duì)培養(yǎng)液濁度和pH值影響見(jiàn)圖1。蔗糖含量為10%時(shí)，培養(yǎng)液中菌含量達(dá)到最大，pH值下降到最低，說(shuō)明此條件下中菌體生長(zhǎng)較好。蔗糖濃度太低可能是底物濃度不足，太高可能會(huì)抑制腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)，所以選擇蔗糖含量為10%。

2.1.2蛋白胨含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響蛋白胨由蛋白質(zhì)水解而制得，在細(xì)菌的培養(yǎng)中為菌體的生長(zhǎng)提供主要的氮源，是細(xì)菌培養(yǎng)基應(yīng)加入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蛋白胨含量改變對(duì)培養(yǎng)液濁度和pH值影響如圖2所示。當(dāng)?shù)鞍纂撕吭黾拥?.20%之后，培養(yǎng)液濁度和pH值隨蛋白胨含量的增加變化不大且蛋白胨的增加會(huì)增加培養(yǎng)成本。因此，選擇培養(yǎng)基蛋白胨含量為0.20%。

2.1.3Na2HPO4、KH2PO4含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Na2HPO4為菌的生長(zhǎng)提供磷和鈉，這2種元素對(duì)菌的生長(zhǎng)是必需的[6]，同時(shí)，Na2HPO4還能對(duì)培養(yǎng)液的pH值起到緩沖作用。培養(yǎng)基中Na2HPO4的濃度對(duì)培養(yǎng)液濁度和pH值的影響見(jiàn)圖3。雖然含量的增加使培養(yǎng)液濁度增加，但當(dāng)濃度大于0.20%后培養(yǎng)液濁度下降，說(shuō)明對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，所以選擇0.20%。K+也是菌體生長(zhǎng)必需的元素之一，培養(yǎng)基中KH2PO4的濃度對(duì)培養(yǎng)液濁度和pH值的影響見(jiàn)圖4。在本實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，KH2PO4含量為0.03%時(shí)，培養(yǎng)液濁度出現(xiàn)最大值，而且pH值增加速度開始變大，所以選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基中KH2PO4含量0.03%較為合適。

2.2無(wú)機(jī)氮源含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌的生長(zhǎng)所需要的氮源包括有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，常用的無(wú)機(jī)氮源有NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3等。在培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5、圖6和圖7。NH4Cl的加入使培養(yǎng)液的菌含量有所下降，所以不利于菌體的生長(zhǎng)，不應(yīng)作為培養(yǎng)基的組分加入，pH的下降可能是因?yàn)镹H4Cl的加入造成的。與NH4Cl相同，培養(yǎng)基中加入實(shí)驗(yàn)所選濃度的(NH4)2SO4同樣會(huì)使菌含量下降，而且pH值略有增加，對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。盡管一定濃度的NaNO3加入到培養(yǎng)基中使菌含量增加，但是與未加入時(shí)相比變化不大，說(shuō)明NaNO3對(duì)菌的生長(zhǎng)影響不大。

2.3添加劑對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌體生長(zhǎng)除了需要碳源、氮源以及一些無(wú)機(jī)鹽之外，一定量的添加劑可以為菌體生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)因子，強(qiáng)化菌體的生長(zhǎng)。常用的添加劑有番茄汁、玉米汁、牛肉浸膏、酵母浸膏等。實(shí)驗(yàn)選用牛肉浸膏和酵母浸膏作為添加劑，培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。當(dāng)加入一定量的牛肉浸膏到培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液的濁度增加不大，培養(yǎng)液的pH值變化也不大。所以，牛肉浸膏對(duì)腸膜明串珠菌生長(zhǎng)的作用不大。酵母浸膏富含維生素、氨基酸和一些其他營(yíng)養(yǎng)成分，可為菌體的生長(zhǎng)提供所需的生長(zhǎng)因子。酵母浸膏含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9，培養(yǎng)液的濁度OD值隨著酵母浸膏含量的增加而增加，培養(yǎng)液的pH值卻明顯下降?？梢?jiàn)，酵母浸膏的加入可明顯促進(jìn)腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中酵母浸膏含量大于0.5%時(shí)濁度增加速度和pH值下降速度明顯減慢，所以，選擇培養(yǎng)基中酵母浸膏的加入量為0.5%。

2.4金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

金屬離子對(duì)腸膜明串珠菌20074生長(zhǎng)影響的正交實(shí)驗(yàn)按L16(45)安排進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表4。培養(yǎng)基其他組成為：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.03%、酵母浸膏0.5%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Mn2+離子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響較大，在實(shí)驗(yàn)所選的范圍內(nèi)，其他金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響不大。

2.5菌體生長(zhǎng)曲線

在選擇的培養(yǎng)條件下，以培養(yǎng)液的OD值為指標(biāo)，測(cè)定了腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖10。0~8h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液濁度變化不大，即菌含量變化不大，為腸膜明串珠菌20074生長(zhǎng)的延遲期；8~24h內(nèi)菌含量隨培養(yǎng)時(shí)間迅速增加，是膜明串珠菌20074生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；24h之后，菌含量基本穩(wěn)定，菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期；30h開始，菌含量略有下降，菌的生長(zhǎng)達(dá)到衰亡期。在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，同時(shí)生成一系列生理酸性物質(zhì)，引起pH值下降。

3結(jié)論

對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各組分含量進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)組成為：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鉀0.03%。無(wú)機(jī)氮源NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3不能明顯加快腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)。添加劑酵母浸膏可明顯促進(jìn)腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)，加入量為0.5%。實(shí)驗(yàn)所選的范圍內(nèi)，金屬離子中Mn2+對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響較大。腸膜明串珠菌20074的生長(zhǎng)曲線表明，0~8h是生長(zhǎng)延遲期，8~24h為對(duì)數(shù)期，24~30h為穩(wěn)定期，30h之后為衰亡期。